Madame Lelica

structuur van ACLY met CoA onthult productieve en onproductieve COA conformaties

we produceerden recombinant ACLY, full-length in Escherichia coli voor al onze biochemische en structurele analyses (Extended Data Fig. 1 bis, b)., Differentiële scanning fluorimetrie van het enzym met verschillende cofactoren bevestigde de binding en potentiële structurele veranderingen geassocieerd met liganden toegevoegd alleen of in combinatie (uitgebreide gegevens Fig. 1c). We gebruikten deze gegevens om de structuurbepaling van ACLY met zijn co-substraten of co-producten te begeleiden.

We bereidden het recombinant eiwit en in eerste instantie uitgevoerd negatieve vlek single-particle analyse van het eiwit in de afwezigheid van metabolieten (ACLY-apo)., De tweedimensionale (2D) klasse gemiddelden van 3000 deeltjes bevestigd dat het eiwit vormde een tetramer (uitgebreide gegevens Fig. 2a, b). Om meer structurele details te krijgen, hebben we een cryo-EM studie uitgevoerd op het ACLY–citraat-CoA complex. Na meerdere optimalisatierondes van de cryo-EM monsters, bepaalden we de D2 symmetrische cryo-EM structuur van de acly–citraat-CoA structuur tot een gemiddelde totale resolutie van 3,0 Å. (Uitgebreide Gegevens Vijgen. 2c, d, 3 en 4 en Tabel 1).,

De ACLY–citraat-CoA-structuur vormt een homotetramer met een centrale tetrameric CSH-module en twee ASH domeinen op tegenovergestelde uiteinden van de CSH-module (protomers 1 & 2 en 3 & 4) (Fig. 1 bis, b). Het ASDOMEIN (residu ‘ s 1-806) heeft een structuur die sterk lijkt op de eerder gerapporteerde α/β-architectuur van het geïsoleerde n-terminaldomein gebonden aan citraat en ADP24., Het CSH domein (residu ‘ s 859-1101) bestaat uitsluitend uit helices en korte lussen, met structurele homologie aan een dimeer van citraatsynthase dimeren die bij ~90° hoeken kruisen (Extended Data Fig. 5a). De AS-en CSH-domeinen van elke polypeptideketen zijn verbonden door een grotendeels uitgebreid ~ 50-residu-spoelgebied met uitzondering van een korte α-helix tussen residuen 824 en 829. Het spiraalvormige gebied binnen deze linker is het enige punt van significant contact (door van der Waals interactie) tussen de twee ASDOMEINEN aan één kant van het molecuul., De uitgebreide linker staat CSH van één subeenheid toe om met het ASHDOMEIN van een andere subeenheid over de tegenovergestelde kant van de csh module in wisselwerking te staan. In tegenstelling tot de relatief geringe interacties tussen de ASPROTOMEREN vormen de csh-domeinen een uitgebreid netwerk van voornamelijk Van der Waals-interacties die zouden suggereren dat de csh-domeinen functioneren als een rigide tetramere module, terwijl de vier ASDOMEINEN flexibeler zijn. Dit komt overeen met de waargenomen schatting van de lokale em-resolutie op de EM-kaart die het hoogst is bij het CSH-domein (2,8 Å, uitgebreide gegevens Fig., 4c) en onze eerdere waarnemingen dat het CSH-domein een hogere smelttemperatuur heeft ten opzichte van de as van ~75 °C versus ~55 °C, respectievelijk 21.

CoA bindt op het raakvlak tussen de CSH-en ASH-domeinen van afzonderlijke subeenheden en lijkt de superdomeinen samen te ‘nieten’. De adeninebasis en ribosering interageren met het CSH-domein van één monomeer en de pantotheenarm en β-mercapto-groep die in de actieve plaats van het ASH-domein van een andere subeenheid plakken (Fig. 1c (links) en Fig. 1d (links))., Het modelleren van CoA is gebaseerd op de observatie dat de gefosforyleerde ADP groep goed opgelost is in de cryo-EM dichtheid. De mercapto-groep was echter niet goed opgelost, wat de flexibiliteit van deze regio suggereert. Hoewel verscheidene residuen van CSH en ASH domeinen van der Waals interacties met CoA veroorzaken, lijken waterstofbindingen van s574, R576 en S577 van het ASH domein en K964 van het CSH domein naar de ribose fosfaat oxygens een bijzonder belangrijke rol te spelen bij het nieten van CoA op de ASH–CSH interface., Interessant is dat E599 binnen waterstofbindende afstand tot het gemodelleerde zwavelatoom van CoA ligt, wat impliceert dat het een belangrijke katalytische rol kan spelen. Het belang van de eiwit–CoA-interacties van het ASH-en CSH-domein wordt ondersteund door de mutatiegevoeligheid van residuen R576 en K964, en de potentiële katalytische rol van E599 wordt ondersteund door zijn mutatiegevoeligheid voor A of Q, maar niet voor D (Fig. 1f). Hoewel citraat werd opgenomen in de steekproef voor cryo-EM reconstructie, kon het niet met vertrouwen worden opgelost in de cryo-EM kaart.,

