materialen en methoden
Muizen.
Wild – type c57bl / 6 muizen werden verkregen uit Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Pde8a KO muizen werden oorspronkelijk geproduceerd door Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) op contract met Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Verenigd Koninkrijk). Ze werden vervolgens gefokt tot c57bl / 6 muizen aan de Universiteit van Washington voor 10 generaties. Voor de gerapporteerde experimenten werden op leeftijd afgestemde muizen tussen 6 en 8 weken oud gebruikt., Alle gebruikte procedures werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Washington, in overeenstemming met de National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
Real-Time PCR.
Testis cDNA werd bereid uit totaal RNA van wild-type en pde8a-null muistest door gebruik te maken van SuperScript III en Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Real-Time PCR werd uitgevoerd met behulp van Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Primers (IDT, Coralville, IA) voor PDE8A, gericht op het gebied stroomafwaarts van de richtcassette, waren als volgt: forward primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); reverse primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). De primers voor hypoxanthine-guanine fosforibosyltransferase waren als volgt: forward primer ATTATGCCGAGGATTTGGAA; reverse primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
in Situ hybridisatie.
de template voor riboprobe-synthese werd verkregen door PCR met behulp van een plasmide dat de muis pde8a-sequentie bevat., In het bijzonder werd het 3 ‘ – gebied van muis PDE8A (exons 17-20) versterkt door gebruik te maken van de volgende primers: forward primer, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (onderstreepte T3 phage RNA polymerase promotor sequence); reverse primer, TAATACGACTCACTATAGGGCACGTCGGCACACTTAAT (onderstreepte T7 phage RNA polymerase promotor sequence). De PCR-producten werden geïsoleerd uit agarose gels en gezuiverd met een Gelextractiekit (Qiagen, Valencia, CA)., 35S-gelabelde riboprobes werden gesynthetiseerd door in vitro transcriptie met een maxiscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX) door als sjabloon het PCR product te gebruiken dat T3 en T7 phage RNA polymerase promotor sites bevat. In vitro transcriptie werd uitgevoerd in een reactiemengsel van 20 µl met 5 µl UTP (PerkinElmer, Boston, MA) en de T3 RNA-polymerase of de T7 RNA-polymerase om respectievelijk de sense-of antisense-riboprobe te verkrijgen.
Testes werden ontleed van wild-type en PDE8A KO muizen en werden snel ingevroren in Weefsel-Tek O. C. T. verbinding (Sakura, Torrence, CA) op droogijs., Secties (20 µm) werden gesneden in een cryostaat, gemonteerd op een Superfrost plus microslide (VWR Scientific, West Chester, PA), en aan de lucht gedroogd. De secties werden gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in 4% paraformaldehyde gefixeerd, gedurende 10 minuten behandeld met 0,25% azijnzuuranhydride in 0,1 M triethanolamine (pH 8,0) en gedehydreerd door een gesorteerde ethanolreeks (30, 60, 80, 95 en 100%). De secties werden vervolgens geïncubeerd met hybridisatiebuffer in een vochtige kamer bij 60°C gedurende 4 uur. na het spoelen in 2× SSC (standaard zoutcitraat; 1× SSC = 0,15 m natriumchloride/0,015 m natriumcitraat, pH 7.,2), werden de secties gedehydrateerd door een gesorteerde ethanolreeks. Hybridisatie werd uitgevoerd in buffer met 35S-gelabelde antisense of sense sonde (40 pg / 34.000-38.000 cpm per µl) onder plastic coverslips in een vochtige kamer bij 60°C ‘ s nachts. De dekglips werden voorzichtig verwijderd en de secties werden gewassen met 2 × SSC met 10 mM DTT gedurende 30 min tweemaal bij 60°C. De secties werden vervolgens geïncubeerd gedurende 30 min bij 37°C met 20 µg / ml RNaseA in 0,5 M NaCl, 10 mM Tris * HCl (pH 7.,5), en 1 mm EDTA, vervolgens gewassen in 50% formamide, 2× SSC met 10 mM DTT gedurende 30 min bij 60°C, in 1× SSC met 10 mM DTT gedurende 30 min bij 60°C, en verder in 0,1× SSC met 10 mM DTT gedurende 30 min bij 60°C. Ten slotte werden de secties gedehydrateerd in ethanol (70, 95 en 100%), aan de lucht gedroogd en blootgesteld aan BioMax xar film (Eastman Kodak, Rochester, NY) gedurende 9 uur. pde8a mRNA hybridisatie, werden de objectglaasjes bedekt met autoradiografie NTB emulsie (Eastman Kodak) en gedurende 1 week blootgesteld bij 4°C., De dia ‘ s werden ontwikkeld, gefixeerd en met hematoxyline tegengewerkt en gemonteerd in Canada balsem (Sigma-Aldrich).
