Madame Lelica

het SSF-concept

Het idee om de enzymatische hydrolyse en fermentatie gelijktijdig uit te voeren werd door Gauss et al. in een patent uit 1976 ., De auteurs stelden dat de glucoseopbrengst in een traditionele afzonderlijke enzymatische hydrolyse (met behulp van enzymen geproduceerd door de schimmel Trichoderma reesei) laag was, waarschijnlijk als gevolg van remming van de hydrolyse door glucose en cellobiose. De auteurs konden echter aantonen dat zij een hogere totale ethanolopbrengst verkregen bij het gebruik van SSF, die zij toeschrijven aan de verwijdering van glucose en cellobiose door de fermentatie, en de daaruit voortvloeiende afgifte van remming van het eindproduct., De term SSF (de afkorting SSF wordt ook vaak gebruikt voor fermentatie in vaste toestand) werd in die tijd niet gebruikt door de auteurs, maar werd de Algemene notatie voor dit proces binnen enkele jaren na de oorspronkelijke uitvinding. Het vermijden van eindproductremming is waarschijnlijk nog steeds de belangrijkste reden voor het gebruik van SSF, maar er zijn verscheidene extra potentiële voordelen. Gauss en collega ‘ s vermeldden bijvoorbeeld het voordeel dat glucose na een afzonderlijke enzymatische hydrolysestap niet van de ligninefractie hoeft te worden gescheiden, waardoor een mogelijk verlies aan suiker wordt vermeden., Bovendien vermindert de combinatie van hydrolyse en fermentatie het aantal benodigde vaten en daarmee de investeringskosten. De daling van de kapitaalinvesteringen wordt geschat op meer dan 20%. Dit is van groot belang, aangezien de kapitaalkosten naar verwachting vergelijkbaar zullen zijn met de grondstofkosten bij de productie van ethanol uit lignocellulose . Andere voordelen met betrekking tot co-consumptie van pentose-en hexosesuikers en ontgifting zijn recenter gebleken, zoals later in dit overzicht zal worden besproken.,

onvermijdelijk zijn er ook nadelen van SSF in vergelijking met het afzonderlijke hydrolyse-en fermentatieproces (SHF). De optimale temperatuur voor enzymatische hydrolyse is meestal hoger dan die van fermentatie – tenminste wanneer gist als fermenterend organisme wordt gebruikt. In een SHF-proces kan de temperatuur voor de enzymatische hydrolyse onafhankelijk van de fermentatietemperatuur worden geoptimaliseerd, terwijl in een SSF-proces een compromis moet worden gevonden. Bovendien kan de gist niet worden hergebruikt in een SSF-proces vanwege de problemen bij het scheiden van de gist van de lignine na de gisting., Daarom vertegenwoordigt de gist noodzakelijkerwijs een opbrengstverlies in een SSF-proces, als de gist wordt geproduceerd uit koolhydraten binnen het proces (zie Figuur 1) of een bedrijfskosten als het extern wordt geleverd. De enzymen zijn even moeilijk te hergebruiken, ook in een SHF-proces. De enzymen worden ofwel geproduceerd in het proces (zie Figuur 1) – waardoor een verlies van substraat wordt weergegeven-of worden extern geleverd en dragen daardoor bij aan de chemische kosten., De recirculatie van enzymen is eveneens moeilijk aangezien de enzymen aan het substraat binden, hoewel een gedeeltelijke desorptie na toevoeging van oppervlakteactieve stoffen kan worden verkregen .

de beschikbaarheid van lignocellulose grondstoffen varieert afhankelijk van de geografische locatie (Zie bijv., Kim en Dale), en de lignocellulosegrondstoffen zijn nogal heterogeen wat betreft structuur en chemische samenstelling (zie Tabel 1). Deze heterogeniteit heeft een sterke invloed op het procesontwerp en heeft invloed op vrijwel alle processtappen, d.w.z. de mechanische verwerking van het materiaal, de voorbehandelingsomstandigheden, de keuze van enzymen en giststammen, evenals de scheiding en eigenschappen van de resterende lignine. Dit zal duidelijk worden in de onderstaande discussie.,

