Madame Lelica

Er zijn vier families van intracellular proteolytische complexen alomtegenwoordig in eubacteria: Lon, Hsluv (ClpQY), ClpXP en FtsH. Naast deze vijf, is HtrA (DegP) een periplasmic/secreted proteolytic complex, terwijl het prokaryotic proteasoom slechts in actinomycetes wordt gevonden. De structuur, functie en rol in de pathogenese van elk protease is eerder beoordeeld.,Verscheidene van deze complexen zijn onderzocht als potentiële antibacteriële doelwitten, waaronder 18 ClpXP,19 HtrA20 en het proteasoom.21 hiervan is ClpXP het meest uitgebreid onderzocht en is het enige complex waarvoor tot nu toe natuurlijke productremmers zijn gevonden.

het CLP-proteolytische complex

Clpp ‘ s zijn goed geconserveerd in de meeste bacteriesoorten en spelen een belangrijke rol bij de eiwitomzetting., Naast eiwithomeostase en degradatie van misfolded proteã NEN, is ClpP ook betrokken bij talrijke regelgevende processen door transcriptional regelgevers te richten en het remodelleren van proteome.22, 23, 24, 25 ClpP blijkt inderdaad een belangrijke rol te spelen bij het reguleren van processen zoals celdeling, stresstolerantie, virulentie, morfologische differentiatie en antibioticaresistentie.22, 23, 24 de rol van ClpP in deze processen berust op zijn strikte selectie van eiwitsubstraten, die het bereikt door toegang tot zijn katalytische plaatsen te beperken., Elk ClpP-complex wordt gevormd door twee heptamerische ringen te stapelen om een tetradekamer te creëren (Figuur 2).26 het kanaal dat wordt gevormd herbergt 14 serine protease katalytische plaatsen die niet kunnen worden benaderd zonder doorgang door de axiale openingen. Voorts keurt apo-ClpP een inactieve, gecomprimeerde bouw goed waarin zijn katalytische triade verkeerd is uitgelijnd.27 controle conformationele activering en toegang tot axiale openingen zijn hsp100 proteã nen van de AAA+ superfamilie van Atpasen: ClpA of ClpX in gramnegatieve bacteriën en ClpC of ClpX in Grampositieven., Deze accessoire Atpasen vormen hexamerische ringen die de axiale gezichten van de tetradecamer binden met behulp van tripeptide (L/I)gf-motieven die in hydrofobe zakken passen.28 Binding in deze hydrophobic pocket reguleert ClpP activiteit op twee manieren: ten eerste, door het complex te stabiliseren in een actieve, uitgebreide conformatie met de katalytische triade uitgelijnd en, ten tweede, door eiwit substraat ontvouwen., AAA + ATPases interageren met eiwitdoelstellingen, of direct of door een samenwerkende adapterproteã ne, en gebruiken de energie die door ATP wordt verstrekt om het substraat te ontvouwen en het in de centrale porie te voeden waar het op een energie-onafhankelijke manier wordt gehydrolyseerd. Aangezien gevouwen proteã nen anders te groot zijn om het kanaal in te gaan, regelen deze partners van AMERIKAANSE CLUB VAN AUTOMOBILISTEN strak welke eiwitsubstraten voor degredation worden gericht.28

De meeste bacteriesoorten, waaronder E. coli, Bacillus subtilis en Staphylococcus aureus, hebben één clpP-gen dat, samen met de bijbehorende AAA+ Atpasen, niet essentieel is voor de levensvatbaarheid van cellen.25, 29, 30, 31, 32 Niettemin is waargenomen dat clpp-deletie bij deze soorten hun gevoeligheid voor antibiotica zoals linezolide en rifampicine verhoogt en de virulentie bij pathogenen zoals Listeria monocytogenes en S. aureus vermindert.,Verlies van virulentie in clpxp-deficiënte stammen is in verband gebracht met belangrijke verstoringen in globale virulentie transcriptionele factorniveaus zoals het SAR/agr regulatory network in S. aureus.Interessant is dat het effect van ClpP-inactivatie op verscheidene van deze virulentieregulatoren stamafhankelijk blijkt te zijn en dat bovendien sommige S. aureus-stammen met een deficiënte ClpXP-functie een verminderde gevoeligheid lijken te hebben voor vancomycine, daptomycine en β-lactam-antibiotica.,34, 35, 36

