Madame Lelica

struktur av ACLY med CoA avslöjar produktiva och oproduktiva CoA-konformationer

vi producerade rekombinant, fullängds ACLY i Escherichia coli för alla våra biokemiska och strukturella analyser (utökade Data Fig. 1a,B)., Differentiell scanning fluorimetri av enzymet med olika kofaktorer bekräftade bindning och potentiella strukturella förändringar i samband med ligander tillsätts ensam eller i kombination (Extended Data Fig. 1c). Vi använde dessa data för att styra strukturen bestämning av ACLY med dess Co-substrat eller co-produkter.

Vi förberedde det rekombinanta proteinet och utförde initialt negativ fläck-enpartikelanalys av proteinet i frånvaro av några metaboliter (ACLY-apo)., Den tvådimensionella (2D) klassen medelvärden från 3000 partiklar bekräftade att proteinet bildade en tetramer (Extended Data Fig. 2a,B). För att få mer strukturella detaljer utförde vi en cryo-EM-studie på ACLY–citrate-CoA-komplexet. Efter flera omgångar av optimering av cryo-EM-proverna bestämde vi D2-symmetriska cryo-EM-strukturen hos ACLY-citrate-CoA-strukturen till en genomsnittlig övergripande upplösning på 3.0 Å. (Utökade Data Fikon. 2c,d, 3 och 4 och Tabell 1).,

ACLY–citrate-CoA struktur bildar en homotetramer med en central tetrameric CSH-modul och två ASKA domäner som är på motsatta ändar av CSH-modul (protomers 1 & 2 och 3 & 4) (Fig. 1a,B). BLIXTEN domän (rester 1-806) antar en struktur som är mycket lik den tidigare redovisade α/β arkitektur isolerade N-terminal domän bundet till citrat och ADP24., CSH-domänen (rester 859-1101) består uteslutande av helices och korta loopar, med strukturell homologi till en dimer av citratsyntasdimer som korsar vid ~90° vinklar (Extended Data Fig. 5a). ASH-och CSH-domänerna i varje polypeptidkedja är förbundna med en till stor del förlängd ~ 50-restspolregion förutom en kort α-helix mellan rester 824 och 829. Den spiralformade regionen inom denna linker är den enda punkten för signifikant kontakt (av van der Waals interaktion) mellan de två ASKDOMÄNERNA på ena sidan av molekylen., Den utökade länken gör att CSH i en subenhet kan interagera med ASH-domänen för en annan subenhet över motsatt sida av CSH-modulen. I motsats till de relativt glesa interaktionerna mellan ASH-protomererna bildar CSH-domänerna ett omfattande nätverk av övervägande van der Waals-interaktioner som skulle föreslå att CSH-domänerna fungerar som en stel tetramer-modul, medan de fyra ASH-domänerna är mer flexibla. Detta överensstämmer med den observerade em local resolution estimationen på EM-kartan som är högst på CSH-domänen (2.8 Å, Extended Data Fig., 4c) och våra tidigare observationer att CSH domänen har en högre smälttemperatur i förhållande till ASKA på ~75 °C jämfört med ~55 °C, respectively21.

CoA binder vid gränssnittet mellan CSH-och ASH-domänerna för separata underenheter och verkar ”häfta” superdomänerna tillsammans. Adeninbasen och ribosringen interagerar med CSH-domänen hos en monomer och pantotenarmen och β-mercapto-gruppen som klibbar in i den aktiva platsen för ASKDOMÄNEN hos en annan subenhet (Fig. 1C (vänster) och Fig. 1D (vänster))., Modellering av CoA är baserad på observationen att den fosforylerade ADP-gruppen är väl löst i kryo-EM-densiteten. Mercapto-gruppen var dock inte väl löst, vilket tyder på flexibilitet i denna region. Även om flera rester från CSH och ASKA domäner gör van der Waals-interaktioner med CoA, vätebindningar S574, R576 och S577 från ASKA domän och K964 från CSH domän till ribos fosfat oxygens tycks spela en särskilt viktig roll i häftning CoA vid ASH–CSH-gränssnitt., Intressant är E599 inom vätebindningsavståndet till coa: s modellerade svavelatom, vilket innebär att det kan spela en viktig katalytisk roll. Betydelsen av protein-CoA-interaktioner från Ash-och CSH-domänen stöds av resthalternas mutationskänslighet R576 och K964, och E599: s potentiella katalytiska Roll stöds av dess mutationskänslighet mot A eller Q men inte till D (Fig. 1f). Även om citrate ingick i provet för cryo-EM-rekonstruktion, kunde det inte lösas säkert i cryo-EM-kartan.,

