Madame Lelica

O SSF conceito

A idéia de realizar a hidrólise enzimática e fermentação, simultaneamente, foi proposto por Gauss et al. em uma patente de 1976 ., Os autores afirmaram que o Rendimento da glucose numa hidrólise enzimática tradicional separada (utilizando enzimas produzidas pelo fungo Trichoderma reesei) era baixo, provavelmente devido à inibição do produto final da hidrólise pela glucose e pela celobiose. Os autores poderiam, no entanto, mostrar que obtiveram um maior rendimento global de etanol ao utilizar SSF, o que atribuíram à remoção de glicose e celobiose pela fermentação, e à consequente libertação de inibição do produto final., O termo SSF (a abreviatura SSF é muitas vezes usada também para fermentação em estado sólido) não foi usado pelos autores na época, mas tornou-se a notação comum para este processo dentro de apenas alguns anos a partir da invenção original. A prevenção da inibição do produto final ainda é provavelmente a razão mais importante para a utilização de SSF, mas existem várias vantagens potenciais adicionais. Gauss e colegas de trabalho, mencionaram, por exemplo, a vantagem de que a glucose não precisa de ser separada da fracção de lignina após uma fase de hidrólise enzimática separada, evitando assim uma potencial perda de açúcar., Além disso, a combinação de hidrólise e fermentação diminui o número de navios necessários e, consequentemente, os custos de investimento. Estima-se que a diminuição do investimento de capital seja superior a 20%. Isto é muito importante, uma vez que se pode esperar que os custos de capital sejam comparáveis aos custos da matéria-prima na produção de etanol a partir de lignocelulose . Outras vantagens, relacionadas com o co-consumo de pentose e de açúcares hexose, e a desintoxicação tornaram-se mais recentes, como será discutido mais tarde nesta revisão.,inevitavelmente, há também desvantagens do SSF em comparação com o processo separado de hidrólise e fermentação (SHF). A temperatura ideal para a hidrólise enzimática é tipicamente superior à da fermentação-pelo menos quando se utiliza a levedura como organismo fermentador. Em um processo SHF, a temperatura para a hidrólise enzimática pode ser otimizada independentemente da temperatura de fermentação, enquanto um compromisso deve ser encontrado em um processo SSF. Além disso, a levedura não pode ser reutilizada num processo SSF devido aos problemas de separação da levedura da lignina após a fermentação., Por conseguinte, a levedura representará necessariamente uma perda de rendimento num processo SSF, se a levedura for produzida a partir de hidratos de carbono dentro do processo (ver Figura 1) ou um custo de funcionamento se for fornecida externamente. As enzimas são igualmente difíceis de reutilizar, também em um processo SHF. As enzimas são produzidas dentro do processo (ver Figura 1) – representando assim uma perda de substrato – ou são fornecidas externamente e, assim, adicionam aos custos químicos., A recirculação das enzimas é igualmente difícil, uma vez que as enzimas se ligam ao substrato, embora possa ser obtida uma dessorção parcial após a adição de tensioactivos .

a disponibilidade de matérias-primas lignocelulósicas varia dependendo da localização geográfica (ver ex., Kim and Dale ), and the lignocellulosic feedstocks are rather heterogeneous in terms of both structure and chemical composition (see Table 1). Esta heterogeneidade tem um forte impacto na concepção do processo, afectando praticamente todas as etapas do processo, ou seja, o manuseamento mecânico do material, as condições de pré-tratamento, a escolha das enzimas e das estirpes de levedura, bem como a separação e as propriedades da lignina restante. Isso se tornará evidente na discussão abaixo.,

