Madame Lelica

la Structure de L’ACLY avec le CoA révèle des conformations productives et improductives du CoA

Nous avons produit de l’ACLY recombinant sur toute la longueur chez Escherichia coli pour toutes nos analyses biochimiques et structurelles (Données étendues Fig. 1 bis, b)., La fluorimétrie différentielle à balayage de l’enzyme avec différents cofacteurs a confirmé la liaison et les changements structurels potentiels associés aux ligands ajoutés seuls ou en combinaison (Données étendues Fig. 1c). Nous avons utilisé ces données pour guider la détermination de la structure D’ACLY avec ses co-substrats ou co-produits.

Nous avons préparé la protéine recombinante et avons d’abord effectué une analyse par coloration négative de la protéine en l’absence de métabolites (ACLY-apo)., Les moyennes de classe bidimensionnelle (2D) de 3 000 particules ont confirmé que la protéine formait un tétramère (Données étendues Fig. 2 bis, b). Pour obtenir plus de détails structurels, nous avons effectué une étude cryo-EM sur le complexe ACLY–citrate-CoA. Après plusieurs séries d’optimisation des échantillons cryo-EM, nous avons déterminé la structure Cryo-EM symétrique D2 de la structure ACLY–citrate-CoA à une résolution globale moyenne de 3,0 Å. (Données Étendues Fig. 2c,d, 3 et 4 et Tableau 1).,

la structure ACLY–citrate-CoA forme un homotétramère avec un module CSH tétramérique central et deux domaines ASH aux extrémités opposées du module CSH (protomères 1 & 2 et 3 & 4) (Fig. 1 bis, b). Le domaine ASH (résidus 1-806) adopte une structure très similaire à l’architecture α/β précédemment rapportée du domaine n-terminal isolé lié au citrate et à L’ADP24., Le domaine CSH (résidus 859-1101) est composé exclusivement d’hélices et de boucles courtes, avec une homologie structurelle à un dimère de dimères de citrate synthase qui se croisent à des angles de ~90° (Données étendues Fig. 5a). Les domaines ASH et CSH de chaque chaîne polypeptidique sont reliés par une région de bobine de ~50 résidus largement étendue, à l’exception d’une courte hélice α entre les résidus 824 et 829. La région hélicoïdale de cet éditeur de liens est le seul point de contact significatif (par interaction de van der Waals) entre les deux domaines de cendres d’un côté de la molécule., L’éditeur de liens étendu permet au CSH d’une sous-unité d’interagir avec le domaine ASH d’une autre sous-unité à travers le côté opposé du module CSH. Contrairement aux interactions relativement rares entre les protomères de cendres, les domaines CSH forment un vaste réseau d’interactions principalement de van der Waals, ce qui suggère que les domaines CSH fonctionnent comme un module tétramérique rigide, tandis que les quatre domaines de cendres sont plus flexibles. Ceci est cohérent avec l’estimation de la résolution locale EM observée sur la carte EM étant la plus élevée au domaine CSH (2,8 Å, Données étendues Fig., 4c) et nos observations précédentes que le domaine CSH a une température de fusion plus élevée par rapport aux cendres de ~75 °C contre ~55 °C, respectivement21.

COA lie à l’interface entre les domaines CSH et ASH des sous-unités distinctes et semble « agrafer » les superdomains ensemble. La base adénine et le cycle ribose interagissent avec le domaine CSH d’un monomère et le bras pantothénique et le Groupe β-mercapto se collent dans le site actif du domaine ASH d’une autre sous-unité (Fig. 1c (à gauche) et Fig. 1d (à gauche))., La modélisation du CoA est basée sur l’observation que le Groupe ADP phosphorylé est bien résolu dans la densité cryo-EM. Cependant, le groupe mercapto n’était pas bien résolu, suggérant une flexibilité de cette région. Bien que plusieurs résidus des domaines CSH et ASH produisent des interactions de van der Waals avec le CoA, les liaisons hydrogène S574, R576 et S577 du domaine ASH et K964 du domaine CSH vers les oxygènes du ribose phosphate semblent jouer un rôle particulièrement important dans l’agrafage du CoA à l’interface ASH–CSH., Fait intéressant, E599 se trouve à une distance de liaison hydrogène de l’atome de soufre modélisé du CoA, ce qui implique qu’il pourrait jouer un rôle catalytique important. L’importance des interactions protéine–CoA du domaine ASH et CSH est soutenue par la sensibilité mutationnelle des résidus R576 et K964, et le rôle catalytique potentiel de E599 est soutenu par sa sensibilité mutationnelle à A ou Q mais pas à D (Fig. 1f). Bien que le citrate ait été inclus dans l’échantillon pour la reconstruction cryo-EM, il n’a pas pu être résolu avec confiance dans la carte cryo-EM.,