in tegenstelling tot de meeste bacteriën worden twee of meer kopieën van clpP aangetroffen in actinobacteriën en cyanobacteriën en is ten minste één functionele kopie essentieel voor de levensvatbaarheid.Bij Mycobacterium tuberculosis vormen clpP1 en clpP2 een operon en beide genen zijn essentieel. Deze isovormen werken samen om een functionele protease te creëren door clpp1 en clpp2-homeheptamers te stapelen in een heterotetradekamer.37, 39 van de vier AAA + Atpasen bij M. tuberculosis, ClpX en ClpC1 zijn essentieel voor de levensvatbaarheid.,Gezien zijn rol in de levensvatbaarheid en virulentie van de cellen, is het ClpP-systeem een veelbelovend doelwit voor nieuwe antibacteriële middelen met drie mogelijke mechanismen voor deregulering (Figuur 2): remming van ClpP-proteolyse, activering van ClpP-proteolyse of verstoring van partner AAA+ Atpasen.

ClpP-remmers

misschien is de meest voor de hand liggende aanpak om zich op het ClpP-systeem te richten het ontwikkelen van een actieve locatieremmer van ClpP. Het principe van dit werkingsmechanisme is aangetoond bij S. aureus, Streptococcus pneumoniae en L., monocytogenes, waar clpP knockouts niet in staat zijn om huidinfectie abcessen, longinfecties of in vivo macrofaag parasitisme, respectievelijk veroorzaken.Dit verlies van virulentie is in verband gebracht met een verminderde activiteit van extracellulaire proteasen, lipasen, Dnasen en α-hemolysine in S. aureus, en α-listerolysine en listeriële fosfolipase in L. monocytogenes.

De baanbrekende inspanningen van Böttcher en Sieber44 om ClpP aan te pakken, leidden tot de ontwikkeling van een reeks β-lactonremmers., Geïnspireerd door de reactiviteit van β-lactonen gevonden in de natuur, synthetiseerden zij een bibliotheek van alkyne-geëtiketteerde derivaten (bijvoorbeeld, Lactone D3; figuur 3a), die tegen verscheidene bacteriële proteomes werden gescreend. De klikchemie op de alkyne markering werd gebruikt om fluorophore vast te maken en voor de identificatie van reactieve enzymen toe te staan. Op deze manier werd ClpP geïdentificeerd als een zeer specifiek doelwit dat een covalent adduct vormt tussen zijn actieve plaats Ser98 en het β-lacton, waardoor de proteolytische activiteit irreversibel wordt geremd (figuur 3b).,De daaropvolgende karakterisering toonde aan dat β-lactonen in staat waren de virulentiefactor-activiteit, waaronder α-hemolysine en listerolysine, te verminderen in respectievelijk S. aureus en L. Monocytogenes.Deze vermindering van virulentiefactoren correleerde met het vermogen van geoptimaliseerde β-lacton scaffolds (U1; figuur 3a) om S. aureus infectie significant te verminderen na subcutane toediening in een huidabces model en L. monocytogenes groei in macrofagen.46, 47 voorts bleken β-lactonderivaten (verbinding 7; figuur 3a) tot de bevoorrechte groep van verbindingen te behoren die in staat zijn M., tuberculose om de groei effectief te remmen met een MIC van 28 µg ml−1,48 uiteindelijk, echter, lage plasmastabiliteit als gevolg van snelle hydrolyse van de cyclische ester belet verdere klinische ontwikkeling.

