Madame Lelica

le concept du SSF

L’idée d’effectuer simultanément l’hydrolyse enzymatique et la fermentation a été avancée par Gauss et al. dans un brevet de 1976 ., Les auteurs ont déclaré que le rendement en glucose dans une hydrolyse enzymatique séparée traditionnelle (utilisant des enzymes produites par le champignon Trichoderma reesei) était faible, probablement en raison de l’inhibition de l’hydrolyse par le glucose et le cellobiose. Les auteurs ont cependant pu montrer qu’ils obtenaient un rendement global en éthanol plus élevé lors de L’utilisation du SSF, qu’ils attribuaient à l’élimination du glucose et du cellobiose par la fermentation, et à la libération conséquente d’inhibition du produit final., Le terme SSF (L’abréviation SSF est souvent utilisée également pour la fermentation à l’état solide) n’a pas été utilisé par les auteurs à l’époque, mais est devenu la notation commune pour ce processus en quelques années seulement après l’invention originale. L’évitement de l’inhibition du produit final reste probablement la raison la plus importante de L’utilisation du SSF, mais il existe plusieurs avantages potentiels supplémentaires. Gauss et ses collègues, ont mentionné par exemple l’avantage que le glucose n’a pas besoin d’être séparé de la fraction de lignine après une étape d’hydrolyse enzymatique séparée, évitant ainsi une perte potentielle de sucre., En outre, la combinaison de l’hydrolyse et de la fermentation diminue le nombre de cuves nécessaires et donc les coûts d’investissement. La diminution des investissements en capital a été estimée à plus de 20%. Ceci est très important, car on peut s’attendre à ce que les coûts en capital soient comparables aux coûts des matières premières dans la production d’éthanol à partir de lignocellulose . D’autres avantages, liés à la co-consommation de sucres pentose et hexose, et à la désintoxication sont apparus plus récemment, comme nous le verrons plus loin dans cette revue.,

inévitablement, il y a aussi des inconvénients du SSF par rapport au processus d’hydrolyse et de fermentation séparé (SHF). La température optimale pour l’hydrolyse enzymatique est généralement supérieure à celle de la fermentation – du moins lors de l’utilisation de la levure comme organisme fermentant. Dans un procédé SHF, la température de l’hydrolyse enzymatique peut être optimisée indépendamment de la température de fermentation, alors qu’un compromis doit être trouvé dans un procédé SSF. De plus, la levure ne peut pas être réutilisée dans un processus SSF en raison des problèmes de séparation de la levure de la lignine après fermentation., Par conséquent, la levure représentera nécessairement une perte de rendement dans un processus SSF, si la levure est produite à partir de glucides dans le processus (Voir Figure 1) ou un coût de fonctionnement si elle est fournie de l’extérieur. Les enzymes sont également difficiles à réutiliser, également dans un processus SHF. Les enzymes sont soit produites dans le processus (Voir Figure 1) – ce qui représente une perte de substrat-soit fournies à l’extérieur et augmentent ainsi les coûts chimiques., La Recirculation des enzymes est tout aussi difficile puisque les enzymes se lient au substrat, bien qu’une désorption partielle puisse être obtenue après addition de tensioactifs .

La disponibilité de matières premières lignocellulosiques varie en fonction de l’emplacement géographique (voir par ex., Kim et Dale), et les charges lignocellulosiques sont plutôt hétérogènes tant en termes de structure que de composition chimique (Voir tableau 1). Cette hétérogénéité a un fort impact sur la conception du processus, affectant pratiquement toutes les étapes du processus, à savoir la manipulation mécanique du matériau, les conditions de prétraitement, le choix des enzymes et des souches de levure, ainsi que la séparation et les propriétés de la lignine restante. Cela deviendra évident dans la discussion ci-dessous.,

prétraitement

le but du prétraitement est de modifier la structure lignocellulosique et d’augmenter le taux de l’hydrolyse enzymatique principalement de la cellulose. Cela devrait être fait avec une formation minimale de composés, qui inhibent les micro-organismes en fermentation . La surface accessible est considérée comme l’un des facteurs les plus importants affectant l’efficacité de la dégradation enzymatique de la cellulose ., Dans le bois natif, seule une petite fraction des capillaires de la paroi cellulaire est accessible aux enzymes . Le prétraitement, cependant, augmente la surface disponible de plusieurs façons; i) des fragments et des fissures se forment donnant une surface accrue , ii) la fraction hémicellulose est hydrolysée , ce qui diminue les effets de blindage, iii) la lignine subit également des changements structurels et le bois est délignifié à divers degrés, selon la technologie de prétraitement . Ainsi, le blindage des microfibrilles et l’occlusion des pores, causés par la lignine, peuvent être éliminés., D’autres facteurs, censés influencer la digestibilité dans SSF, sont la cristallinité du substrat et le degré de polymérisation (DP) .

