matériaux et méthodes
souris.
des souris de type sauvage C57BL/6 ont été obtenues auprès des laboratoires Charles River (Wilmington, MA). Les souris PDE8A KO ont été initialement produites par Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) sous contrat avec Pfizer, Inc. (Pfizer Global de Recherche et de Développement, Sandwich, royaume-uni). Ils ont ensuite été élevés à des souris C57BL/6 à l’Université de Washington pendant 10 générations. Pour les expériences rapportées, des souris appariées à l’âge entre 6 et 8 semaines ont été utilisées., Toutes les procédures ont été approuvées par l’Institutionnel de protection des Animaux et l’Utilisation Comité (IACUC) de l’Université de Washington, selon les Instituts Nationaux de la Santé Guide de Soins et d’Utilisation des Animaux de Laboratoire.
PCR en temps réel.
L’ADNc du testicule a été préparé à partir d’ARN total provenant de testicules de souris de type sauvage et PDE8A-null à l’aide de L’exposant III et de L’Oligo DT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). La PCR en temps réel a été réalisée à L’aide de Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Les amorces (IDT, Coralville, IA) pour PDE8A, dirigées vers la zone en aval de la cassette de ciblage, étaient les suivantes: amorce avant, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); amorce arrière, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Les amorces pour l’hypoxanthine – guanine phosphoribosyltransférase étaient les suivantes: amorce avant ATTATGCCGAGGATTTGGAA; amorce inverse, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
hybridation in Situ.
le modèle pour la synthèse de riboprobe a été obtenu par PCR en utilisant un plasmide contenant la séquence PDE8A de souris., En particulier, la Région 3′ de PDE8A de souris (exons 17-20) a été amplifiée à l’aide des amorces suivantes: amorce avant, aattaaccctcactaaaggacggcgtatttcctttcccag (séquence promotrice de l’ARN polymérase du phage T3 soulignée); amorce inverse, taatacgactcactatagggacacgtcggcacacttaat (séquence promotrice de l’ARN polymérase du phage T7 soulignée). Les produits de PCR ont été isolés à partir de gels d’agarose et purifiés avec un kit D’Extraction de Gel (Qiagen, Valencia, CA)., Les riboprobes marquées au 35S ont été synthétisées par transcription in vitro avec un kit MAXIscript T3 / T7 (Ambion, Austin, TX) en utilisant comme modèle le produit PCR contenant les sites promoteurs de l’ARN polymérase du phage T3 et T7. La transcription In vitro a été réalisée dans un mélange réactionnel de 20 µl contenant 5 µl D’UTP (PerkinElmer, Boston, MA) et de L’ARN polymérase T3 ou de l’ARN polymérase T7 pour obtenir le riboprobe sens ou antisens, respectivement.
des testicules ont été disséqués chez des souris KO de type sauvage et PDE8A et ont été rapidement congelés dans un composé Tissue-Tek O. C. T. (Sakura, Torrence, CA) sur de la glace carbonique., Des Sections (20 µm) ont été découpées dans un cryostat, montées sur un microslide Superfrost plus (VWR Scientific, West Chester, PA) et séchées à l’air. Les sections ont été fixées dans 4% de paraformaldéhyde pendant 15 min à température ambiante, traitées avec 0,25% d’anhydride acétique dans 0,1 m de triéthanolamine (pH 8,0) pendant 10 min, et déshydratées par une série d’éthanol gradué (30, 60, 80, 95 et 100%). Les coupes ont ensuite été incubées avec un tampon d’hybridation dans une chambre humide à 60°C pendant 4 h. Après rinçage dans 2× SSC (citrate salin standard; 1× SSC = 0,15 m de chlorure de sodium/0,015 m de citrate de sodium, pH 7.,2), les sections ont été déshydratées à travers une série d’éthanol gradué. L’hybridation a été réalisée dans un tampon contenant une sonde antisens ou sensée marquée au 35S (40 pg/34 000–38 000 cpm par µl) sous des lamelles en plastique dans une chambre humide à 60°C pendant la nuit. Les lamelles ont été délicatement enlevées et les sections ont été lavées avec 2× SSC contenant 10 mM DTT pendant 30 min deux fois à 60°C. Les sections ont ensuite été incubées pendant 30 min à 37°C avec 20 µg/ml D’ARN ASEA dans 0,5 m de NaCl, 10 mM de Tris·HCl (pH 7.,5), et 1 mm D’EDTA, puis lavés dans 50% de formamide, 2× SSC contenant 10 mm de TNT pendant 30 min à 60°C, dans 1× SSC contenant 10 mM de TNT pendant 30 min à 60°C, et plus loin dans 0,1× SSC contenant 10 mM de TNT pendant 30 min à 60 Rochester, NY) pendant 9 h. Pour voir la distribution cellulaire de l’hybridation de l’ARNm pde8a, les lames ont été recouvertes d’une émulsion d’autoradiographie NTB (Eastman Kodak) et exposées pendant 1 semaine à 4°C., Les lames ont été développées, fixées et contre-tachées avec de l’hématoxyline et montées au Canada Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A immunoprécipitation et dosage.