voorbehandeling

Het doel van de voorbehandeling is de lignocellulosestructuur te veranderen en de snelheid van enzymatische hydrolyse van voornamelijk de cellulose. Dit moet gebeuren met een minimale vorming van verbindingen, die de fermenterende micro-organismen remmen . Het toegankelijke oppervlak wordt beschouwd als een van de belangrijkste factoren die van invloed zijn op de effectiviteit van enzymatische cellulose afbraak ., In inheems hout is slechts een klein deel van de celwand capillairen toegankelijk voor de enzymen . De voorbehandeling vergroot echter het beschikbare oppervlak op verschillende manieren : I) Er worden scherven en scheuren gevormd die een groter oppervlak opleveren , ii) de hemicellulosefractie wordt gehydrolyseerd , waardoor de afscherming wordt verminderd, iii) de lignine ondergaat ook structurele veranderingen en het hout wordt in verschillende mate, afhankelijk van de voorbehandelingstechniek, gedecoreerd . Zo kan de afscherming van microvezels en het afsluiten van poriën, veroorzaakt door lignine, worden verwijderd., Andere factoren, waarvan wordt aangenomen dat ze de verteerbaarheid in SSF beïnvloeden, zijn de kristalliniteit van het substraat en de mate van polymerisatie (DP) .

De voorbehandelingsmethoden kunnen worden onderverdeeld in fysische en chemische methoden, en combinaties van deze twee worden vaak gebruikt (zie bijvoorbeeld het overzicht geschreven door Mosier et al. ). Het type grondstof heeft een sterke invloed op de keuze van de voorbehandelingsmethode. Hemicellulose wordt bijvoorbeeld in hoge mate geacetyleerd in xylaanrijke materialen., Aangezien acetaat tijdens hydrolyse vrijkomt, is de voorbehandeling van deze materialen tot op zekere hoogte autocatalytisch en vereist minder toegevoegd zuur en mildere procesvoorwaarden. Het vrijgekomen acetaat draagt echter bij aan de toxiciteit van de hemicellulosehydrolysaten.de voorbehandeling van Ammonia fiber / freeze explosion (AFEX) wordt beschouwd als een aantrekkelijke methode voor de voorbehandeling van landbouwresiduen, die zeer verteerbare cellulose opleveren . AFEX depolymeriseert de lignine, verwijdert de hemicellulose en decristalliseert de cellulose ., De gematigde temperatuur en pH minimaliseren ook de vorming van suikerdegradatieproducten. De methode lijdt echter aan hoge kosten van ammoniak en ammoniakterugwinning . In dit verband moet ook de kalkmethode op basis van calcium (of natrium) hydroxide worden vermeld. Alkalivoorbereidingen worden bij lagere temperaturen uitgevoerd gedurende lange verblijfstijden, en wat de AFEX-methode betreft, wordt een delignificatie van de biomassa verkregen.

Stoomexplosie is een intensief bestudeerde voorbehandelingsmethode ., De effecten van niet – gekatalyseerde stoomexplosie – en vloeistofvoorbereidingen met warm water-op de biomassa worden in de eerste plaats toegeschreven aan het verwijderen van hemicellulosen. Door toevoeging van een zuurkatalysator kan de hydrolyse verder worden verbeterd . Verdunde zuurvoorbehandelingen met behulp van H2SO4 of SO2 zijn de meest onderzochte voorbehandelingsmethoden vanwege hun effectiviteit en inefficiëntie. Deze methoden zijn toegepast in proefinstallaties en staan dus dicht bij de commercialisering . Zuur gekatalyseerde behandeling verbetert de hemicellulose verwijdering, geeft een gedeeltelijke hydrolyse van cellulose en verandert de lignine structuur ., De belangrijkste nadelen zijn gerelateerd aan de eisen van de procesapparatuur en de vorming van inhibitors . Tot nu toe zijn succesvolle voorbehandelingen met alkali -, AFEX-en vloeibaar warm water beperkt gebleven tot landbouwresiduen en kruidachtige gewassen , terwijl de voorbehandelingen met zuurkatalyseerde stoom een hoge suikeropbrengst hebben gegenereerd uit deze materialen en uit zachthoutgrondstoffen .

een eenvoudige kwantificering van de hardheid van een stoomvoorbehandelingsproces is de zogenaamde Ernstfactor, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Voor zuur gekatalyseerde voorbehandelingen wordt de gecombineerde Ernstfactor, log(CS), ergens gebruikt. Hierbij wordt ook rekening gehouden met de pH, log(CS) = log(R0) – pH, en typische waarden voor zuur gekatalyseerde stoomexplosie voorbehandeling van zachthout liggen tussen 2 en 4 .