Les méthodes de prétraitement peuvent être divisées en méthodes physiques et chimiques, et des combinaisons de ces deux méthodes sont couramment utilisées (voir par exemple la revue écrite par Mosier et al. ). Le type de matière première affecte fortement le choix de la méthode de prétraitement. L’hémicellulose est, par exemple, acétylée à un degré élevé dans les matériaux riches en xylane., Puisque l’acétate est libéré pendant l’hydrolyse, le prétraitement de ces matériaux est dans une certaine mesure autocatalytique et nécessite moins d’acide ajouté et des conditions de processus plus douces. Cependant, l’acétate libéré ajoute à la toxicité des hydrolysats d’hémicellulose.

le prétraitement AFEX (ammoniac fiber/freeze explosion) est considéré comme une méthode attrayante pour le prétraitement des résidus agricoles, produisant de la cellulose hautement digestible . AFEX dépolymérise la lignine, élimine l’hémicellulose et décristallise la cellulose ., La température et le pH modérés minimisent également la formation de produits de dégradation du sucre. Cependant, la méthode souffre de coûts élevés d’ammoniac ammoniac et de récupération . Dans ce contexte, la méthode de la chaux, à base d’hydroxyde de calcium (ou de sodium) doit également être mentionnée. Les prétraitements alcalins sont effectués à des températures plus basses pendant de longues durées de séjour, et comme pour la méthode AFEX, une délignification de la biomasse est obtenue.

l’explosion de vapeur est une méthode de prétraitement intensivement étudiée ., Les effets de l’explosion de vapeur non catalysée – et des prétraitements d’eau chaude liquide – sur la biomasse sont principalement attribués à l’élimination des hémicelluloses. En ajoutant un catalyseur acide, l’hydrolyse peut être encore améliorée . Les prétraitements acides dilués utilisant le H2SO4 ou le SO2 sont les méthodes de prétraitement les plus étudiées en raison de leur efficacité et de leur coût. Ces méthodes ont été appliquées dans des usines pilotes et sont donc sur le point d’être commercialisées . Le traitement catalysé par l’acide améliore l’élimination de l’hémicellulose , donne une hydrolyse partielle de la cellulose et modifie la structure de la lignine ., Les principaux inconvénients sont liés aux exigences de l’équipement de traitement et à la formation d’inhibiteurs . Jusqu’à présent, les prétraitements réussis avec alcali , AFEX et eau chaude liquide ont été limités aux résidus agricoles et aux cultures herbacées, tandis que les prétraitements à la vapeur catalysée par l’acide ont généré des rendements élevés en sucre à partir de ces matériaux ainsi que des matières premières de bois résineux .

Une simple quantification de la dureté d’un processus de prétraitement à la vapeur est le facteur de sévérité, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Pour les prétraitements catalysés par l’acide, le facteur de gravité combiné, log (CS), est parfois utilisé. Cela prend également en compte le pH, log(CS) = log (R0) – pH, et les valeurs typiques pour le prétraitement par explosion de vapeur catalysée par l’acide du bois résineux sont dans la gamme 2 à 4 .