Pde8a Immunoprecipitatie en Assay.
Muissperma werd geïsoleerd uit de cauda-epididymis met een swim-out-methode (38) en gehomogeniseerd in PBS met 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-aminobenzamidine en een mengsel van Sigma-proteaseremmers (Sigma-Aldrich)., Het homogenaat werd gedurende 5 minuten gecentrifugeerd bij 16.000 × g in een microcentrifuge en 200-µl aliquots van het supernatant, gelijk aan 106 sperma, werden ‘ s nachts geïncubeerd met 20 µl van een 1: 1 slurry van eiwit g-agarose parels (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) in aanwezigheid of afwezigheid van pde8a antilichaam (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). De volgende dag, werd immunoprecipitaat gewassen drie keer met PBS en dan geanalyseerd voor PDE-activiteit in aanwezigheid van 10 nM cAMP substraat, 40 mM Mops (pH 7.5), 15 mM Mg-acetaat, 2 mM EGTA, en 0,2 mg/ml BSA zoals in ref. 39.,
Immunohistotochemie.
vers ingevroren muistestes werden ingebed in een Weefsel-Tek O. C. T.-verbinding en vervolgens op een cryostaat verdeeld bij 20 µm per slice. Weefselsecties of geïsoleerde Leydig-cellen werden gedurende 10 minuten gedroogd en gefixeerd in 4% (wt/vol) paraformaldehyde/PBS (pH 7,4) bij kamertemperatuur en driemaal gewassen met PBS. De objectglaasjes werden vooraf geïncubeerd met blokkerende buffer (5% donkey serum, 1 mg/ml BSA en 0.,1% Triton X-100 in PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, geïncubeerd met een anti-pde8a-antilichaam (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) in PBS met 1% donkey serum, 1 mg/ml BSA, en 0,1% Triton X-100 overnachting bij 4°C, gewassen in PBS met 0,05% Tween 20 driemaal gedurende 20 minuten, geïncubeerd met donkey anti-goat Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) in PBS met 1 mg/ml BSA en 0,1% Triton X-100 gedurende 2 uur bij kamertemperatuur en gewassen., De objectglaasjes werden verder geïncubeerd met blokkerende buffer met 5% geitenserum gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, geïncubeerd met cytochroom P450 side chain cleavage enzyme (CYP11A) antilichaam (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) ‘ s nachts bij 4°C, gewassen in PBS met 0,05% Tween 20 driemaal gedurende 20 min, en geïncubeerd met geit anti-konijn Alexa488 (1:500; Invitrogen) zoals hierboven. De secties werden uiteindelijk tegenbehandeld Met to-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) in PBS gedurende 5 minuten, gewassen en gemonteerd in SlowFade Gold antifade reagens (Invitrogen)., Om de pde8a-antilichaamspecificiteit te testen, werd de antilichaamoplossing 2 uur lang bij kamertemperatuur voorgeïncubeerd met 2,5 µg/ml antigeenpeptide (Santa Cruz Biotechnology) alvorens te kleuren. Sommige secties werden geïncubeerd zonder de primaire antilichamen om achtergrond te bepalen toe te schrijven aan de secundaire antilichamen. De immunostaining signalen werden gevisualiseerd met een confocale microscoop (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). β-galactosidase activiteit, uitgedrukt met een nucleair lokalisatie signaal door het LacZ gen in de doel cassette, werd bepaald door X-gal kleuring., De secties werden eerst geïncubeerd met anti-CYP11A antilichaam gevolgd door anti-konijn alkalische fosfatase conjugaat (1:500; Invitrogen) en NBT/BCIP (Roche) voor kleurontwikkeling. X-gal kleuring werd vervolgens uitgevoerd zoals beschreven (40) in het X-gal mengsel bij 37°C ‘ s nachts. De secties werden gewassen en gemonteerd met glycerol/Tris-gebufferde zoutoplossing.