gegeven de onopgeloste dichtheid voor de mercapto–groep van CoA, voerden we een andere reconstructie uit van de acly-citraat-CoA-structuur zonder D2-symmetrie op te leggen om te bepalen of CoA verschillende conformaties in verschillende protomeren zou kunnen aannemen. We konden een reconstructie voorbereiden zonder symmetrie op te leggen (C1, asymmetrisch gesloten) met een nominale resolutie van 3,5 Å. In deze asymmetrische gesloten structuur van ACLY–citraat-CoA-C1 is de resolutie rond het ASDOMEIN armer dan in de D2-structuur, maar de lokale resolutie rond het CSH-domein blijft relatief hoog, van 2,8 tot 3.2 Å., De analyse van deze acly–citraat-CoA-C1 asymmetrische gesloten structuur onthulde dat elk van de ASDOMEINEN, en drie van de vier domeinen van CSH en COA molecules, dezelfde configuratie als de structuur van D2 goedkeurden. Nochtans, keurt één van de molecules COA een alternatieve bouw goed waarin de phosphorylated ADP-groep ~8 Å naar de module CSH wordt verschoven en de pantothenic arm over wordt gebogen om met CSH in wisselwerking te staan (Fig. 1b, C (rechts) en Fig. 1e). De cryo-EM dichtheid die overeenkomt met deze alternatieve COA conformatie is zeer duidelijk (Fig. 1c (rechts))., Opmerkelijk is dat de cryo-EM-dichtheid ook wordt waargenomen voor een goed geordend watermolecuul, dat de waterstofverbindingsinteracties lijkt te overbruggen tussen het eindzwavelatoom van CoA en de zijketenresiduen van H900, D1026 en R1065 met bijkomende van der Waals-interacties uit 1969, 1973, H975 en R976 (Fig. 1d (rechts)). Gelijktijdig met deze alternatieve COA-conformatie verschuift een lus binnen het CSH-domein (residuen 965-986) en de flankerende helices om de alternatieve positie van de COA-adeninebasis te accommoderen (Fig. 1e)., Mutaties van h975, R976, D1026 en r1065 aan alanine vertonen allemaal gecompromitteerde activiteit, wat suggereert dat de binding van CoA aan het CSH-domein op de een of andere manier betrokken is bij enzymactiviteit (Fig. 1f). Gezien het feit dat CoA met citraat in het ASDOMEIN moet reageren, verwijzen we naar de COA-conformaties met de cysteamine van de pantotheenarm die naar de AS en CSH wijst als ‘productieve’ en ‘onproductieve’ COA-conformaties, respectievelijk gebonden aan ACLY.,

Structuur van de ACLY–citraat-CoA subpopulatie onthult asymmetrische AS oriëntaties

naast de grote ACLY–citraat-CoA deeltje van de bevolking, vertegenwoordigt 57% van de klasse 3 deeltjes, een subpopulatie van ACLY–citraat-CoA complex deeltjes vertegenwoordigen 23% van de subklasse van de deeltjes (10% in totaal) werd ook gevangen in een 3D-reconstructie, zonder dat symmetrie een resolutie van 4,3 Å (Extended Data Fig. 3)., Deze subpopulatie van deeltjes heeft een algemene structuur die aan de belangrijkste acly–citraat-COA bevolking behalve dat één van de vier ASDOMEINEN ~50° naar zijn dichtstbijzijnde as subeenheid wordt geroteerd om een meer ‘open’ bouw goed te keuren, zodat verwijzen wij naar het als ‘ACLY–citraat-COA-C1 asymm open’. In deze structuur is de dichtheid slechts zichtbaar voor de gefosforyleerde ADP-groep van twee COA-moleculen die aan twee van de symmetrische ASDOMEINEN worden gebonden (Fig. 2a, b). Een van de symmetrische en asymmetrische subeenheden vertoont geen bewijs voor COA-binding., Met name het asymmetrische ASDOMEIN lijkt onverenigbaar met productieve COA-binding (Fig. 2c). Wij stellen voor dat deze ACLY-citraat-COA-C1 asymm open structuur een middenstaat van ACLY vertegenwoordigt, waar twee actieve plaatsen voor katalyse worden voorbereid en twee niet zijn. De observatie van deze structuur suggereert ook dat de vier ACLY actieve sites onafhankelijk kunnen functioneren.