compte tenu de la densité non résolue pour le groupe mercapto de CoA, nous avons effectué une autre reconstruction de la structure ACLY–citrate-CoA sans imposer de symétrie D2 pour déterminer si le CoA pourrait adopter des conformations différentes dans différents protomères. Nous avons pu préparer une reconstruction sans imposer de symétrie (C1, asymétrique fermée) à une résolution nominale de 3,5 Å. Dans cette structure fermée asymétrique ACLY-citrate-CoA-C1, la résolution autour du domaine ASH est plus faible que dans la structure D2, mais la résolution locale autour du domaine CSH reste relativement élevée, de 2,8 à 3,2 Å., L’analyse de cette structure fermée asymétrique ACLY–citrate-CoA-C1 a révélé que chacun des domaines ASH, ainsi que trois des quatre domaines CSH et molécules CoA, adoptaient la même configuration que la structure D2. Cependant, l’une des molécules de CoA adopte une conformation alternative dans laquelle la fraction ADP phosphorylée est décalée ~8 Å vers le module CSH et le bras pantothénique est plié pour interagir avec le CSH (Fig. 1b, c (à droite) et Fig. 1e). La densité cryo-EM correspondant à cette conformation alternative de CoA est très claire (Fig. 1c (à droite))., Remarquablement, la densité cryo-EM est également observée pour une molécule d’eau bien ordonnée, qui semble relier les interactions de liaison hydrogène entre l’atome de soufre terminal du CoA avec les résidus de chaîne latérale de H900, D1026 et R1065 avec des interactions van der Waals supplémentaires de L969, I973, H975 et R976 (Fig. 1d (à droite)). Concomitant à cette conformation alternée de CoA, une boucle dans le domaine CSH (résidus 965-986) et les hélices flanquantes se décalent pour s’adapter à la position alternée de la base adénine CoA (Fig. 1e)., Les Mutations de H975, R976, D1026 et R1065 en alanine montrent toutes une activité compromise, suggérant que la liaison du CoA au domaine CSH est en quelque sorte impliquée dans l’activité enzymatique (Fig. 1f). Étant donné que le CoA doit réagir avec le citrate dans le domaine des cendres, nous nous référons aux conformations du CoA avec la cystéamine du bras pantothénique qui pointe vers les cendres et le CSH comme des conformations de CoA « productives » et « improductives », respectivement, liées à ACLY.,

la Structure de la sous–population ACLY-citrate-CoA révèle des orientations asymétriques des cendres

en plus de la population majeure de particules ACLY–citrate-CoA, représentant 57% des particules de classe 3, une sous–population de particules complexes acly-citrate-CoA représentant 23% de la sous-classe des particules (10% au total) a également été capturée dans une reconstruction 3D sans imposer de symétrie à une résolution de 4,3 Å (Données étendues Fig. 3)., Cette sous-population de particules a une structure globale qui est similaire à la population principale D’ACLY–citrate-CoA, sauf que l’un des quatre domaines de cendres est tourné d’environ 50° vers sa sous–unité de cendres la plus proche pour adopter une conformation plus « ouverte », nous l’appelons donc « acly-citrate-CoA-C1 asymm open ». Dans cette structure, la densité n’est visible que pour la fraction ADP phosphorylée de deux molécules de CoA liées à deux des domaines de cendres symétriques (Fig. 2 bis, b). L’une des sous-unités ASH symétrique et asymétrique ne montre aucune preuve de liaison au CoA., Notamment, le domaine Ash asymétrique semble incompatible avec la liaison COA productive (Fig. 2c). Nous proposons que cette structure ouverte asympm ACLY–citrate-CoA-C1 représente un état intermédiaire D’ACLY, où deux sites actifs sont amorcés pour la catalyse et deux ne le sont pas. L’observation de cette structure suggère également que les quatre sites ACLY actifs peuvent fonctionner indépendamment.

