over Ligase:
een ligase is een enzym dat een nieuwe chemische binding kan vormen om de fusie van twee grote moleculen te katalyseren door middel van een begeleidende hydrolyse van een kleine hanger chemische groep. Ligases gebruiken ATP om de banden te vormen, en wordt gebruikt in het recombinante klonen van DNA, die zich bij twee bijkomende fragmenten van nucleic zuur aansluiten.
Ligasefunctie
DNA-ligasenzymen dragen het EC-nummer 6.5.1.1 (CAS-nummer 9015-85-4) en worden gebruikt voor het verbinden van twee DNA-strengen door het repareren van enkelvoudige strengenbreuken om fosfodiësterbindingen te katalyseren., De relatie treedt op tussen het 5 ‘fosfaat uiteinde van het donornucleotide en de 3′ hydroxyl uiteinden van het acceptornucleotide.het vierstapsproces, waarvoor AMP nodig is, omvat: de reorganisatie van de activiteit in DNA-segmenten of Okazaki-fragmenten, adenyltatie van een lysineresidu aan het actieve centrum van het enzym om het pyrofosfaat vrij te geven, overdracht van AMP aan het 5′ fosfaat einde van het donornucleotide om een pyrofosfaat einde te vormen, vorming van de fosfodiësterbinding tussen het donornucleotide en het 3’ hydroxyl van de acceptor.,
Ligase interacties
gecodeerd door het lig-gen, wint de E. coli DNA-ligase energie door het nicotinamide-adenine-dinucleotide (NAD) te splitsen om een fosfodiësterbinding te genereren, maar kan RNA niet verbinden met DNA. De polymeraseconcentraten van DNA kunnen worden gebruikt om de activiteit van de ligase van E. coli DNA te verhogen maar de concentraten moeten kleiner zijn dan de te ligeren fragmenten.
Het escherichiavirus T4 wordt hoofdzakelijk gebruikt in laboratoriumonderzoek, en kan aan of de samenhangende of de botte einden van oligonucleotides naast zowel RNA als RNA-DNA-hybriden worden ligated., Nochtans, sluit het zich niet aan single-stranded nucleic zuur of nad gebruiken. T4 is gebaseerd op een ATP-cofactor en heeft een optimale temperatuur van 16 °C.
Ligasemechanisme
Het thermostabiele enzym is afgeleid van de thermofiele bacterie en activeert bij veel hogere temperaturen dan andere DNA-ligasen, onderstreept door halfwaardetijden van meer dan 1 uur bij 95 °C en 48 uur bij 65 °C. Het maakt een hoge hybridisatiestringentie en ligatiespecificiteit mogelijk, met een activiteit gedurende 500 thermische cycli.