optimale voorbehandelingsomstandigheden in een SSF-proces verschillen niet noodzakelijk veel van die van een SHF-proces waarbij lignocellulose biomassa wordt gebruikt. Nochtans, worden verscheidene samenstellingen huidig in hydrolysaten van de voorbehandeling, die enzymatische hydrolyse remmen door de fermenterende organismen omgezet., Dit is een waarschijnlijke verklaring achter de hogere gerapporteerde ethanolrendementen in SSF in vergelijking met SHF . De vorming van inhibitors na de voorbehandeling kan daarom in een SSF-proces in hogere mate worden verdragen. Remmende verbindingen kunnen in drie belangrijke groepen worden geplaatst; furaldehydes, zwakke zuren en fenolen. De twee meest voorkomende furaldehyden, HMF (5-hydroxymethyl-2-furaldehyde) en furfural (2-furaldehyde), worden onder zware omstandigheden gevormd uit respectievelijk hexoses en pentoses ., Zwakke zuren uit lignocellulose-materialen, zoals azijnzuur, mierenzuur en levulinezuur, worden voornamelijk gevormd door de-acetylering van hemicellulose of HMF-afbraak . Fenolverbindingen worden voornamelijk gevormd bij de afbraak van lignine en worden, afhankelijk van het type lignine, in talrijke varianten aangetroffen . Voor een meer diepgaande discussie over remming zie B. V. de review door Almeida et al .

enzymatische hydrolyse

een succesvolle voorbehandeling heeft de hemicellulose grotendeels verwijderd, waardoor de cellulose beschikbaar is voor hydrolyse., Aangezien de meest gebruikte micro-organismen voor de productie van ethanol uitsluitend suikermonomeren gebruiken, moet de cellulose worden gehydrolyseerd, wat in een SSF gelijktijdig met de fermentatie optreedt. Historisch gezien is de vertering van industriële cellulose gemaakt met zure hydrolyse en is de optimalisatie van zure hydrolyse van verschillende lignocellulose materialen uitgevoerd voor ethanolproducerende doeleinden ., Zure hydrolyse produceert echter hydrolysaten die relatief giftig zijn voor de fermenterende micro-organismen, en de maximale glucoseopbrengst is beperkt tot ongeveer 60% in een batchproces om kinetische redenen . De enzymatische afbraak van de cellulosefractie kan daarentegen relatief niet-toxische hydrolysaten met hogere suikeropbrengsten opleveren.

enzymen gespecialiseerd in het afbreken van β-1-4-glycosidebindingen van glucaan worden gezamenlijk cellulases genoemd. In 1950 presenteerden Reese et al een model van enzymatische cellulose hydrolyse op basis van meerdere enzymen (C1 en CX)., Het C1-enzym werd verondersteld kortere polyanhydro-glucosekettingen te produceren, terwijl de oplosbaarheid werd toegeschreven aan het CX-enzym. In principe geldt hetzelfde beeld vandaag, maar er is een enorme vooruitgang in de kennis over alle verschillende specifieke enzymcomponenten betrokken. De cellulases zijn onderverdeeld in drie subcategorieën, die drie soorten activiteit vertegenwoordigen: endoglucanasen, exoglucanasen (cellobiohydrolasen) en β-glucosidasen., Endoglucanases aanzienlijk verminderen de mate van polymerisatie van het substraat door willekeurig aanvallen van de inwendige delen, vooral in de amorfe gebieden van cellulose. Exoglucanasen (of cellobiohydrolasen) daarentegen verkorten de glucaanmoleculen stapsgewijs door zich aan de glucaaneinden te binden en voornamelijk cellobiose-eenheden vrij te geven. Tot slot splitsen β-glucosidasen de disaccharide cellobiose in twee eenheden glucose.,

verschillende soorten micro-organismen kunnen cellulasesystemen produceren, waaronder aërobe filamenteuze schimmels, aërobe actinomycetes, anaërobe hyperthermofiele bacteriën en anaërobe schimmels (zie bv. review door Lynd et al. ). Intensief onderzoek naar de aërobe filamenteuze schimmels T. reesei in de afgelopen decennia heeft geresulteerd in een efficiënt cellulase producerende organisme, dat momenteel de industriële cellulase productie domineert .