la Structure de L’état ACLY-apo est défavorable à la liaison CoA

étant donné les interactions limitées entre les domaines CSH et ASH, nous nous sommes enquis de la structure de L’ACLY en l’absence de ligands liés. Pour ce faire, nous avons déterminé la structure cryo-EM D’ACLY sous la forme apo, que nous avons pu résoudre à une résolution de 4,3 Å (Données étendues Fig. 4a et tableau 1)., Une comparaison des structures ACLY-apo et acly–citrate-CoA révèle que, à l’état apo, chacune des paires de cendres aux extrémités opposées du tétramère est tournée l’une vers l’autre de ~10° pour former un tétramère ACLY plus ouvert et placer les domaines de cendres dans des positions qui semblent défavoriser la liaison COA productive (Fig. 3). Plus précisément, les boucles de cendres centrées sur F533, S574 et K1018 (du domaine CSH adjacent) entreraient en conflit avec le CoA lié dans la structure ACLY–citrate-CoA (Fig. 3b)., En outre, les deux résidus qui se trouvent dans la distance de liaison hydrogène au CoA du domaine des cendres, R576 et E599, sortent de la distance de liaison hydrogène dans la structure ACLY-apo (Fig. 3c). Pendant ce temps, le module CSH reste largement inchangé entre les deux structures. Ensemble, une comparaison des structures ACLY-apo et acly–citrate-CoA révèle que la structure ACLY-apo doit se réorganiser pour accueillir le substrat CoA.

le complexe ACLY–acétyl-CoA–OAA révèle que la réaction COA–citrate lyase se produit dans le domaine ASH

Les données de fluorimétrie différentielle à balayage ont révélé que les produits acétyl-CoA et OAA stabilisaient la protéine ACLY (Données étendues Fig. 1c)., Cette découverte a indiqué que nous pourrions capturer le complexe de produits ACLY–OAA–acétyl-CoA, et ainsi mieux comprendre le mécanisme réactionnel. À cette fin, nous avons déterminé la structure cryo-EM du complexe, que nous avons résolue à une résolution de 3,1 Å en utilisant la symétrie D2 (Données étendues Fig. 4). La structure globale du complexe acly–co-produit était la plus similaire à celle du complexe symétrique acly–Co-substrat (acly–citrate-CoA-D2), avec un écart global racine-moyenne-carré (R. M. S. D.) de 0,407 Å pour les atomes de Ca (Fig. 4a)., Nous avons constaté que l’acétyl-CoA occupait le même site de liaison que le CoA et était également stabilisé par les mêmes résidus basiques, R576 et K964 (Fig. 4b). De plus, nous avons pu modéliser sans ambiguïté deux molécules OAA liées à chaque sous-unité ACLY (Fig. 4b, c). Une molécule D’OAA (OAA1) chevauche la poche de liaison au citrate dans le domaine des cendres et proximale au groupe acétyle de l’acétyl-CoA. OAA1 fait des interactions relativement modestes avec la protéine, y compris des liaisons hydrogène avec N346 et T348 et des interactions de van der Waals avec F547., L’autre molécule OAA (OAA2) est liée au domaine CSH et fait des interactions plus étendues avec ACLY que OAA1. OAA2 entre en contact avec le module CSH par des liaisons hydrogène vers H900, D1026, R1065 et R1085 et par des interactions de van der Waals vers F935 et F1061 à partir d’une sous-unité, ainsi que par une liaison hydrogène vers R1065 à partir d’une autre sous-unité (fig. 4c). OAA2 chevauche bien avec OAA lié dans le synthase25 de citrate de coeur de porc (Données étendues Fig. 5b).