Meer recent hebben Sieber en collega ‘ S49 een nieuwe klasse van krachtige clpp-remmers ontdekt, de fenylesters (AV170; figuur 3a). Ontdekt met behulp van een onbevooroordeelde screen van 137 000 synthetische verbindingen in een fluorogene test voor ClpP-activiteit, werken fenylesters door dezelfde covalente modificatie van Ser98 Als β-lactonen., Interessant, kunnen sommige enantiomers ook deoligomerization van de tetradecamer van ClpP in heptamers teweegbrengen, een gunstige wijze van actie gegeven dat conformational controle van de serine katalytische triade het inactief in de heptameric vorm van ClpP oplevert. Ondanks de verbeterde potentie van de fenylesters van proteaseremming ten opzichte van β-lactonen, is hun anti-virulentieactiviteit verminderd, omdat zij alleen in staat zijn de α-hemolysineproductie te verminderen en niet af te schaffen (figuur 3c). Pogingen om de potentie te verhogen onthulden een trade-off tussen stabiliteit en reactiviteit.,

hoewel clpp-remming veelbelovend is als een werkingsmechanisme, is verdere ontwikkeling en ontdekking van nieuwe steigers duidelijk vereist. Bovendien, gezien recent bewijs van geneesmiddelresistentie in bepaalde clpp knockout stammen,34, 36 enige voorzichtigheid op dit pad kan worden gerechtvaardigd.

ClpP-activatoren

activering van het clpp-proteasesysteem is een bijzonder intrigerende therapeutische optie. Een keurmerk van intracellular proteasen is strikte verordening van activiteit om van doelproteã ne degradatie te vermijden. In eukaryotes wordt dit vaak bereikt door compartimentering in organellen., In tegenstelling, hebben de bacteriën strakke regelgevende eiwitcomplexen ontwikkeld om protease activiteit te controleren. Door proteolytische activiteit te activeren om zonder onderscheid proteã nen te degraderen, zou een drug celdood niet alleen in die species kunnen veroorzaken waar ClpP essentieel is, maar ook die waar ClpP overbodig is. Mutaties die de activiteit van ClpP afschaffen, terwijl ze theoretisch resistentie verlenen, zouden fataal zijn in cellen waar ClpP essentieel is en de virulentie aantasten in cellen waar ClpP overbodig is., Ten slotte kan de ongekende werkingswijze door activering eerder dan remming van zijn doel zulk een drug toestaan om tegen slapende persisterende cellen efficiënt te zijn.

Serendipitous bewijs van principe van dit unieke werkingsmechanisme werd gerapporteerd met de ontdekking van acyldepsipeptiden (ADEPs; figuur 4a). ADEPs werden voor het eerst beschreven in een patent in 1985 als het ‘a54556 complex’, een groep van acht nauw verwante verbindingen geproduceerd door Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.,Reverse genomics toegepast op een ADEP-resistente E. coli stam om de resistentiedeterminant te identificeren als een mutatie in ClpP die het inactief maakt. Deze bevinding suggereerde dat ADEPs clpp activeren, waardoor ongepaste eiwitdegradatie wordt veroorzaakt. Inderdaad, in vitro studies meten splitsing van fluorogene peptiden en in vivo proteomic analyse bevestigden dat ADEP-geactiveerde B. subtilis ClpP in staat was om eiwitten onafhankelijk van AAA+ Regulatie of ATP hydrolyse degraderen.,51

inzicht in dit verlies van Regulatie is verkregen door kristalstructuren van ADEP-geactiveerd ClpP van E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis en Neisseria meningitidis (figuur 4b).52, 53, 54, 55 een ADEP-molecuul bindt aan elk monomeer in het clpp-tetradecamer in dezelfde hydrofobe zak die door de AAA+ ATPases wordt gebruikt, waardoor hun interactie wordt geremd (figuur 4d).,52, 55, 56 De Binding bootst de conformationele controle van de ATPase van ClpP na, die uitlijning van de serine katalytische Triade en een stijve lichaamsrotatie van de clpp monomeren induceert, die de axiale porie van 10-12 Å tot 20 Å in E. coli verwijdt.27, 52, 55 een gating mechanisme wordt ook geleverd door de N-terminal domeinen, die bewegen van een down, of gesloten conformatie naar een up, of open conformatie op ADEP binding.,52, 55 ADEP-activering staat niet stabiel gevouwen proteã nen toe om te worden gedegradeerd, aangezien zij nog te groot zijn om het axiale lumen van ClpP in te gaan, maar staat onstabiele proteã nen en ontluikende kettingen toe die uit het ribosoom komen om te worden gedegradeerd, vooral als zij langzaam vouwen.De celdood wordt verondersteld om een resultaat van deze willekeurige degradatie, evenals de remming van normale ClpP-functie te zijn.