zoals reeds vermeld, is een belangrijk voordeel met SSF in vergelijking met SHF de vermindering van remming van het eindproduct door suikers die in de hydrolyse worden gevormd., Het fermentatieproduct ethanol remt ook hydrolyse, maar in mindere mate dan cellobiose of glucose . Een ander voordeel is dat de inhibitors van de voorbehandeling door de micro-organismen kunnen worden gemetaboliseerd . Echter, ook het SSF-proces kan lijden aan onvolledige hydrolyse van de vaste lignocellulosefractie. Behalve remming door eindproducten of andere componenten , kan dit te wijten zijn aan enzyme deactivering, onproductieve enzymadsorptie , afnemende beschikbaarheid van keteneinden en toenemende kristalliniteit met omzetting van voorbehandelde cellulose .,

in een industriële SSF moeten enzym-en celconcentraties naar behoren worden afgewogen om de kosten voor de productie van gist en enzymen tot een minimum te beperken. De synergieën tussen de enzymen, bijvoorbeeld endo-exo-synergisme , exo – exo-synergisme , en synergisme tussen endo-of exoglucanasen en β-glucosidasen , moeten ook worden geoptimaliseerd door de samenstelling van de enzymmengsels af te stemmen. De optimale samenstelling zal zeker afhangen van de lignocellulose grondstof.,

fermenterende micro-organismen

de algemene vereisten voor een organisme dat bij de productie van ethanol wordt gebruikt, zijn dat het een hoog ethanolrendement en een hoge productiviteit moet opleveren en hoge ethanolconcentraties moet kunnen weerstaan om de destillatiekosten laag te houden . Naast deze algemene vereisten zijn inhibitortolerantie, temperatuurtolerantie en de mogelijkheid om meerdere suikers te gebruiken essentieel voor SSF-toepassingen. Tolerantie ten opzichte van lage pH-waarden zal het risico op contaminatie minimaliseren., Het werkpaard in de productie van zetmeel of saccharose is de gewone bakkersgist Saccharomyces cerevisiae. Dit organisme produceert ethanol met een hoge opbrengst (hoger dan 0,45 g g-1 bij optimale omstandigheden) en een hoge specifieke snelheid (tot 1,3 g G-1 celmassa h-1). Het heeft ook een zeer hoge ethanoltolerantie, meer dan 100 g L-1 is gemeld voor sommige spanningen en media . Bovendien heeft het organisme bewezen robuust te zijn tegen andere remmers, en daarom is het geschikt voor fermentatie van lignocellulose materialen .,

Hemicellulose uit hardhout en landbouwresten is doorgaans rijk aan xylanen (cf. Tabel 1) – hardhout dat voornamelijk O-acetyl-4-o-methyl-glucuronoxylaan bevat, terwijl grassen arabinoxylaan bevatten . Zachthout hemicellulose daarentegen bevat meer mannanen-voornamelijk in de vorm van galactoglucomannaan-en minder xylaan. Mannose fermentatie is normaal gesproken efficiënt in S., cerevisiae, terwijl de capaciteit om galactose te fermenteren afhankelijk is van stam, en de genen voor galactose-gebruik verder worden onderdrukt door glucose , wat leidt tot een typisch sequentieel gebruik van de suikers. Het is duidelijk dat xylosefermentatie een belangrijker probleem is voor landbouwresiduen en hardhout dan voor zachthout. Xylose wordt niet gemetaboliseerd door wild-type S. cerevisiae, afgezien van een kleine reductie tot xylitol. Dit, en voor sommige delen de temperatuurtolerantie, zijn de belangrijkste reden geweest achter de interesse om ook andere micro-organismen voor lignocellulose omzetting in SSF te testen.,