pré-Tratamento

O objetivo do pré-tratamento é alterar a estrutura lignocelulósica e aumentar a taxa de hidrólise enzimática, principalmente a celulose. Isto deve ser feito com uma formação mínima de compostos, que inibem os microrganismos fermentadores . A área de superfície acessível é considerada como um dos fatores mais importantes que afetam a eficácia da degradação da celulose enzimática ., Em madeira nativa, apenas uma pequena fração dos capilares da parede celular são acessíveis às enzimas . Pré-tratamento, no entanto, aumenta a área disponível de várias formas ; i) fragmentos e rachaduras são formadas, produzindo aumento da área , ii) a fração hemicelulose é hidrolisadas, o que diminui efeitos de blindagem , iii) a lignina também passa por mudanças estruturais e a madeira é delignified, em diversos graus, dependendo da tecnologia de pré-tratamento . Assim, a blindagem de microfibrils e oclusão de poros, causada por lignina, pode ser removido., Outros fatores, que se acredita influenciarem a digestibilidade em SSF, são a cristalidade do substrato e o grau de polimerização (DP) .

os métodos de pré-tratamento podem ser divididos em métodos físicos e químicos, e combinações destes dois são comumente utilizados (ver por exemplo a revisão escrita por Mosier et al. ). O tipo de matéria-prima afeta fortemente a escolha do método de pré-tratamento. A hemicelulose é, por exemplo, acetilada em alto grau em materiais ricos em xilano., Uma vez que o acetato é libertado durante a hidrólise, o pré-tratamento destes materiais é, em certa medida, autocatalítico e exige menos ácido adicionado e condições de processo mais brandas. No entanto, o acetato libertado aumenta a toxicidade dos hidrolisados hemicelulose.

fibra de amônia / explosão de congelamento (AFEX) pré-tratamento é considerado um método atrativo para o pré-tratamento de resíduos agrícolas, produzindo celulose altamente digerível . AFEX despolimeriza a lignina, remove a hemicelulose e decristaliza a celulose ., A temperatura e o pH moderados também minimizam a formação de produtos de degradação do açúcar. No entanto, o método sofre de elevados custos de recuperação de amoníaco e amoníaco . Neste contexto, deve também mencionar-se o método da Cal, baseado no hidróxido de cálcio (ou sódio). Os pré-tratamentos alcalinos são executados a temperaturas mais baixas durante longos períodos de residência e, quanto ao método AFEX, obtém-se uma delimitação da biomassa.a explosão de vapor é um método de pré-tratamento estudado intensivamente ., Os efeitos da explosão de vapor não-catalisado – e pré-tratamento de água quente líquida-na biomassa são principalmente atribuídos à remoção de hemiceluloses. Adicionando um catalisador ácido, a hidrólise pode ser melhorada. Pré-tratamento de ácido diluído usando H2SO4 ou SO2 são os métodos de pré-tratamento mais investigados por causa de sua eficácia e inexpensividade. Estes métodos têm sido aplicados em plantas-piloto e, portanto, estão próximos da comercialização . O tratamento catalizado pelo ácido melhora a remoção da hemicelulose, dá uma hidrólise parcial da celulose e altera a estrutura da lignina ., Os principais inconvenientes estão relacionados com os requisitos do equipamento de processo e formação de inibidores . Até agora, pré-tratamentos bem sucedidos com álcali , AFEX e água quente líquida têm sido limitados a resíduos agrícolas e culturas herbáceas, enquanto pré-tratamentos de vapor catalisados pelo ácido têm gerado altos rendimentos de açúcar desses materiais, bem como de matérias-primas de madeira macia .

uma quantificação simples da dureza de um processo de pré-tratamento a vapor é o chamado fator de gravidade, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Para pré-tratamentos catalisados pelo ácido, o Fator de gravidade combinado, log (CS), é usado em algum momento. Isto leva também em conta o pH, log(CS) = log (R0) – pH, e os valores típicos para a explosão de vapor catalisado pelo ácido pré-tratamento de softwood estão na faixa de 2 a 4 .