ADEPs zijn actief tegen een reeks Grampositieve bacteriën, waaronder klinisch relevante methicilline-resistente S. aureus (MRSA), vancomycine-resistente enterokokken en penicilline-resistente S., pneumoniae, evenals de gramnegatieve pathogenen N. meningitidis en Neisseria gonorrheae.51, 54 semisynthetische ADEP-derivaten zijn effectief tegen Enterococcus faecalis, S. aureus en S. pneumoniae in muizen-en rattenmodellen met een hogere activiteit dan linezolide,51 en de activiteit tegen MRSA in een muriene periotinitis-model is superieur aan vancomycine.Met name ontwikkelt zich resistentie tegen Adep ‘ s bij deze bacteriesoorten met een frequentie van 10-6 door mutaties die de niet-essentiële functie van ClpP verminderen., Niettemin is gebleken dat combinatietherapieën van ADEP en rifampicine, door gebruik te maken van de verminderde geschiktheid van clpP-mutanten als voordeel, een vancomycine-resistente MRSA-populatie in vitro volledig uitroeien.59

nog veel belovend is het vermogen van ADEPs om persistercellen te elimineren.59 Conlon et al.59 beschreef deze eigenschap voor het eerst toen een ADEP effectief zowel stationaire fase S. aureus als persister S. aureus na behandeling met ciprofloxacine doodde. Deze bevinding heeft implicaties voor het gebruik van ADEPs tegen latente tuberculose infecties veroorzaakt door drug-tolerante M. tuberculosis persisters., Tot op heden is de activiteit tegen M. tuberculosis persisters niet beschreven, maar het is aangetoond dat Adep ‘ s de groei van M. tuberculosis vertragen in combinatie met twee effluxpompremmers, reserpine en verapamil.

hoewel Adep ‘ s veelbelovende leads zijn voor medicijnkandidaten, hebben ze ongunstige farmacologische eigenschappen, waaronder een slechte oplosbaarheid in water, snelle systemische klaring en chemische instabiliteit.Na de ontdekking van het werkingsmechanisme van ADEPs werd door Bayer AG een SAR-programma voor medicinale chemie gelanceerd om een stabieler en krachtiger derivaat van ADEP te ontwikkelen., Deze inspanning resulteerde in de ontwikkeling van ADEP4, een zeer krachtig ADEP1-derivaat met drie belangrijke modificaties: Phe wordt vervangen door 3,5-difluorfenylalanine, dat verondersteld wordt H-bindingen met ClpP te vormen, het acylpolyeen wordt vervangen door een α,β-onverzadigde hexenoyl-staart om de stabiliteit te verbeteren en N-MeAla wordt vervangen door pipecolaat, wat de stijfheid van ADEP verhoogt.60 activiteit van ADEP4 werd verder verbeterd door Carney et al.61 door SER te vervangen door Allo-Thr en Pip door 4-MePip om ADEP verder te rigidiferen., Door waterstof-deuterium wisselkoersen te kwantificeren met behulp van 1H NMR, werd rigidificatie van het ADEP-molecuul getoond om de transannulaire h-banden te versterken, waardoor de entropische kosten van binding aan ClpP werden verminderd. Carney ‘ s ADEP derivaat heeft 600-1200-voudige grotere potentie dan ADEP1 tegen Gram-positieve pathogenen.Ondanks de verhoogde potentie van deze ADEP-derivaten hebben ze nog steeds slechts een beperkte activiteit tegen gramnegatieve bacteriën en worden ze efficiënt uit de cel verwijderd door actieve efflux, vooral bij M. tuberculosis.,39, 62 tal van andere synthetische chemie inspanningen hebben onderzocht motieven om deze beperkingen te overwinnen, maar de meeste hebben geresulteerd in verminderde activiteit (figuur 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 gezien de intieme binding van ADEP in zijn hydrofobe zak, dit resultaat is misschien voorspelbaar en suggereert dat modificatie op de ADEP steiger kan een impasse hebben bereikt.