des spermatozoïdes de souris ont été isolés de l’épididyme cauda par une méthode swim-out (38) et homogénéisés dans du PBS contenant 1% de Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mm EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidine et un mélange d’inhibiteurs de la protéase Sigma (Sigma-Aldrich)., L’homogénat a été centrifugé pendant 5 min à 16 000 × g dans un microcentrifuge et des aliquotes de 200 µl du surnageant, équivalentes à 106 spermatozoïdes, ont été incubées pendant une nuit avec 20 µl d’une suspension 1:1 de billes de protéine G-agarose (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) en présence ou en absence d’anticorps PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Le lendemain, l’immunoprécipité a été lavé trois fois avec du PBS, puis analysé pour déterminer l’activité de la PDE en présence d’un substrat d’AMPc de 10 nM, de vadrouilles de 40 mM (pH 7,5), d’acétate de Mg-15 mM, D’EGTA de 2 mM et de BSA de 0,2 mg/ml, comme dans ref. 39.,
Immunohistotochimie.
des testicules de souris fraîchement congelés ont été incrustés dans un composé Tissue-Tek O. C. T. puis sectionnés sur un cryostat à 20 µm par tranche. Des sections de tissu ou des cellules de Leydig isolées ont été séchées et fixées dans 4% (Poids/vol) de paraformaldéhyde/PBS (pH 7,4) à température ambiante pendant 10 min et lavées trois fois avec du PBS. Les lames ont été préincubées avec un tampon bloquant (5% de sérum d’Âne, 1 mg/ml de BSA et 0.,1% Triton X-100 dans PBS) pendant 1 h à température ambiante, incubé avec un anticorps anti-PDE8A (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) dans du PBS contenant 1% de sérum d’Âne, 1 mg/ml de BSA et 0,1% de Triton X-100 pendant une nuit à 4°c, lavé dans du PBS contenant 0,05% µl, 1:500; Invitrogen) dans du PBS contenant 1 mg/ml de BSA et 0,1% de Triton X-100 pendant 2 h à température ambiante et lavé., Les lames ont ensuite été incubées avec un tampon bloquant contenant 5% de sérum de chèvre pendant 1 h à température ambiante, puis incubées avec un anticorps de l’enzyme de clivage de la chaîne latérale du cytochrome P450 (CYP11A) (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) une nuit à 4°c, lavé dans du PBS contenant 0,05% Tween 20 trois fois pendant 20 min, et incubé avec de L’anti-lapin de chèvre Alexa488 (1:500; Invitrogen) comme ci-dessus. Les sections ont finalement été contrecollées avec TO-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) dans du PBS pendant 5 min, lavées et montées dans un réactif antifade Gold slowfade (Invitrogen)., Pour tester la spécificité de L’anticorps PDE8A, la solution d’anticorps a été préincubée avec 2,5 µg/ml de peptide antigénique (biotechnologie de Santa Cruz) pendant 2 h à température ambiante avant la coloration. Certaines sections ont été incubées sans les anticorps primaires pour déterminer le fond en raison des anticorps secondaires. Les signaux immunomodulateurs ont été visualisés au microscope confocal (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). l’activité de la β-galactosidase, exprimée avec un signal de localisation nucléaire par le gène LacZ dans la cassette de ciblage, a été évaluée par coloration X-gal., Les sections ont d’abord été incubées avec un anticorps anti-CYP11A suivi d’un conjugué phosphatase alcaline anti-lapin (1:500; Invitrogen) et de NBT/BCIP (Roche) pour le développement de la couleur. La coloration X-gal a ensuite été réalisée comme décrit (40) dans le mélange X-gal à 37°C pendant la nuit. Les sections ont été lavées et montées avec une solution saline tamponnée au glycérol/Tris.