structuur van de acly-apo-status is ongunstig voor CoA-binding

gezien de beperkte interacties tussen de CSH-en ASH-domeinen, vroegen we naar de structuur van ACLY in de afwezigheid van gebonden liganden. Om dit te doen, bepaalden we de cryo-EM structuur van ACLY in de apo vorm, die we in staat waren om op te lossen tot 4.3-Å resolutie (Extended Data Fig. 4a en Tabel 1)., Een vergelijking van de acly-apo–en ACLY-citraat-CoA-structuren laat zien dat in de apo-toestand elk van de ASPAREN op tegenoverliggende uiteinden van het tetrameer met ~10° naar elkaar toe geroteerd wordt om een meer open acly-tetrameer te vormen en de ASDOMEINEN te plaatsen in posities die de productieve COA-binding lijken te schaden (Fig. 3). Specifiek, ASH loops gecentreerd op F533, S574 en K1018 (van het aangrenzende CSH domein) zou botsen met CoA als gebonden in de ACLY–citraat-CoA structuur (Fig. 3b)., Bovendien verplaatsen de twee residuen die zich binnen de waterstofbindingsafstand tot CoA van het ASDOMEIN bevinden, R576 en E599, zich uit de waterstofbindingsafstand in de ACLY-apo-structuur (Fig. 3c). Ondertussen blijft de csh module grotendeels onveranderd tussen de twee structuren. Samen, onthult een vergelijking van de structuren ACLY-apo en ACLY–citraat-CoA dat de structuur ACLY-apo moet herschikken om het substraat van CoA aan te passen.

ACLY-acetyl-CoA-OAA complex onthult COA-citraat lyase reactie optreedt in het ASH domein

differentiële scanning fluorimetrie gegevens toonden aan dat zowel de acetyl-CoA en OAA producten gestabiliseerd het ACLY eiwit (Extended Data Fig. 1c)., Deze bevinding gaf aan dat we het ACLY–OAA–acetyl-CoA productcomplex konden vangen, en zo het reactiemechanisme beter konden begrijpen. Hiertoe bepaalden we de cryo-EM structuur van het complex, die we oplosten tot 3.1-Å resolutie met behulp van D2 symmetrie (Extended Data Fig. 4). De totale structuur van het ACLY-co-productcomplex was het meest vergelijkbaar met het symmetrische ACLY-co-substraat (ACLY–citraat-CoA-D2) complex, met een totale wortelgemiddelde-kwadraatdeviatie (r.M.s.d.) van 0,407 Å voor Ca-atomen (Fig. 4a)., We vonden dat acetyl-CoA op dezelfde bindingsplaats zat als CoA en ook gestabiliseerd werd door dezelfde basisresiduen, R576 en K964 (Fig. 4b). Daarnaast waren we in staat om ondubbelzinnig twee OAA moleculen te modelleren die gebonden zijn aan elke ACLY subeenheid (Fig. 4 ter, c). Eén OAA-molecuul (OAA1) overlapt met de citraatbindende zak binnen het ASDOMEIN en proximaal aan de acetylgroep van acetyl-CoA. OAA1 maakt vrij bescheiden interactie met de proteã ne, met inbegrip van waterstofbindingen aan N346 en T348 en van der Waals interactie met F547., De andere molecule van OAA (OAA2) is gebonden aan het domein van CSH en maakt uitgebreidere interactie met ACLY dan OAA1. OAA2 verbindt de csh module door waterstofbindingen met H900, D1026, R1065 en R1085 en door Van der Waals interacties met F935 en F1061 van de ene subeenheid, evenals door een waterstofbindingen met R1065 van een andere subeenheid( Fig. 4c). OAA2 overlapt goed met gebonden OAA in varkenshart citraatsynthase25 (uitgebreide gegevens Fig. 5b).