condições óptimas de pré-tratamento num processo SSF não diferem necessariamente muito das de um processo SHF utilizando biomassa lignocelulósica. No entanto, vários compostos presentes em hidrolisados pré-tratamento, que inibem a hidrólise enzimática, são convertidos pelos organismos fermentadores., Esta é uma explicação provável por trás dos maiores rendimentos de etanol relatados em SSF em comparação com SHF . A formação de inibidores a partir do pré-tratamento pode, portanto, ser tolerada em maior extensão num processo SSF. Compostos inibitórios podem ser colocados em três grandes grupos: furaldehydes, ácidos fracos e fenólicos. Os dois furaldehides mais comuns, HMF (5-hidroximetil-2-furaldeído) e furfural (2-furaldeído), são formados em condições graves a partir de hexoses e pentoses, respectivamente ., Ácidos fracos de materiais lignocelulósicos, tais como ácido acético, fórmico e levulínico, são formados principalmente por Des-acetilação de hemicelulose ou decomposição por HMF . Compostos fenólicos são formados principalmente durante a decomposição da lignina, e podem ser encontrados em numerosas variantes, dependendo do tipo de lignina . Para uma discussão mais aprofundada sobre a inibição, ver, por exemplo, a revisão por Almeida et al .

hidrólise enzimática

um pré-tratamento bem sucedido removeu em grande medida a hemicelulose, deixando a celulose disponível para hidrólise., Uma vez que os microrganismos mais comumente usados para a produção de etanol utilizam apenas monômeros de açúcar, a celulose precisa ser hidrolisada, que em um SSF ocorre concomitantemente com a fermentação. Historicamente, a digestão da celulose industrial tem sido feita com hidrólise ácida e otimização da hidrólise ácida de vários materiais lignocelulósicos têm sido realizados para fins de produção de etanol ., A hidrólise ácida, no entanto, produz hidrolisados que são relativamente tóxicos para os microrganismos fermentadores, e o rendimento máximo de glicose é limitado a aproximadamente 60% em um processo de lote por razões cinéticas . A degradação enzimática da fracção da celulose, por outro lado, tem o potencial de produzir hidrolisados relativamente não tóxicos com rendimentos de açúcar mais elevados.enzimas especializadas na divisão Da β-1-4-as ligações glicosídicas do glucano são chamadas coletivamente de celulases. Em 1950, Reese et al apresentou um modelo de hidrólise enzimática da celulose com base em múltiplas enzimas (C1 e CX)., A enzima C1 foi assumida como produzindo cadeias poli-hidro-glicose mais curtas, enquanto a solubilização foi atribuída à enzima CX. Basicamente, o mesmo quadro se aplica hoje, mas houve um enorme progresso no conhecimento sobre todos os diferentes componentes enzimáticos específicos envolvidos. As celulases estão divididas em três subcategorias, representando três tipos de atividade: endoglucanases, exoglucanases (celobiohidrolases) e β-glucosidases., As Endoglucanases reduzem significativamente o grau de polimerização do substrato, atacando aleatoriamente as partes interiores, principalmente nas regiões amorfa da celulose. Exoglucanases (ou celobiohidrolases), por outro lado, encurtam incrementalmente as moléculas de glucano ligando-se às extremidades de glucano e liberando principalmente unidades de celobiose. Por último, as β-glucosidases dividem a celobiose dissacarídica em duas unidades de glucose.,vários tipos de microrganismos podem produzir sistemas de celulase, incluindo fungos filamentosos aeróbicos, actinomicetes aeróbicos, bactérias hipertermófilas anaeróbicas e fungos anaeróbicos (ver por exemplo, revisão por Lynd et al. ). Pesquisas intensivas sobre os fungos filamentosos aeróbicos T. reesei durante as últimas décadas resultaram em um organismo eficiente de produção de celulase, que está atualmente dominando a produção de celulase industrial .tal como já mencionado, uma vantagem importante para o SSF em comparação com o SHF é a redução da inibição do produto final pelos açúcares formados na hidrólise., O produto de fermentação etanol inibe também a hidrólise, mas em menor medida do que a celobiose ou a glucose . Outra vantagem é que os inibidores do pré-tratamento podem ser metabolizados pelos microorganismos . No entanto, também o processo SSF pode sofrer de hidrólise incompleta da fração lignocelulósica sólida. Com exceção da inibição por produtos finais ou outros Componentes , isso pode ser devido à desativação enzimática, adsorção enzimática improdutiva , diminuindo a disponibilidade de extremidades de cadeia , e aumentando a cristalinidade com a conversão de celulose pré-tratada .,num SSF industrial, as concentrações enzimáticas e celulares devem ser adequadamente equilibradas de modo a minimizar os custos de produção de leveduras e enzimas. Sinergias entre as enzimas, por exemplo endo-exo sinergismo , exo-exo sinergismo , e sinergismo entre endo – ou exoglucanases e β-glucosidases , também deve ser otimizada através da optimização da composição das misturas de enzimas. A composição ideal dependerá certamente da matéria-prima lignocelulósica.,