Leydig-Celreiniging.
Leydig-cellen werden geïsoleerd zoals beschreven in ref. 41. Kort, testes van volwassen muizen werden onthoofd en gedispergeerd in een schudwaterbad bij 34°C gedurende 10 min in 10 ml Medium 199 (m-199) met 0.,25 mg / ml collagenase D, 35 ME / ml Dispase II en 6 µg/ml DNase I. Om de weefseldispersie te beëindigen, werd 40 ml van 1% BSA toegevoegd in m-199 media met 15 mM Hepes, 4 mM natriumbicarbonaat en 25 µg/ml soja-trypsine-remmer om de oorspronkelijke suspensie te verdunnen. Buizen werden vervolgens afgedekt en meerdere keren omgekeerd. Seminiferous tubuli werden toegestaan om zich te vestigen door de zwaartekracht, en het supernatant met de interstitiële cellen werd verzameld. De procedure werd twee keer herhaald om interstitiële cellen verder te oogsten., De cellen werden gepelleteerd in 50 ml tubes door centrifugeren bij 800 × g gedurende 20 minuten bij 4°C en vervolgens gefractioneerd met een continue Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) gradiënt (55% Percoll in HBSS gebufferd met 15 mM Hepes en 25 µg/ml soja trypsine remmer) in een totaal volume van 35 ml. De gradiënten werden in situ gevormd door centrifugeren in een JA-20 vaste hoekrotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) bij 23.700 × g gedurende 30 min bij 4°C. Een buis met density marker beads (GE Healthcare) werd gebruikt als referentie om de verschillende densiteit lagen te identificeren., Leydig-cellen werden teruggevonden vanaf een dichtheid van 1,07 g / ml tot aan de onderkant van de gradiënt. Vijf volumes van BBSS werden toegevoegd om de Percoll te verdunnen, en de cellen werden gepelleteerd bij 200 × g gedurende 10 min bij 4°C. De uiteindelijke pellet verkregen uit twee testes, verrijkt in Leydig cellen, werd geresuspendeerd in 4 ml DMEM / F-12 aangevuld met 1% BSA en onmiddellijk gebruikt voor de experimenten.
3β-Hydoxysteroïde Dehydrogenasebepaling.
meting van de testosteronproductie.
Leydig-cellen werden geresuspendeerd zoals hierboven beschreven en 100-µl aliquots werden toegediend in 96-wells-platen., Cellen werden gestimuleerd in het uiteindelijke volume van 150 µl met de aangegeven concentraties recombinant LH gedurende 3 uur in een 5% CO2 incubator bij 37°C. Recombinant humaan LH werd verkregen uit het nationale hormoon & Peptide programma (A. F. Parlow, Torrance, CA). Het testosteron dat in de media van dubbele celsteekproeven voor elke LH-concentratie wordt vrijgegeven werd gemeten door een immunoenzymatic assayuitrusting van Neogen (Lexington, KY) te gebruiken.
alle gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD., De EC50-waarden voor LH-werking op de productie van testosteron werden berekend door niet-lineaire aanpassing van de LH-concentratieafhankelijkheidscurves die voor elke Leydig-celbereiding werden verkregen met behulp van een softwarepakket (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Statistische analyse werd uitgevoerd door Student ‘ S T test. Verschillen werden als significant beschouwd bij P < 0,05.