Med tanke på den olösta densiteten för mercapto–gruppen av CoA genomförde vi en annan rekonstruktion av ACLY-citrat-CoA-strukturen utan att införa D2-symmetri för att avgöra om CoA kan anta olika konformationer i olika protomer. Vi kunde förbereda en rekonstruktion utan att införa symmetri (C1, asymmetrisk stängd) till en nominell upplösning på 3,5 Å. I denna ACLY–citrate-CoA-C1 asymmetrisk sluten struktur är upplösningen runt ASKDOMÄNEN fattigare än i D2-strukturen, men den lokala upplösningen runt CSH-domänen är relativt hög, från 2.8 till 3.2 Å., Analys av denna ACLY-citrat-CoA – C1 asymmetrisk sluten struktur avslöjade att var och en av ASKDOMÄNERNA och tre av de fyra CSH-domänerna och CoA-molekylerna antog samma konfiguration som D2-strukturen. En av CoA-molekylerna antar emellertid en alternativ konformation där den fosforylerade ADP-delen skiftas ~8 Å mot CSH-modulen och pantotenarmen böjs över för att interagera med CSH (Fig. 1b, C (höger) och Fig. 1e). Cryo-EM täthet som motsvarar denna alternativa CoA konformation är mycket tydlig (Fig. 1C (höger))., Anmärkningsvärt, cryo-EM densitet är också observerats för ett väl strukturerat vatten molekyl, som verkar för att överbrygga vätebindning interaktioner mellan terminal svavelatom av CoA med sidokedjan rester av H900, D1026 och R1065 med ytterligare van der Waals-interaktioner från L969, I973, H975 och R976 (Fig. 1D (höger)). Samtidigt med denna alternativa CoA-konformation, en slinga inom CSH-domänen (rester 965-986) och de flankerade spiralskiftet för att rymma den alternativa positionen för Coa-adeninbasen (Fig. 1e)., Mutationer av H975, R976, D1026 och R1065 till alanin visar alla äventyrad aktivitet, vilket tyder på att bindningen av CoA till CSH-domänen på något sätt är inblandad i enzymaktivitet (Fig. 1f). Med tanke på att CoA måste reagera med citrat i ASH-domänen hänvisar vi till Coa-konformationerna med cysteamin i pantotenarmen som pekar mot ASH och CSH som ”produktiva” respektive ”oproduktiva” CoA-konformationer, bundna till ACLY.,

strukturen hos den ACLY-citrat-CoA-subpopulationen avslöjar asymmetriska ASKRIKTNINGAR

förutom den stora ACLY–citrat-Coa-partikelpopulationen, som representerar 57% av klass 3-partiklarna, en subpopulation av ACLY–citrat-CoA-komplexa partiklar som representerar 23% av partiklarnas underklass (10% totalt) fångades också i en 3D-rekonstruktion utan att införa symmetri till en upplösning på 4,3 Å (Extended Data Fig. 3)., Denna subpopulation av partiklar har en övergripande struktur som liknar den stora ACLY-citrat-Coa-befolkningen, förutom att en av de fyra ASKDOMÄNERNA roteras ~50° mot sin närmaste ASKUNDERENHET för att anta en mer ”öppen” konformation, så vi hänvisar till den som ”ACLY–citrat-CoA-C1 asymm open”. I denna struktur är densiteten endast synlig för den fosforylerade ADP-delen av två Coa-molekyler bundna till två av de symmetriska ASKDOMÄNERNA (Fig. 2a,B). En av de symmetriska och asymmetriska ASH-subenheterna visar inga bevis för Coa-bindning., Den asymmetriska askdomänen förefaller särskilt oförenlig med produktiv CoA-bindning (Fig. 2c). Vi föreslår att denna ACLY–citrate-CoA-C1 asymm öppna struktur representerar ett mellanliggande tillstånd av ACLY, där två aktiva platser primeras för katalys och två är inte. Observationen av denna struktur tyder också på att de fyra ACLY aktiva platserna kan fungera självständigt.