Les conditions optimales de prétraitement dans un processus SSF ne diffèrent pas nécessairement beaucoup de celles d’un processus SHF utilisant de la biomasse lignocellulosique. Cependant, plusieurs composés présents dans les hydrolysats de prétraitement, qui inhibent l’hydrolyse enzymatique, sont convertis par les organismes fermenteurs., Ceci est une explication probable derrière les rendements d’éthanol plus élevés déclarés dans le SSF par rapport au SHF . La formation d’inhibiteurs à partir du prétraitement peut donc être tolérée dans une plus grande mesure dans un processus SSF. Les composés inhibiteurs peuvent être classés en trois groupes principaux: les furaldéhydes, les acides faibles et les composés phénoliques. Les deux furaldéhydes les plus courants, le HMF (5-hydroxyméthyl-2-furaldéhyde) et le furfural (2-furaldéhyde), sont formés dans des conditions sévères à partir d’hexoses et de pentoses, respectivement ., Les acides faibles des matériaux lignocellulosiques, tels que l’acide acétique, formique et lévulinique, sont principalement formés par désacétylation de l’hémicellulose ou de la dégradation de L’HMF . Les composés phénoliques se forment principalement lors de la dégradation de la lignine et se trouvent dans de nombreuses variantes, selon le type de lignine . Pour une discussion plus approfondie sur l’inhibition, voir par exemple L’examen D’Almeida et al.

hydrolyse enzymatique

un prétraitement réussi a dans une large mesure éliminé l’hémicellulose, laissant la cellulose disponible pour l’hydrolyse., Étant donné que les micro-organismes les plus couramment utilisés pour la production d’éthanol utilisent uniquement des monomères de sucre, la cellulose doit être hydrolysée, ce qui dans un SSF se produit concomitamment avec la fermentation. Historiquement, la digestion industrielle de la cellulose a été réalisée par hydrolyse acide et l’optimisation de l’hydrolyse acide de divers matériaux lignocellulosiques a été réalisée à des fins de production d’éthanol ., L’hydrolyse acide, cependant, produit des hydrolysats qui sont relativement toxiques pour les micro-organismes fermentants, et le rendement maximal en glucose est limité à environ 60% dans un processus par lots pour des raisons cinétiques . La dégradation enzymatique de la fraction cellulosique, en revanche, a le potentiel de donner des hydrolysats relativement non toxiques avec des rendements en sucre plus élevés.

Enzymes spécialisées dans la rupture du β-1-4-les liaisons glycosidiques du glucane sont collectivement appelées cellulases. En 1950, Reese et al ont présenté un modèle d’hydrolyse enzymatique de la cellulose basé sur plusieurs enzymes (C1 et CX)., L’enzyme C1 a été supposée produire des chaînes polyanhydro-glucose plus courtes, tandis que la solubilisation a été attribuée à l’enzyme CX. Fondamentalement, la même image s’applique aujourd’hui, mais il y a eu un énorme progrès dans la connaissance de tous les différents composants enzymatiques spécifiques impliqués. Les cellulases sont divisées en trois sous-catégories, représentant trois types d’activité: les endoglucanases, les exoglucanases (cellobiohydrolases) et les β-glucosidases., Les Endoglucanases réduisent significativement le degré de polymérisation du substrat en attaquant aléatoirement les parties intérieures, principalement dans les régions amorphes de la cellulose. Les Exoglucanases (ou cellobiohydrolases), d’autre part, raccourcissent progressivement les molécules de glucane en se liant aux extrémités de glucane et en libérant principalement des unités de cellobiose. Enfin, Les β-glucosidases divisent le cellobiose disaccharidique en deux unités de glucose.,

Plusieurs types de micro-organismes peuvent produire des systèmes de cellulase, y compris les champignons filamenteux aérobies, les actinomycètes aérobies, les bactéries hyperthermophiles anaérobies et les champignons anaérobies (voir par exemple l’examen de Lynd et al. ). Des recherches intensives sur les champignons filamenteux aérobies T. reesei au cours des dernières décennies ont abouti à un organisme producteur de cellulase efficace, qui domine actuellement la production industrielle de cellulase .

comme déjà mentionné, un avantage important avec SSF par rapport à SHF est la réduction de l’inhibition du produit final par les sucres formés dans l’hydrolyse., Le produit de fermentation l’éthanol inhibe également l’hydrolyse, mais dans une moindre mesure que le cellobiose ou le glucose . Un autre avantage est que les inhibiteurs du prétraitement peuvent être métabolisés par les micro-organismes . Cependant, le processus SSF peut également souffrir d’une hydrolyse incomplète de la fraction lignocellulosique solide. À l’exception de l’inhibition par les produits finaux ou d’autres composants , cela peut être dû à la désactivation enzymatique, à l’adsorption enzymatique improductive , à la diminution de la disponibilité des extrémités de la chaîne et à l’augmentation de la cristallinité avec la conversion de la cellulose prétraitée .,