Nous avons également affiné la carte cryo-EM de la structure ACLY–OAA–acétyl-CoA sans contraintes de symétrie et obtenu une structure identique avec symétrie D2, sauf que l’une des quatre molécules d’acétyl-CoA a montré deux conformations possibles du bras pantothénique cystéamine de COA vers le domaine ash, comme dans les trois autres protomères, et l’autre vers le domaine CSH (données étendues Fig. 6a)., Cependant, contrairement à la conformation alternative du CoA trouvée dans la structure ACLY–citrate-CoA, la position du Groupe ADP phosphorylé n’a pas changé dans ces deux conformations. La conformation alternative potentielle de l’acétyl-CoA pourrait suggérer une voie possible de libération du substrat dans le renouvellement de l’enzyme ou un État autoinhibiteur de l’enzyme (discuté ci-dessous).

L’observation des produits OAA1 et acétyl-CoA dans le domaine des cendres suggère fortement que la chimie de la lyase y est réalisée, contrairement aux propositions précédentes selon lesquelles cette chimie est réalisée dans le domaine CSH22,23., Nous supposons que L’OAA2 peut aider à organiser le domaine CSH pour coopérer avec le domaine ASH et / ou agir comme un deuxième site autoinhibiteur de produit OAA qui pourrait séquestrer le bras pantothénique de l’acétyl-CoA (ou la cystéamine du CoA) pour s’asseoir à travers le domaine CSH, de sorte que la liaison mutuellement exclusive du CoA dans une conformation productive est inhibée à des concentrations élevées d’OAA cellulaires (Données étendues Fig. 6a)., Il est intéressant de noter que l’orientation prolongée productive du CoA avec la cystéamine pointant vers le domaine des cendres ne peut pas être modélisée en ACLY-apo sans conflit stérique significatif (Fig. 2b), l’orientation inversée avec la cystéamine pointant vers le domaine CSH peut (Données étendues Fig. 6b). Ceci est cohérent avec nos conclusions selon lesquelles le CoA est capable de se lier à ACLY en l’absence de citrate et/ou D’ATP (données non présentées), mais nous proposons une conformation courbée, telle qu’observée dans l’un des protomères ACLY–citrate-CoA-C1 (Fig. 1c (à droite) et Fig., 1d (à droite)) et aussi la structure isolée du domaine CSH22.

conformément à l’hypothèse selon laquelle L’OAA2 pourrait servir de site AUTO-inhibiteur de L’ACLY, une étude antérieure a montré que L’OAA est capable d’inhiber L’ACLY du foie de rat d’une manière non compétitive avec le citrate26. Pour valider la signification fonctionnelle des deux sites OAA observés dans la structure ACLY–OAA–acétyl-CoA, nous avons utilisé une expérience de trempe par fluorescence à l’état stationnaire., Comme expérience témoin, nous avons d’abord titré Le citrate en ACLY en l’absence ou en présence d’une concentration saturante de CoA et avons pu adapter les données à un site de liaison au citrate avec des valeurs Kd de 3,4 ± 0,5 µM et 1,4 ± 0,3 µM en l’absence ou en présence de CoA, avec de bonnes valeurs R2 de 0,92 et 0,84, respectivement (Fig. 4d). Ceci est cohérent avec le site de liaison au citrate observé dans la structure cristalline du domaine ACLY ASH liée au citrate13 et la structure cristalline de l’ACLY intact lié au CoA et au citrate22, montrant que le CoA stabilise la liaison au citrate dans le domaine ACLY ASH22., Nous avons ensuite titré OAA en ACLY et avons constaté que les données correspondaient beaucoup mieux à un modèle à deux sites (R2 = 0,99) qu’à un modèle à un site (R2 = 0,93) (Fig. 4e). Le modèle de liaison à deux sites tient mieux compte de la diminution de la fluorescence biphasique qui apparaît à des concentrations D’OAA plus élevées et donne lieu à un site de liaison à l’OAA de haute affinité (Kd = 15 ± 4 µM) qui représente le tiers du changement de fluorescence total et à un site de liaison à l’OAA de faible affinité (KD = 1 300 ± 500 µM) qui représente les deux tiers restants du changement de fluorescence totale (Fig. 4e)., Ces données concordent avec la pertinence fonctionnelle des deux sites de fixation de L’OAA observés dans la structure ACLY–OAA–acétyl-CoA.