microrganismos de fermentação

os requisitos gerais de um organismo a utilizar na produção de etanol são que este deve dar um rendimento elevado em etanol, uma produtividade elevada e ser capaz de suportar elevadas concentrações de etanol, a fim de manter baixos os custos de destilação . Além destes requisitos gerais, a tolerância ao inibidor, a tolerância à temperatura e a capacidade de utilizar açúcares múltiplos são essenciais para aplicações SSF. A tolerância em relação a valores de pH Baixos minimizará o risco de contaminação., O cavalo de trabalho na produção de amido ou de etanol à base de sacarose é a levedura comum para Panificação, Saccharomyces cerevisiae. Este organismo produz etanol a um alto rendimento (superior a 0,45 g-1 em condições ótimas) e uma alta taxa específica (até 1,3 g de massa celular h-1 ). Tem também uma tolerância muito elevada ao etanol, mais de 100 g L-1 tem sido relatado para algumas estirpes e meios . Além disso, o organismo provou ser robusto para outros inibidores, e, portanto, é adequado para a fermentação de materiais lignocelulósicos .,

hemicelulose de madeira dura e resíduos agrícolas são tipicamente ricos em xilanos (cf. Quadro 1)-madeiras duras que contenham principalmente O-acetil-4-o-metil-glucuronoxilano, enquanto as gramíneas contêm arabinoxilano . A hemicelulose de madeira mole, por outro lado, contém mais mananos – principalmente na forma de galactoglucomanano – e menos xilano. A fermentação de manose é normalmente eficiente em S., cerevisiae, enquanto a capacidade de fermentamento galactose é dependente da estirpe , e os genes para utilização de galactose são ainda reprimidos pela glucose, levando a uma utilização sequencial típica dos açúcares. É evidente que a fermentação da xilose é uma questão mais importante para os resíduos agrícolas e a madeira de folhosas do que para a madeira macia. A xilose não é metabolizada por S. cerevisiae de tipo selvagem, à excepção de uma pequena redução para o xilitol. Esta, e para algumas partes a tolerância à temperatura, tem sido a principal razão por trás do interesse de testar também outros microrganismos para a conversão de lignocelulose em SSF.,leveduras fermentadoras de xilose naturais , como a estipite de Pichia e a shehatae de Candida, poderiam ser potencialmente vantajosas para a utilização em SSF de materiais com um elevado teor de xilano. No entanto , a sua tolerância aos compostos inibitórios nos hidrolisados da lignocelulose não tetoxificada é bastante baixa e, além disso, é necessário um fornecimento muito baixo e bem controlado de oxigénio para uma fermentação eficiente da xilose . Os principais “concorrentes” da levedura foram as bactérias Zymomonas mobilis e Escherichia coli geneticamente modificada. Z., a mobilis, uma bactéria obrigatoriamente anaeróbica, que carece de um sistema funcional de fosforilação oxidativa, produz etanol e dióxido de carbono como principais produtos de fermentação. Curiosamente, Z. mobilis utiliza a via Entner-Duodoroff que dá uma menor produção de ATP por glicose catabolizada . Isto, por sua vez, dá um menor rendimento de biomassa e um maior rendimento de etanol em glicose em comparação com S. cerevisiae . No entanto, o tipo selvagem Z. mobilis não tem a capacidade de fermentar açúcares pentose, e uma grande desvantagem é, além disso, que não é um organismo muito robusto., Em geral, as bactérias parecem ser menos tolerantes aos inibidores derivados da lignocelulose , e um passo de desintoxicação pode ser necessário antes da fermentação. Em contraste com a levedura de padeiros e Z. mobilis, E. coli é capaz de metabolizar uma grande variedade de substratos (incluindo hexoses, pentoses e lactose), mas o organismo de tipo selvagem tem uma via fermentativa mista, e é, portanto, um pobre produtor de etanol. In a landmark contribution, awarded U. S. patent number 5000000, a strain of E., coli foi geneticamente modificado para produzir etanol por sobreexpressão de PDC (codificação de piruvato descarboxilase) e adhB (codificação de álcool desidrogenase) de Z. mobilis . Obtiveram-se excelentes resultados com E. coli recombinante, por exemplo, a estirpe KO11, que demonstrou o rendimento de etanol de 86 a quase 100% das concentrações teóricas e finais de etanol até 40 g L-1 em hidrolisados hemicelulose de bagaço, estopa de milho e cascas de milho ., No entanto, apenas a fracção líquida foi utilizada em estudos notificados, e os hidrolisados foram ainda desintoxicados antes da utilização, por sobrelimação para pH 9 com hidróxido de cálcio e depois ajustados para pH 6, 0–6, 5 com HCl. Além disso, uma vez que o pH ideal é 6,5, E. coli é menos adequado para processos SSF com celulases T. reesei, que geralmente é considerado ter um pH ótimo em torno de 4,8 .fermentação Pentose por engenharia de S. cerevisiae devido às propriedades muito atractivas de S., cerevisiae em fermentações industriais, houve esforços significativos feitos nas últimas décadas para projetar estirpes recombinantes de xilose e de fermento de arabinose desta levedura. As estirpes de fermento de xilose de S. cerevisiae podem, em princípio , ser construídas introduzindo genes que codificam a xilose isomerase (XI) de bactérias e fungos, ou genes que codificam a xilose redutase (XR) e a xilitol desidrogenase (XDH) de fungos . Também o gene endógeno XKS1 que codifica a xilulocinase (XK) tem de ser sobreexpressado para obter uma fermentação significativa da xilose ., As proteínas de transporte são necessárias para a absorção da xilose, bem como de outros açúcares na levedura. Na S. cerevisiae, verificou-se que a xilose é transportada pelos transportadores hexose, mas a afinidade para a xilose é cerca de 200 vezes inferior à da glucose . Consequentemente, a absorção de xilose é inibida competitivamente pela glucose.