we verfijnden ook de cryo-EM kaart van de acly–OAA–acetyl-CoA structuur zonder symmetriebeperkingen en verkregen een identieke structuur met D2 symmetrie, behalve dat een van de vier acetyl-CoA moleculen twee mogelijke conformaties vertoonde van de pantotheenarm van acetyl-CoA, een met de cysteamine van COA naar het ash domein, zoals in de andere drie protomeren, en de andere naar het csh domein (Extended data Fig. 6 bis)., Nochtans, in tegenstelling tot de alternatieve bouw van COA die in de acly–citraat-COA structuur wordt gevonden, veranderde de positie van de phosphorylated ADP groep niet in deze twee conformations. De mogelijke alternatieve conformatie van acetyl-CoA kan wijzen op een mogelijke substraatafgifteroute in enzymomzetting of een autoinhibitorische toestand van het enzym (hieronder besproken).

de observatie van de oaa1-en acetylcoa-producten in het ASDOMEIN suggereerde sterk dat de lyase-chemie daar wordt uitgevoerd, in tegenstelling tot eerdere voorstellen dat deze chemie in het CSH-domein wordt uitgevoerd 22,23., Wij speculeren dat OAA2 kan functioneren om het CSH domein te helpen organiseren voor samenwerking met het ASH domein en / of als een tweede OAA product autoinhibitory site die de pantotheenarm van acetyl-CoA (of de cysteamine van CoA) zou kunnen afzonderen om over het CSH domein te zitten, zodanig dat de elkaar uitsluitende binding van CoA in een productieve conformatie wordt geremd bij hoge cellulaire OAA concentraties (Extended Data Fig. 6 bis)., Interessant, terwijl de productieve uitgebreide COA oriëntatie met de cysteamine wijzend naar het ASH domein niet kan worden gemodelleerd in ACLY-apo zonder significante sterische botsing (Fig. 2b), de omgekeerde oriëntatie met de cysteamine wijzend naar het CSH domein kan (uitgebreide gegevens Fig. 6b). Dit is consistent met onze bevindingen dat CoA aan ACLY in afwezigheid van citraat en/of ATP kan binden (getoonde gegevens niet), maar wij stellen een gebogen bouw voor, zoals waargenomen in één van de PROTOMEREN van ACLY–citraat-CoA-C1 (Fig. 1c (rechts) en Fig., 1d (rechts)) en ook de geïsoleerde structuur van het CSH domain22.

in overeenstemming met de hypothese dat OAA2 kan dienen als een ACLY autoinhibitory site, toonde een eerdere studie aan dat OAA in staat is ACLY bij ratten lever te remmen op een manier die niet competitief is met citraat 26. Om de functionele betekenis van de twee OAA–plaatsen te valideren die in de acly–OAA-acetyl-CoA structuur worden waargenomen, gebruikten wij een het dovenexperiment van de steady-state fluorescentie., Als controle-experiment, titreerden wij eerst citraat in ACLY in afwezigheid of aanwezigheid van een verzadigende concentratie van CoA en konden de gegevens aan één citraat bindende plaats met KD waarden van 3,4 ± 0,5 µM en 1,4 ± 0,3 µM in afwezigheid of aanwezigheid van CoA, met goede R2 waarden van respectievelijk 0,92 en 0,84 passen (Fig. 4d). Dit is consistent met de één plaats van de citraatbinding die in de acly-asdomein kristalstructuur wordt waargenomen die aan citrate13 wordt gebonden en de kristalstructuur van intact acly die aan CoA en citrate22 wordt gebonden, die toont dat COA citraat stabiliseert die in het acly-ASDOMEIN22 wordt gebonden., We vervolgens getitreerd OAA in ACLY en vonden dat de gegevens passen aanzienlijk beter om een twee-site model (R2 = 0,99) dan een een-site model (R2 = 0,93) (Fig. 4e). Het twee-plaats bindingsmodel paste beter de bifasische fluorescentiedaling toe die bij hogere OAA concentraties duidelijk wordt en tot een hoog-affiniteit OAA bindende plaats (Kd = 15 ± 4 µM) leidt die één derde van de totale fluorescentieverandering en een laag-affiniteit OAA bindende plaats (KD = 1.300 ± 500 µM) die de resterende twee derde van de totale fluorescentieverandering (Fig. 4e)., Deze gegevens zijn consistent met de functionele relevantie van de twee OAA–bindingsplaatsen waargenomen in de acly–OAA-acetyl-CoA-structuur.