twee high-throughput schermen zijn aangekoppeld om nieuwe ClpP activators te identificeren.65, 68 beide identificeerden kleine molecule activatoren van E., coli ClpP door gebruik te maken van een in vitro assay die de toename van de fluorescentie meet veroorzaakt door de splitsing van fluoresceïne–isothiocyanaat-caseïne, een modelsubstraat voor ClpP. In de eerste, Leung et al.65 onderzocht 60.000 drugachtige synthetische chemische stoffen, waarbij vijf verbindingen werden geïdentificeerd die ACP1–5 worden genoemd (figuur 4a). De meest actieve van deze verbindingen waren 10-20 maal minder krachtig dan ADEP1 bij het activeren van ClpP en vertoonden slechts bescheiden antibacteriële activiteit, zelfs in aanwezigheid van permeabiliserende middelen. Lavey et al.,In plaats daarvan onderzocht >20 450 schimmel-en bacteriële extracten of metabolieten en identificeerde een enkele ClpP-activator, sclerotiamide (figuur 4a). Dit paraherquamide-gerelateerde indolinon was 73 keer minder krachtig dan ADEP1 bij het activeren van EcClpP en remde niet de groei van effluxdeficiënte E. coli of Pseudomonas aeruginosa.

ondanks de beperkte doeltreffendheid van de ACS ‘ s en sclerotiamide, bieden deze studies nieuwe steigers voor derivatisatie en openen zij de deur naar toekomstige studies om ClpP-activatoren te identificeren., Men kan zich bijvoorbeeld voorstellen dat alternatieve activatiebindingsplaatsen op ClpP worden geïdentificeerd. De verordening van ClpP impliceert niet alleen controle van substraatingang door porie die op Vereniging van AAA+ ATPase uitbreiden, maar ook vorming van de serine katalytische plaats door oligomerization in tetradecamers.69 misschien kon een kleine molecule die actieve plaatsvorming veroorzaakte terwijl het handhaven van ClpP als heptamer voor gemakkelijke toegang tot deze actieve plaats door willekeurige substraten toestaan.,

AAA + ATPase ontkoppelt als therapeutica

aangezien ClpP afhankelijk is van AAA+ ATPases om eiwitsubstraten te selecteren en te ontvouwen, kan verstoring van deze partners ook het proteolytische systeem van ClpP dereguleren. Dit geldt met name voor M. tuberculosis waar de Clpc1 en ClpX Atpasen essentieel zijn voor de levensvatbaarheid van de cellen.40, 41 inderdaad, werden elk van de drie verbindingen gericht op ClpC1 tot op heden gekarakteriseerd door het screenen van natuurlijke productextracten voor anti-M. tuberculosis activiteit., De eerste om te worden ontdekt is cyclomarin A( cymA), een cyclisch heptapeptide dat door de mariene bacterie Streptomyces sp wordt geproduceerd. CNB-982 (figuur 5a).Hoewel het in 1999 werd beschreven als een krachtig anti-inflammatoir middel met cytotoxiciteit tegen kankercellen, was het niet tot 2011 dat de activiteit tegen M. tuberculose werd ontdekt tijdens een volledig-celscherm van een natuurlijk product.71 In een eerste poging om cymA ‘ s moleculaire doel te identificeren, werd een omgekeerde genomica benadering genomen. Echter, na geen spontane resistente M., de tuberculose mutanten konden worden teruggekregen, werd de chromatografie van de affiniteit in plaats daarvan gebruikt om aan te tonen dat cymA ClpC1 met hoge specificiteit richt. De daaropvolgende co-kristalisatie van cymA met het N-terminale domein van ClpC1 identificeerde residuen die belangrijk zijn voor de binding en, ondanks het onvermogen om spontane resistente mutanten te genereren, maakte het mogelijk om clpc1-mutanten te creëren die resistentie tegen cymA veroorzaakten.72

in 2014, ecumicine, een macrocyclisch tridecapeptide van Nonomurea sp., MJM5123, 73 en lassomycine, een 16-membered lasso-peptide van Lentzea kentuckyensis sp.74 werden geïsoleerd door het screenen van ruwe actinomycete-extracten (figuur 5a). Het n-terminale domein van ClpC1 werd geïdentificeerd als het moleculaire doel van deze samenstellingen door middel van reverse genomics op spontane resistente mutanten. Ondanks het feit dat cymA, ecumicine en lassomycine een gemeenschappelijk doel hebben, wijzen structurele karakterisering en de positie van mutaties die resistentie tegen elke verbinding verlenen erop dat elk zich op een iets andere positie bindt aan het n-terminale domein van ClpC1 (figuur 5b)., In tegenstelling tot cymA en ecumicine is lassomycine bijvoorbeeld zeer basisch en bevat het verscheidene Arg-residuen, en dokken in een zeer zure regio van ClpC1.74