Purification des cellules de Leydig.
Les cellules de Leydig ont été isolées comme décrit dans ref. 41. Brièvement, les testicules de souris adultes ont été décapsulés et dispersés dans un bain d’eau agitant à 34°C pendant 10 min dans 10 ml de milieu 199 (M-199) avec 0.,25 mg/ml de collagénase D, 35 mU/ml de Dispase II et 6 µg/ml de DNase I. pour mettre fin à la dispersion tissulaire, 40 ml de 1% de BSA dans un milieu M-199 contenant 15 mm D’Hepes, 4 mM de bicarbonate de sodium et 25 µg/ml d’inhibiteur de trypsine de soja ont été ajoutés pour diluer la suspension initiale. Les Tubes ont ensuite été coiffés et inversés plusieurs fois. Les tubules séminifères ont été autorisés à se déposer par gravité et le surnageant contenant les cellules interstitielles a été collecté. La procédure a été répétée deux fois pour récolter davantage les cellules interstitielles., Les cellules ont été granulées dans des tubes de 50 ml par centrifugation à 800 × g pendant 20 min à 4°C, puis fractionnées en utilisant un gradient continu de Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) (Percoll à 55% dans HBSS tamponné avec des Hepes de 15 mM et un inhibiteur de trypsine de soja de 25 µg/ml) dans un volume total de 35 ml. Les gradients ont été formés in situ par centrifugation dans un rotor à angle fixe ja-20 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) À 23 700 × g pendant 30 min à 4°c. un tube contenant des billes de marqueur de densité (GE Healthcare) a été utilisé comme référence pour identifier les différentes couches de densité., Les cellules de Leydig ont été récupérées à partir d’une densité de 1,07 g/ml jusqu’au bas du gradient. Cinq volumes de HBSS ont été ajoutés pour diluer le Percoll, et les cellules ont été granulées à 200 × g pendant 10 min à 4°C. La pastille finale obtenue à partir de deux testicules, enrichie en cellules de Leydig, a été remise en suspension dans 4 ml de DMEM/F-12 additionné de 1% de BSA et utilisée immédiatement pour les expériences.
3β-Hydoxysteroid Déshydrogénase Dosage.
mesure de la production de testostérone.
Les cellules de Leydig ont été remises en suspension comme ci-dessus et des aliquotes de 100 µl ont été distribuées dans des plaques de 96 puits., Les cellules ont été stimulées dans un volume final de 150 µl avec les concentrations indiquées de LH recombinante pendant 3 h dans un incubateur à 5% de CO2 à 37°C. La LH humaine recombinante a été obtenue à partir du programme peptidique de L’Hormone nationale & (A. F. Parlow, Torrance, CA). La testostérone libérée dans le milieu d’échantillons cellulaires en double pour chaque concentration de LH a été mesurée à l’aide d’un kit d’analyse immunoenzymatique de Neogen (Lexington, KY).
toutes les données sont exprimées en moyenne ± écart-type., Les valeurs EC50 pour l’action de la LH sur la production de testostérone ont été calculées par ajustement non linéaire des courbes concentration-dépendance de la LH obtenues pour chaque préparation de cellules de Leydig à l’aide d’un logiciel (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). L’analyse statistique a été effectuée par le test T de Student. Les différences ont été considérées comme significatives à P < 0.05.