strukturen i ACLY-apo-staten är ogynnsam för Coa-bindning

Med tanke på de begränsade interaktionerna mellan CSH-och ASH-domänerna frågade vi om strukturen hos ACLY i avsaknad av bundna ligander. För att göra detta bestämde vi cryo-EM-strukturen i ACLY i apo-formuläret, som vi kunde lösa till 4.3-Å-upplösning (utökad Data Fig. 4a och Tabell 1)., En jämförelse av ACLY-apo och ACLY–citrate-CoA strukturer visar att, i apo staten, var och en av ASKA par på motsatta ändar av tetramer är vridna mot varandra med ~10° för att bilda en mer öppen ACLY tetramer och att placera BLIXTEN domäner i de positioner som visas till onåd produktiva CoA bindande (Fig. 3). Specifikt, ASKA slingor centrerad på F533, S574 och K1018 (från den intilliggande CSH domän) skulle kollidera med CoA som är bundna i ACLY–citrate-CoA struktur (Fig. 3b)., Dessutom flyttar de två rester som ligger inom väte-bindningsavståndet till CoA från ASKDOMÄNEN, R576 och E599, ut ur väte-bindningsavståndet i ACLY-apo-strukturen (Fig. 3C). Under tiden förblir CSH-modulen i stort sett oförändrad mellan de två strukturerna. Tillsammans visar en jämförelse av acly-apo–och ACLY-citrate-CoA-strukturerna att ACLY-apo-strukturen måste omorganisera för att rymma CoA-substratet.

ACLY–acetyl-CoA–OAA–komplexet avslöjar Coa-citratlyasreaktion uppträder i ASKDOMÄNEN

differentiell scanning av fluorimetridata visade att både acetyl-CoA-och OAA-produkterna stabiliserade ACLYPROTEINET (Extended Data Fig. 1c)., Detta konstaterande indikerade att vi kunde fånga ACLY-OAA-acetyl-CoA-produktkomplexet, och så bättre förstå reaktionsmekanismen. För detta ändamål bestämde vi komplexets kryo-EM-struktur, som vi löste till 3.1-Å-upplösning med hjälp av D2-symmetri (Extended Data Fig. 4). Den övergripande strukturen hos det ACLY-Co-produktkomplexet liknade mest det symmetriska ACLY-Co–substratet (ACLY-citrate-CoA-D2) komplexet, med en övergripande rot-mean-square avvikelse (r.m.s. d.) på 0,407 Å för ca-atomer (Fig. 4a)., Vi fann att acetyl-CoA ockuperade samma bindningsställe som CoA och stabiliserades också av samma basrester, R576 och K964 (Fig. 4b). Dessutom kunde vi entydigt modellera två OAA-molekyler bundna till varje ACLY subenhet (Fig. 4b,c). En OAA-molekyl (OAA1) överlappar med citratbindningsfickan inom ASKDOMÄNEN och proximal till acetylgruppen av acetyl-CoA. OAA1 gör relativt blygsam interaktioner med protein, inklusive vätebindningar till N346 och T348 och van der Waals-interaktioner med F547., Den andra OAA-molekylen (OAA2) är skyldig att CSH domän och gör den mer omfattande samverkan med ACLY än OAA1. OAA2 kontakter CSH modul genom vätebindningar till H900, D1026, R1065 och R1085 och genom van der Waals-interaktioner för att F935 och F1061 från en subenhet, liksom genom en vätebindning till R1065 från en annan enhet (Fig. 4c). OAA2 överlappningar samt med bundna OAA i gris hjärta citrate synthase25 (Extended Data Fig. 5b).