CymA, ecumicine en lassomycine zijn allemaal bactericide tegen replicerende M. tuberculosis, een reeks andere mycobacteriële soorten, en multidrugresistente M. tuberculosis. Belangrijk is dat ze ook actief zijn tegen niet-replicerende M. tuberculose. In overeenstemming met het gebrek aan essentialiteit van AAA+ Atpasen, ontbreekt elk activiteit tegen andere Gram-positieve en Gram-negatieve soorten zoals S. aureus en P. aeruginosa., Deze specificiteit heeft voordelen, aangezien zij activiteit tegen commensal leden van menselijke microbiota ook missen.

om celdood bij M. tuberculosis te veroorzaken, lijken ecumicine en lassomycine ATPase-activiteit te stimuleren, maar ontkoppelen deze van eiwitafbraak.73, 74 op deze manier wordt degradatie van natuurlijke substraten geremd en leidt tot hun opbouw en toxiciteit, vergelijkbaar met de acties van zowel ClpP-remmers als activatoren in M. tuberculosis., In tegenstelling tot ecumicine en lassomycine wordt gesuggereerd dat cymA de eiwitafbraak verhoogt, zoals wordt aangetoond door een afname van de met LeuAspAsp-tripeptide gelabelde groene fluorescerende eiwitfluorescentie gericht op ClpC1 bij incubatie met cymA.Het is echter mogelijk dat deze afname van de fluorescentie het gevolg is van groene fluorescerende eiwitten die zich ontvouwen door ClpC1 in plaats van degradatie en cymA kan daarom hetzelfde ontkoppelingsmechanisme hebben als ecumicine en lassomycine., Verschillende vragen blijven onbeantwoord over het werkingsmechanisme van deze geneesmiddelen, waaronder hun effecten op eiwitontvouwing en hoe ATPase-activiteit wordt gestimuleerd en proteolyse wordt geremd, bijvoorbeeld door interactie met ClpP1P2 te remmen. Bovendien is de karakterisering nog aan de gang voor nog een andere onlangs ontdekte clpc1-remmer, de analoge rufomycine RUF-I. 75

ondanks de relatief hoge potentie van cymA, oecumicine en lassomycine tegen M. tuberculosis, is optimalisatie van farmacologische eigenschappen vereist., CymA vertoont bijvoorbeeld hepatische klaring en een korte halfwaardetijd bij muizen, en ecumicine heeft een beperkte oplosbaarheid en een slechte intestinale absorptie.13, 73 recente totale syntheses en fermentatieoptimalisatie kunnen helpen bij deze ontwikkelingen.76, 77, 78

hoewel geneesmiddelen die gericht zijn op ClpC1 een intrigerende mogelijkheid zijn voor anti-M. tuberculosetherapie, hebben zij over het algemeen geen bactericide werking tegen andere soorten dan actinobacteriën., In deze species waar ClpP en bijbehorende AAA + ATPases overbodig zijn, is het mogelijk dat het richten van deze ATPases antivirulentie effecten vergelijkbaar met die waargenomen met clpp-remmers zou hebben. Nochtans, zou een dergelijke samenstelling waarschijnlijk veelvoudige atpasepartners moeten kunnen richten om zo wijdverspreid een effect als directe actie op ClpP te hebben. Deze potentiële antivirulentie-effecten zijn niet onderzocht voor cymA, lassomycine of ecumicine.,