ACLY-E599 is in staat om te functioneren als een belangrijk katalytisch residu

De ACLY-co-productstructuur stelde ons in staat om een al lang bestaande vraag over het acly moleculaire mechanisme te beantwoorden. ACLY wordt voorgesteld om het citryl-CoA-tussenproduct te splitsen met behulp van een algemene base om een proton uit het citraatsubstraat te extraheren en/of een algemeen zuur om de OAA-verlaat groep te reprotoneren16,27,28., Dit komt overeen met een pH-snelheidsprofielanalyse van ACLY met een pKa van ~8,5 (Fig. 5a). We veronderstellen dat de evolutionair geconserveerde E599 gepositioneerd is om een belangrijke katalytische rol te spelen, als algemene base en/of zuur, en / of voor het stabiliseren van het fosfo-citryl-CoA intermediair (zie volgende paragraaf en Fig. 4b). Een relatief hoge pKa voor een begraven glutamaat residu is eerder opgemerkt 29. In overeenstemming met een belangrijke katalytische rol voor E599, vonden we dat de e599a en e599q mutanten hebben aanzienlijk gecompromitteerde activiteit (Fig. 1f), hoewel de cofactor binding niet werd beïnvloed (Fig. 5b)., In tegenstelling, vonden we dat een soortgelijke zure e599d mutant vertoonde soortgelijke activiteit als WT ACLY (Fig. 1f), met een vergelijkbaar pH-snelheidsprofiel (Fig. 5a). Samen pleiten de gegevens voor het belang van E599 voor de katalyse door ACLY.

ACLY catalysis verloopt via een fosfo-citryl-CoA-intermediair in het ASH-domein

de identificatie van E599 als een belangrijk katalytisch residu voor de splitsing van het citryl-CoA-adduct tot acetyl-CoA-en OAA-producten bood ons de mogelijkheid om een reactie-intermediair op te vangen van een acly-e599q-Mutant in aanwezigheid van de ATP -, citraat-en COA-Co-substraten., Wij mengden daarom de acly-e599q-mutant met verzadigende concentraties van ATP, citraat en CoA (ACLY-E599Q-ATP-citraat-CoA) en bepaalden zijn cryo-EM-structuur, die wij aan een algemene resolutie van 2.85 Å konden oplossen. De structuur werd bepaald door het opleggen van D2–symmetrie en onthulde dat de AS-en CSH–domeinen van ACLY op dezelfde manier waren gerangschikt als het acly–citraat-CoA-product en ACLY-OAA-acetyl-CoA-structuren met r.M.s.d. – waarden voor Ca-atomen van respectievelijk 0,584 en 0,620 Å., Nochtans, in tegenstelling tot deze andere substraat en productcomplexen, onthulde het complex ACLY-E599Q–ATP-citraat-CoA opmerkelijk goed gedefinieerde cryo-EM dichtheid in de actieve plaats van het ASHDOMEIN, die als ADP (gehydrolyseerd ATP) en een phospho-citryl-CoA tussenpersoon (Fig. 6 bis, b). Ook, in tegenstelling tot elk van de andere acly structuren die in deze studie worden gerapporteerd, is de aminozuur 752-767 lijn die het H760-residu herbergt, dat is getoond om fosfaatoverdracht van ATP aan citraat te bemiddelen, goed geordend in de acly–E599Q-ATP-citraat-CoA structuur (Fig. 6c)., Bovendien wordt een magnesiumion of watermolecuul, ook voorgesteld om H760 te stabiliseren, waargenomen gebonden te zijn aan E599 en de fosfaatgroep (Fig. 6c). Deze observatie stelt voor dat het his760-residu, de fosfaatgroep en het magnesiumion kunnen samenwerken om citraat voor ligatie aan CoA in de actieve plaats van het ASDOMEIN te stabiliseren. Bovendien ondersteunt het feit dat de acetyl-CoA-en OAA-producten niet in deze structuur worden waargenomen, onze conclusie dat E599 een belangrijke katalytische rol speelt bij de splitsing van het fosfo-citryl-CoA-tussenproduct tot de acetyl-CoA-en OAA-producten binnen het ASH-domein.,