dans un SSF industriel, les concentrations d’enzymes et de cellules doivent être équilibrées de manière appropriée afin de minimiser les coûts de production de levures et d’enzymes. Les Synergies entre les enzymes, par exemple la synergie endo-exo , la synergie exo-exo et la synergie entre les endo – ou exoglucanases et les β-glucosidases , devraient également être optimisées en ajustant la composition des mélanges enzymatiques. La composition optimale dépendra très certainement de la matière première lignocellulosique.,

microorganismes de fermentation

Les Exigences générales sur un organisme à utiliser dans la production d’éthanol est qu’il doit donner un rendement élevé en éthanol, une productivité élevée et être capable de résister à des concentrations élevées d’éthanol afin de maintenir les coûts de distillation bas . En plus de ces exigences générales, la tolérance aux inhibiteurs, la tolérance à la température et la capacité d’utiliser plusieurs sucres sont essentielles pour les applications SSF. La tolérance à de faibles valeurs de pH minimisera le risque de contamination., Le cheval de bataille dans la production d’éthanol à base d’amidon ou de saccharose est la levure de boulangerie commune, Saccharomyces cerevisiae. Cet organisme produit de l’éthanol à un rendement élevé (supérieur à 0,45 g g-1 dans des conditions optimales) et à un taux spécifique élevé (jusqu’à 1,3 G G-1 masse cellulaire h-1 ). Il a également une tolérance à l’éthanol très élevée, plus de 100 g L-1 a été rapporté pour certaines souches et milieux . En outre, l’organisme s’est avéré être robuste à d’autres inhibiteurs, et par conséquent il convient à la fermentation de matériaux lignocellulosiques .,

L’hémicellulose provenant de feuillus et de résidus agricoles est généralement riche en xylanes (cf. Tableau 1) – feuillus contenant principalement de L’O-acétyl-4-O-méthyl-glucuronoxylan, alors que les graminées contiennent de l’arabinoxylane . L’hémicellulose de résineux, en revanche, contient plus de mannans-principalement sous forme de galactoglucomannane-et moins de xylane. La fermentation du Mannose est normalement efficace en S., cerevisiae, alors que la capacité de fermenter le galactose dépend de la souche , et les gènes d’utilisation du galactose sont en outre réprimés par le glucose, conduisant à une utilisation séquentielle typique des sucres. De toute évidence, la fermentation du xylose est un problème plus important pour les résidus agricoles et les feuillus que pour les résineux. Le Xylose n’est pas métabolisé par S. cerevisiae de type sauvage, à l’exception d’une réduction mineure en xylitol. Ceci, et pour certaines parties la tolérance à la température, ont été la principale raison derrière l’intérêt de tester également d’autres micro-organismes pour la conversion de la lignocellulose dans SSF.,

les levures naturellement fermentées au xylose, telles que Pichia stipitis et Candida shehatae , pourraient potentiellement être avantageuses à utiliser dans le SSF de matériaux à haute teneur en xylane. Cependant, leur tolérance aux composés inhibiteurs dans les hydrolysats de lignocellulose non oxydés est plutôt faible et, de plus, un apport d’oxygène très faible et bien contrôlé est nécessaire pour une fermentation efficace du xylose . Les principaux » concurrents  » de la levure ont été les bactéries Zymomonas mobilis et Escherichia coli génétiquement modifiées. Z., mobilis, une bactérie anaérobie obligatoire, qui n’a pas de système fonctionnel pour la phosphorylation oxydative, produit de l’éthanol et du dioxyde de carbone comme principaux produits de fermentation. Fait intéressant, Z. mobilis utilise la voie Entner-Duodoroff qui donne une production D’ATP plus faible par glucose catabolisé . Cela donne à son tour un rendement en biomasse plus faible et un rendement en éthanol plus élevé sur le glucose par rapport à S. cerevisiae . Cependant, z. mobilis de type sauvage n’a pas la capacité de fermenter les sucres de pentose, et un inconvénient majeur est en outre qu’il ne s’agit pas d’un organisme très robuste., En général, les bactéries semblent moins tolérantes aux inhibiteurs dérivés de la lignocellulose, et une étape de désintoxication peut être nécessaire avant la fermentation. Contrairement à la levure de boulangerie et à Z. mobilis, E. coli est capable de métaboliser une grande variété de substrats (y compris les hexoses, les pentoses et le lactose), mais l’organisme de type sauvage a une voie fermentative mixte et est donc un mauvais producteur d’éthanol. Dans une contribution historique, attribué numéro de brevet américain 5000000, une souche de E., coli a été génétiquement transformé en un producteur d’éthanol par surexpression de PDC (codant pour la pyruvate décarboxylase) et d’adhB (codant pour l’alcool déshydrogénase) de Z. mobilis . D’excellents résultats ont été obtenus avec E. coli recombinant, par exemple la souche KO11, qui a montré des rendements en éthanol de 86 à près de 100% des concentrations théoriques et finales d’éthanol jusqu’à 40 g L-1 sur les hydrolysats hémicellulosiques de bagasse, de stover de maïs et de coques de maïs ., Cependant, seule la fraction liquide a été utilisée dans les études signalées, et les hydrolysats ont en outre été détoxifiés avant l’utilisation par une surlimation à pH 9 avec de l’hydroxyde de calcium, puis ajustés à pH 6,0–6,5 avec du HCl. De plus, comme le pH optimal est de 6,5, E. coli est moins adapté aux processus SSF avec des cellulases T. reesei, qui sont généralement considérées comme ayant un pH optimal autour de 4,8 .