het bereiken van specificiteit

van de bacteriële proteolytische complexen, alle behalve HslUV heeft een menselijke ortholog en vele zijn in feite intensief bestudeerd als potentiële doelen tegen kanker. Bijvoorbeeld, mitochondriale proteasen LONP1, ClpXP en M-AAA (FTSH homolog) hebben belangrijke rollen in kwaliteitscontrole in de mitochondria, vooral tijdens respiratoire stress.79 mutaties in m-AAA zijn ook betrokken bij spastische paraplegie, een erfelijke neurodegeneratieve ziekte.Als zodanig, is het essentieel dat antimicrobial agenten hun bacteriële homolog specifiek kunnen richten.,

in het geval van proteaseremmers die als suïcide substraten willen optreden, kan het bereiken van specificiteit een uitdaging zijn, vanwege behouden katalytische mechanismen. Er is inderdaad een gebrek aan specificiteit ondervonden bij pogingen om remmers van zowel het prokaryotische proteasoom als het bacteriële protease te ontwikkelen. Het prokaryotic proteasoom in M. tuberculosis zorgt voor een veelbelovend doel voor remming, aangezien het overbodig is voor groei in vitro maar essentieel is voor overleving van stikstofmonoxide stress81 en persistentie in muizen.,62, 82 vele pogingen zijn gedaan om een drug tegen het mycobacterial proteasome te ontwikkelen, gewoonlijk als peptidylepoxyketones, aldehyden of boronaten, maar de meeste remmen het zoogdierproteasoom krachtiger dan dat van M. tuberculosis.De selectiviteit is echter niet ongekend, zoals blijkt uit de ontdekking van de oxathiazool-2-on-verbindingen GL5 en HT1171 (Figuur 6). Deze verbindingen zijn bactericide tegen niet-replicerende M., tuberculose behandeld met subinhibitieve niveaus van salpeteroxide21 en heeft >1000-voudige verhoogde activiteit tegen mycobacteriële ten opzichte van humane proteasomen. De specificiteit wordt verondersteld te worden verleend door interactie van het geneesmiddel met residuen buiten de actieve plaats die niet in zoogdierproteasomen worden geconserveerd.21

is ook een veelbelovend doel, aangezien het betrokken is geweest bij biofilmvorming, motiliteit en stresstolerantie, en er is aangetoond dat mutanten een verminderde kolonisatie en virulentie hebben in Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, Vibrio cholera en P. aeruginosa.84, 85, 86, 87 in de enige poging tot nu toe om bacteriële remmers te identificeren, werden proteasoomremmers in vitro gescreend en werd het peptidylboronaat MG262 geïdentificeerd.,18 nochtans, is deze verbinding nog 2000 keer krachtiger tegen proteasoom 20.Net als bij oxathiazool-2-on verbindingen is het waarschijnlijk nodig om gebruik te maken van residu ‘ s die uiteenlopen in humane homologen om een zeer specifieke remmer te ontwikkelen.

specificiteit kan ook worden bereikt door buiten de katalytische actieve plaats te bewegen naar bindingsplaatsen die de proteasefunctie verstoren, maar die slecht worden bewaard tussen menselijke en bacteriële orthologen. Adep ‘ s tonen het potentieel van deze aanpak treffend aan., Hoewel ze niet direct zijn getest op humaan ClpP (hclpp), zijn Adep ‘ s niet giftig voor menselijke cellen tot 25 µg ml-1, wat erop wijst dat ze een slechte, indien aanwezig, affiniteit hebben voor het menselijke enzym.58 structurele vergelijking van E. coli (EcClpP) en hClpP ondersteunt dit begrip. Hun ruggengraat structuur is grotendeels behouden, met een wortel gemiddelde kwadraat afwijking van 0.,Echter, inspectie van de hydrofobe zak gebruikt voor ADEP binding toont aan dat hClpP verschillende substituties die zijn hydrofobiciteit (Asn55Pro, His60Tyr en His112Phe) samen met een lading inversie (Glu56Lys) op het distale gedeelte van de docking groef. Het is heel goed mogelijk dat deze veranderingen ADEP binding in hClpP voorkomen. Opgemerkt moet echter worden dat EcClpX, hoewel niet EcClpA, hclpp kan activeren.88 In ieder geval, kan het zoeken naar drugs die minder behouden regelgevende plaatsen binden de sleutel tot het vinden van hoogst specifieke antibacterials zijn.