vi raffinerade också cryo-EM–kartan över ACLY–OAA-acetyl-CoA-strukturen utan symmetribegränsningar och erhöll en identisk struktur med D2-symmetri, förutom att en av de fyra acetyl-CoA-molekylerna visade två möjliga konformationer av pantotenarmen av acetyl-CoA, en med CoA-cysteamin mot ASKDOMÄNEN, som t.ex. i de andra tre protomererna och den andra mot csh-domänen (utökade data fig. 6a)., Till skillnad från den alternativa konformationen av CoA som hittades i ACLY–citrat-CoA-strukturen förändrades emellertid inte positionen för den fosforylerade ADP-gruppen i dessa två konformationer. Den potentiella alternativa konformationen av acetyl-CoA skulle kunna föreslå en möjlig frisättningsväg för substratet i enzymomsättningen eller ett autoinhibitoriskt tillstånd för enzymet (diskuteras nedan).

observationen av oaa1-och acetyl-CoA-produkterna i ASKDOMÄNEN föreslog starkt att lyaskemin utförs där, i motsats till tidigare förslag att denna kemi utförs i CSH domain22, 23., Vi spekulerar i att OAA2 kan fungera att hjälpa till att organisera CSH domän för samarbete med BLIXTEN domän och/eller fungera som en andra OAA produkt autoinhibitory webbplats som skulle kunna binda den pantotensyra arm av acetyl-CoA (eller cysteamine av CoA) för att sitta hela CSH domän, så att de ömsesidigt uteslutande bindande av CoA i en produktiv konformation hämmas vid höga cellulära OAA koncentrationer (Extended Data Fig. 6a)., Intressant, medan den produktiva utökade Coa-orienteringen med cysteamin som pekar mot ASKDOMÄNEN inte kan modelleras till ACLY-apo utan signifikant steric clash (Fig. 2b), den vända orienteringen med cysteamin pekar mot CSH-domänen kan (Extended Data Fig. 6b). Detta överensstämmer med våra resultat som CoA kan binda till ACLY i frånvaro av citrat och/eller ATP (data som inte visas), men vi föreslår en böjd konformation, som observerats i en av ACLY–citrat-CoA-C1-protomererna (Fig. 1C (höger) och Fig., 1d (höger)) och även den isolerade strukturen hos CSH domain22.

i Överensstämmelse med hypotesen att OAA2 kan fungera som en ACLY autoinhibitory webbplats, en tidigare studie visade att OAA kan hämma råtta lever ACLY på ett sätt som är icke-konkurrenskraftiga med citrate26. För att validera den funktionella betydelsen av de två OAA-platserna som observerades i ACLY-OAA-acetyl-CoA-strukturen använde vi ett steady-state fluorescence quenching experiment., Som ett kontrollexperiment titrerade vi först citrat i ACLY i frånvaro eller närvaro av en mättnadskoncentration av CoA och kunde passa data till ett citratbindningsställe med KD-värden på 3,4 ± 0,5 µM och 1,4 ± 0,3 µM i frånvaro eller närvaro av CoA, med goda R2-värden på 0,92 respektive 0,84 (Fig. 4d). Detta överensstämmer med det enda citratbindningsstället som observerats i den ACLY ASH – domänens kristallstruktur bunden till citrate13 och kristallstrukturen av intakt skarpt bunden till CoA och citrate22, vilket visar att CoA stabiliserar citratbindningen i ACLY ASH domain22., Vi titrerade därefter OAA till ACLY och fann att data passar betydligt bättre till en tvåsidig modell (R2 = 0,99) än en ensidig modell (R2 = 0,93) (Fig. 4e). Två-platsbindningsmodellen tillgodoser bättre den bifasiska fluorescensminskningen som blir uppenbar vid högre OAA-koncentrationer och ger upphov till en hög affinitet OAA-bindningsställe (KD = 15 ± 4 µM) som står för en tredjedel av den totala fluorescensändringen och en låg affinitet OAA-bindningsställe (KD = 1,300 ± 500 µM) som står för de återstående två tredjedelarna av den totala fluorescensändringen (Fig. 4e)., Dessa data överensstämmer med den funktionella relevansen av de två OAA–bindningsställen som observerats i ACLY–OAA-acetyl-CoA-strukturen.