ACLY-E599 est en mesure de fonctionner comme un résidu catalytique important

la structure du co–produit ACLY nous a permis de répondre à une question de longue date sur le mécanisme moléculaire ACLY. ACLY est proposé pour cliver l’intermédiaire citryl-CoA à l’aide d’une base générale pour extraire un proton du substrat citrate et/ou un acide général pour reprotoner le groupe OAA sortant 16,27,28., Ceci est compatible avec une analyse de profil de taux de pH D’ACLY avec un pKa de ~8,5 (Fig. 5a). Nous émettons l’hypothèse que L’e599 conservé évolutivement est positionné pour jouer un rôle catalytique important, en tant que base générale et/ou acide, et/ou pour stabiliser l’intermédiaire phospho-citryl-CoA (voir section suivante et Fig. 4b). Un pKa relativement élevé pour un résidu de glutamate enterré a été noté antérieurement29. En accord avec un rôle catalytique important pour E599, nous avons constaté que les mutants E599A et E599Q avaient une activité significativement compromise (Fig. 1f), même si la liaison au cofacteur n’a pas été affectée (Fig. 5b)., En revanche, nous avons constaté qu’un mutant e599d de même acide présentait une activité similaire à celle de WT ACLY (Fig. 1f), avec un profil de taux de pH similaire (fig. 5a). Prises ensemble, les données plaident en faveur de L’importance de E599 pour la catalyse par ACLY.

la catalyse ACLY passe par un intermédiaire phospho-citryl-CoA dans le domaine des cendres

l’identification du E599 comme résidu catalytique important pour le clivage de l’adduit citryl-CoA en acétyl-CoA et en produits OAA nous a fourni possibilité de piéger un intermédiaire réactionnel d’un mutant acly-e599q en présence des co-substrats ATP, citrate et coa., Nous avons donc mélangé le mutant ACLY-E599Q avec des concentrations saturantes d’ATP, de citrate et de CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA) et déterminé sa structure cryo-EM, que nous avons pu résoudre à une résolution globale de 2,85 Å. La structure a été déterminée en imposant une symétrie D2 et a révélé que les domaines ASH et CSH D’ACLY étaient disposés de manière similaire aux structures ACLY–citrate-CoA et ACLY–OAA–acétyl-CoA avec des valeurs R. M. S. D. pour les atomes de Ca de 0,584 et 0,620 Å, respectivement., Cependant, contrairement à ces Autres complexes de substrat et de produit, le complexe ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA a révélé une densité cryo-EM remarquablement bien définie dans le site actif du domaine des cendres, qui pourrait être modélisée sous forme D’ADP (ATP hydrolysé) et d’un intermédiaire phospho-citryl-CoA (Fig. 6 bis, b). De plus, contrairement à chacune des autres structures ACLY rapportées dans cette étude, la boucle de l’acide aminé 752-767 abritant le résidu H760, qui a été montrée comme médiateur du transfert de phosphate de L’ATP au citrate, est bien ordonnée dans la structure ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA (Fig. 6c)., De plus, on observe qu’un ion magnésium ou molécule d’eau, également proposé pour stabiliser H760, est lié à E599 et au groupe phosphate (Fig. 6c). Cette observation suggère que le résidu His760, le groupe phosphate et l’ion magnésium peuvent coopérer pour stabiliser le citrate en vue de la ligature en CoA dans le site actif du domaine des cendres. De plus, le fait que les produits acétyl-CoA et OAA ne soient pas observés dans cette structure confirme en outre nos conclusions selon lesquelles L’E599 joue un rôle catalytique important dans le clivage de l’intermédiaire phospho-citryl-CoA avec les produits acétyl-CoA et OAA dans le domaine des cendres.,