Existem 20 genes diferentes que codificam proteínas relacionadas com o transporte de açúcar, 18 sistemas individuais (Hxt1-17 e Gal2) e duas proteínas de sinal relacionadas (Snf3p e Rgt2p)., Os transportadores apresentam afinidades diferentes para os açúcares, e a expressão dos seus genes correspondentes é regulada pelas concentrações de açúcar, ou seja, pela disponibilidade da fonte de carbono . Foi sugerido anteriormente que a xilose é absorvida pelos sistemas de transporte de glucose de alta e baixa afinidade (Figura 2), mas a absorção aumenta na presença de baixas concentrações de glucose . Estudos indicaram que os transportadores de hexose de elevada e intermédia afinidade; Hxt4, Hxt5 Hxt7 e Gal2 são, de facto, os transportadores mais importantes para a xilose ., Além disso, foi demonstrado que é necessária uma concentração de glucose baixa (mas não zero) no meio para uma absorção eficaz da xilose . Isto foi explicado pela necessidade de glucose para a expressão de enzimas glicolíticas e intermediários , bem como a geração de metabolitos intermediários para os passos iniciais do metabolismo da xilose e da Via do fosfato de pentose . Outra possível explicação, deduzida tanto de experimentos quanto de modelagem de computadores, é que a glicose é necessária para a expressão de transportadores hexose com propriedades favoráveis de transporte de xilose, por exemplo, Hxt4 ., Consequentemente, a fim de obter uma co-fermentação eficiente da xilose e da glucose em SSF (por vezes denotado SSCF – saccharificação simultânea e co-fermentação) com S. cerevisiae recombinante, é necessário manter a concentração de glucose baixa, o que foi demonstrado na prática em recentes estudos sobre SSF .