ACLY-E599 kan fungera som en viktig katalytisk Rest

den ACLY–Co-produktstrukturen gjorde det möjligt för oss att ta itu med en långvarig fråga om den AKLYMOLEKYLÄRA mekanismen. ACLY föreslås att klyva citryl-CoA mellanliggande med stöd av en allmän bas för att extrahera en proton från citrate substrat och/eller en allmänt sura för att reprotonate den OAA lämnar group16,27,28., Detta överensstämmer med en pH-hastighetsprofilanalys av ACLY med en PKA på ~8.5 (Fig. 5a). Vi hypoteser att den evolutionärt bevarade E599 är placerad för att spela en viktig katalytisk roll, som en allmän bas och/eller syra, och/eller för stabilisering av fosfo-citryl-CoA mellanliggande (se nästa avsnitt och Fig. 4b). En relativt hög pKa för en begravd glutamatrester har noterats tidigare29. Överensstämmer med en viktig katalytisk roll för E599, fann vi att E599A och E599Q mutanter har kraftigt nedsatt aktivitet (Fig. 1F), även om kofaktorbindningen inte påverkades (Fig. 5b)., Däremot fann vi att en liknande sura E599D mutant uppvisade liknande verksamhet som WT ACLY (Fig. 1F), med en liknande pH-hastighetsprofil (Fig. 5a). Sammantaget argumenterar uppgifterna för vikten av E599 för katalys av ACLY.

ACLYKATALYS fortsätter genom en fosfo-citryl-CoA-intermediär i ASKDOMÄNEN

identifieringen av e599 som en viktig katalytisk Rest för klyvning av citryl-Coa-addukten till acetyl-CoA och OAA-produkter gav oss möjlighet att fånga en reaktionsmedium av en ACLY-Coa-produkt.e599q Mutant i närvaro av ATP, citrat och Coa Co-substrat., Vi blandade därför ACLY-e599q-mutanten med mättnadskoncentrationer av ATP, citrat och CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA) och bestämde sin kryo-EM-struktur, som vi kunde lösa till en övergripande upplösning på 2,85 Å. Strukturen bestämdes genom att införa D2 symmetri och visade att den ASKA och CSH domäner av ACLY var placerade på samma sätt som ACLY–citrate-CoA produkt och ACLY–OAA–acetyl-CoA strukturer med r.m.s.d. värden för Ca atomer av 0.584 och 0.620 Å, respektive., I motsats till dessa andra substrat-och produktkomplex visade emellertid acly–e599q-ATP-citrat-CoA-komplexet anmärkningsvärt väldefinierad kryo-EM-densitet i ASKDOMÄNENS aktiva plats, som kunde modelleras som ADP (hydrolyserad ATP) och en fosfo-citryl-CoA-mellanliggande (Fig. 6a,b). I motsats till var och en av de andra AKLYSTRUKTURERNA som rapporterats i denna studie är aminosyran 752-767-slingan som hyser H760–återstoden, som har visat sig medla fosfatöverföring från ATP till citrat, väl beställd i ACLY-E599Q-ATP-citrat-CoA-strukturen (Fig. 6c)., Dessutom observeras en magnesiumjon-eller vattenmolekyl, som också föreslås för att stabilisera H760, att bindas till E599 och fosfatgruppen (Fig. 6c). Denna observation tyder på att his760-rester, fosfatgrupp och magnesiumjon kan samarbeta för att stabilisera citrat för ligering till CoA i ASKDOMÄNENS aktiva plats. Dessutom stöder det faktum att acetyl-CoA-och OAA-produkterna inte observeras i denna struktur ytterligare våra slutsatser att E599 spelar en viktig katalytisk roll vid klyvning av fosfo-citryl-CoA-mellanprodukten till acetyl-CoA och OAA-produkterna inom ASKOMRÅDET.,