fermentation du Pentose par S. cerevisiae d’ingénierie

En raison des propriétés très attrayantes de S., cerevisiae dans les fermentations industrielles, des efforts importants ont été déployés au cours des dernières décennies pour concevoir des souches recombinantes de xylose et d’arabinose de cette levure. Les souches de S. cerevisiae fermentant le Xylose peuvent en principe être construites soit en introduisant des gènes codant pour la xylose isomérase (XI) à partir de bactéries et de champignons , soit en introduisant des gènes codant pour la xylose réductase (XR) et la xylitol déshydrogénase (XDH) à partir de champignons . De plus, le gène endogène xks1 codant la xylulokinase (XK) doit être surexprimé pour obtenir une fermentation significative du xylose ., Les protéines de Transport sont nécessaires pour l’absorption du xylose, ainsi que d’autres sucres dans la levure. Chez S. cerevisiae, le xylose a été transporté par les transporteurs hexose, mais l’affinité pour le xylose est environ 200 fois plus faible que pour le glucose . Par conséquent, l’absorption de xylose est inhibée de manière compétitive par le glucose.

il existe 20 gènes différents codant pour les protéines liées au transport du sucre, 18 systèmes individuels (Hxt1-17 et Gal2) et deux protéines de signal connexes (Snf3p et Rgt2p)., Les transporteurs présentent des affinités différentes pour les sucres, et l’expression de leurs gènes correspondants est régulée par les concentrations de sucre, c’est-à-dire la disponibilité de la source de carbone . Il a déjà été suggéré que le xylose est absorbé par les systèmes de transporteurs de glucose à haute et à faible affinité (Figure 2), mais l’absorption est augmentée en présence de faibles concentrations de glucose . Des études ont indiqué que les transporteurs hexose à affinité élevée et intermédiaire; Hxt4, Hxt5 Hxt7 et Gal2 sont en fait les transporteurs les plus importants pour le xylose ., En outre, il a été démontré qu’une faible concentration de glucose (mais non nulle) est nécessaire dans le milieu pour une absorption efficace du xylose . Cela a été expliqué par un besoin de glucose pour l’expression des enzymes glycolytiques et des intermédiaires , ainsi que la génération de métabolites intermédiaires pour les étapes initiales du métabolisme du xylose et de la voie du pentose phosphate . Une autre explication possible, déduite à la fois des expériences et de la modélisation informatique, est que le glucose est nécessaire pour l’expression de transporteurs d’hexose ayant des propriétés favorables de transport de xylose, par exemple Hxt4 ., Par conséquent, afin d’obtenir une co-fermentation efficace du xylose et du glucose dans le SSF (parfois noté SSCF – saccharification et co-fermentation simultanées) avec S. cerevisiae recombinant, il est nécessaire de maintenir la concentration de glucose faible, ce qui a été démontré dans la pratique dans les études récentes du SSF .