van nature xylose-fermenterende gisten, zoals Pichia stipitis en Candida shehatae, kunnen mogelijk nuttig zijn voor gebruik in SSF van materialen met een hoog xylaangehalte. Echter, hun tolerantie voor remmende verbindingen in niet-geoxifieerde lignocellulose hydrolysaten is vrij laag, en bovendien, een zeer lage en goed gecontroleerde toevoer van zuurstof is vereist voor efficiënte xylose fermentatie . De belangrijkste “concurrenten” van de gist zijn de bacteriën Zymomonas mobilis en genetisch gemanipuleerde Escherichia coli. Z., mobilis, een obligaat anaërobe bacterie, die geen functioneel systeem voor oxidatieve fosforylering heeft, produceert ethanol en kooldioxide als belangrijkste fermentatieproducten. Interessant, Z. mobilis gebruikt de Entner-duodoroff weg die een lagere ATP productie per katabolized glucose geeft . Dit geeft op zijn beurt een lagere biomassa opbrengst en een hogere ethanolopbrengst op glucose in vergelijking met S. cerevisiae . Echter, wild-type Z. mobilis ontbreekt het vermogen om pentose suikers fermenteren, en een belangrijk nadeel is verder dat het niet een zeer robuust organisme., In het algemeen lijken bacteriën minder tolerant te zijn voor lignocellulose-afgeleide inhibitors en kan een ontgiftingsstap nodig zijn voorafgaand aan de fermentatie. In tegenstelling tot bakkersgist en Z. mobilis is E. coli in staat om een grote verscheidenheid aan substraten (waaronder hexoses, pentoses en lactose) te metaboliseren, maar het wild-type organisme heeft een gemengde fermentatieve route en is dus een slechte ethanolproducent. In een monumentale bijdrage, bekroond met U. S. patent nummer 5000000, een stam van E., coli werd genetisch gemanipuleerd tot een ethanolproducent door overexpressie van PDC (coderend pyruvaat decarboxylase) en adhB (coderend alcoholdehydrogenase) van Z. mobilis . Uitstekende resultaten zijn bereikt met recombinant E. coli, bijvoorbeeld de ko11-stam, die een ethanolrendement van 86 tot bijna 100% van de theoretische, en uiteindelijke ethanolconcentraties tot 40 g L-1 op hemicellulosehydrolysaten van bagasse, maïsstover en maïsschillen hebben aangetoond ., In gerapporteerde studies werd echter alleen de vloeibare fractie gebruikt en de hydrolysaten werden bovendien voorafgaand aan gebruik ontgiften door met calciumhydroxide over te klimmen tot pH 9 en vervolgens met HCl op pH 6,0–6,5 te brengen. Bovendien is E. coli, aangezien de optimale pH 6,5 is, minder geschikt voor SSF-processen met T. reesei cellulases, die over het algemeen wordt beschouwd als een pH-optimum rond 4,8 .

Pentosefermentatie door geconstrueerde S. cerevisiae

vanwege de zeer aantrekkelijke eigenschappen van S., cerevisiae in industriële fermentaties, zijn er significante inspanningen gedaan in de afgelopen decennia om recombinante xylose en arabinose fermenterende stammen van deze gist te ontwerpen. Xylose fermenterende stammen van S. cerevisiae kunnen in principe worden geconstrueerd door genen te introduceren die xylose-isomerase (XI) coderen uit bacteriën en schimmels , of genen die xylose-reductase (XR) en xylitol-dehydrogenase (XDH) coderen uit schimmels . Ook moet het endogene xks1 gen dat xylulokinase (XK) codeert overexpresseren om significante xylosefermentatie te verkrijgen ., Transporteiwitten zijn nodig voor opname van xylose, evenals van andere suikers in gist. In S. cerevisiae, is xylose gevonden om door de hexosetransporters worden getransporteerd, maar de affiniteit voor xylose is ongeveer 200-voudig lager dan voor glucose . Bijgevolg wordt de opname van xylose competitief geremd door glucose.

er zijn 20 verschillende genen die coderen voor suiker transport gerelateerde eiwitten, 18 individuele systemen (Hxt1-17 en Gal2) en twee gerelateerde signaal eiwitten (Snf3p en Rgt2p)., De transporters vertonen verschillende affiniteiten voor suikers en de expressie van hun overeenkomstige genen wordt geregeld door de suikerconcentraties, dat wil zeggen de beschikbaarheid van de koolstofbron . Men heeft eerder voorgesteld dat xylose door zowel hoog – als laag-affiniteitssystemen van glucosetransporters (Figuur 2) wordt opgenomen, maar het begrip in aanwezigheid van lage glucoseconcentraties wordt verhoogd . Studies hebben aangetoond dat de hexose transporters met hoge en middelmatige affiniteit; Hxt4, Hxt5 Hxt7 en Gal2 zijn in feite de belangrijkste transporters voor xylose ., Verder is aangetoond dat een lage (maar niet-nul) glucoseconcentratie nodig is in het medium voor een efficiënte opname van xylose . Dit is verklaard door een behoefte aan glucose voor uitdrukking van glycolytische enzymen en tussenpersonen , evenals generatie van intermediaire metabolites voor de eerste stappen van het xylosemetabolisme en de weg van het pentosefosfaat . Een andere mogelijke verklaring, afgeleid uit zowel experimenten als computermodellering, is dat de glucose nodig is voor de expressie van hexose transporters met gunstige xylose transport eigenschappen, bijvoorbeeld Hxt4 ., Om een efficiënte co-fermentatie van xylose en glucose in SSF (soms aangeduid als sscf – gelijktijdige saccharificatie en co-fermentatie) met recombinant S. cerevisiae te verkrijgen, is het daarom noodzakelijk om de glucoseconcentratie laag te houden, wat in de praktijk is aangetoond in recente SSF-studies .