material och metoder
möss.
Vild-typ C57BL/6 möss erhölls från Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Pde8a ko-möss tillverkades ursprungligen av Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) enligt avtal med Pfizer Inc. (Pfizer Global Forskning och Utveckling, Smörgås, U.K.). De föddes senare till C57BL/6 möss vid University of Washington i 10 generationer. För de rapporterade experimenten användes åldersmatchade möss mellan 6 och 8 veckors ålder., Alla metoder som används har godkänts av den Institutionella Djurens Skötsel och Användning Kommittén (IACUC) vid University of Washington, i enlighet med National Institutes of Health Guide för Skötsel och Användning av försöksdjur.
realtid PCR.
Testiklarna cDNA var beredd från total RNA från vild-typ och PDE8A null musen testiklarna genom att använda Upphöjda III och Oligo dT (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA). Realtids-PCR utfördes med hjälp av Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Primers (IDT, Coralville, IA) för PDE8A, riktas till området nedströms inriktning kassett, var följande: fram primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); reverse primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Primers för hypoxantin-guaninfosforibosyltransferas var följande: framåt primer ATTATGCCGAGGATTTGGAA; omvänd primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
in Situ hybridisering.
mallen för riboprobsyntes erhölls genom PCR genom att använda en plasmid som innehåller mus PDE8A-sekvensen., I synnerhet, 3 regionen musen PDE8A (exoner 17-20) förstärks med hjälp av följande grundfärger: framåt primer, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (understruket T3 fag RNA-polymeras projektansvarig sekvens); reverse primer, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (understruket T7 fag RNA-polymeras projektansvarig sekvens). PCR-produkterna isolerades från agarosgeler och renades med en gel Extraktionssats (Qiagen, Valencia, CA)., 35S-märkta riboprober syntetiserades genom in vitro transkription med ett MAXIscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX) genom att använda PCR-produkten som mall innehållande T3 och T7 phage RNA polymerase promotorplatser. In vitro-transkription genomfördes i ett 20-µl reaktionsblandning innehållande 5 µl av UTP (PerkinElmer, Boston, MA) och T3 RNA-polymeras eller T7 RNA-polymeras för att få den känslan eller antisens-riboprobe, respektive.
testiklar dissekerades från wild-type och pde8a KO-Möss och frystes snabbt i Vävnadstek O. C. T. förening (Sakura, Torrence, CA) på torris., Sektioner (20 µm) skars i en kryostat, monterad på en Superfrost plus mikroslid (VWR Scientific, West Chester, PA) och lufttorkad. Sektionerna fixerades i 4% paraformaldehyd i 15 min vid rumstemperatur, behandlades med 0,25% ättiksyraanhydrid i 0,1 m trietanolamin (pH 8,0) för 10 min, och dehydrerades genom en graderad etanol serie (30, 60, 80, 95, och 100%). Sektionerna inkuberades sedan med hybridiseringsbuffert i en fuktig kammare vid 60 ° C för 4 h. efter sköljning i 2× SSC (standard saline citrate; 1× SSC = 0,15 m natriumklorid/0,015 m natriumcitrat, pH 7.,2), sektionerna dehydrerades genom en klassificerad etanolserie. Hybridisering utfördes i buffert innehållande 35S-märkt antisense eller sense probe (40 pg/34,000–38,000 cpm per µl) under plasthöljen i en fuktig kammare vid 60°C över natten. Täckglasen avlägsnades försiktigt och sektionerna tvättades med 2× SSC innehållande 10 mM DTT i 30 min två gånger vid 60 ° C. sektionerna inkuberades sedan i 30 min vid 37 ° C med 20 µg / ml RNaseA i 0.5 M NaCl, 10 mM Tris * HCl (pH 7.,5), och 1 mM EDTA, tvättades sedan i 50% formamid, 2× SSC innehållande 10 mM DTT i 30 min vid 60°C, i 1× SSC innehållande 10 mM DTT i 30 min vid 60°C, och vidare i 0,1× SSC innehållande 10 mM DTT i 30 min vid 60°C. slutligen dehydrerades sektionerna i etanol (70, 95 och 100%), lufttorkades och exponerades på BioMax XAR-film (Eastman Kodak, Rochester, NY) i 9 h. för att se cellfördelningen av PDE8A mRNA hybridisering, var bilderna belagda med autoradiografi NTB emulsion (Eastman Kodak) och exponeras för 1 vecka vid 4°C., Bilderna utvecklades, fixerades och motverkades med hematoxyline och monterades i Kanada Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A Immunoprecipitation och Analys.
Mus sperma var isolerade från cauda bitestiklarna av en simtur ut-metoden (38) och homogeniserade och som föreligger i PBS med 1% Nonidet (Roche Tillämpad Vetenskap, Indianapolis, I), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino dioxidibensamidin och Sigma proteashämmare blandning (Sigma-Aldrich)., Homogenatet centrifugerades i 5 min vid 16 000 × g i en mikrocentrifug och 200-µl alikvot av supernatanten, motsvarande 106 spermier, inkuberades över natten med 20 µl av en 1: 1-uppslamning av protein g-agarospärlor (Santa Cruz Biotechnology Inc. Santa Cruz, CA) i närvaro eller frånvaro av PDE8A antikropp (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Nästa dag, den immunoprecipitate tvättas tre gånger med PBS och sedan analyseras för PDE aktivitet i närvaro av 10 nM-lägret substrat, 40 mM Moppar (pH 7,5), 15 mM Mg-acetat, 2 mM EGTA, och 0,2 mg/ml BSA som i ref. 39.,
Immunohistotokemi.
nyfrysta mustester var inbäddade i vävnads-tek O. C. T. förening och sedan sektionerade på en kryostat vid 20 µm per skiva. Vävnadssektioner eller isolerade Leydig-celler torkades och fixerades i 4% (wt/vol) paraformaldehyd/PBS (pH 7.4) vid rumstemperatur i 10 min och tvättades tre gånger med PBS. Bilderna var preinkuberade med blockerande buffert (5% Donkey serum, 1 mg/ml BSA och 0.,1% Triton X-100 i PBS) för 1 h vid rumstemperatur, inkuberad med en anti-pde8a-antikropp (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz bioteknik) i PBS innehållande 1% Donkey serum, 1 mg/ml BSA och 0,1% Triton X-100 över natten vid 4°c, tvättad i PBS innehållande 0,05% Tween 20 tre gånger för 20 min, inkuberad med åsna Anti-get Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) i PBS innehållande 1 mg/ml BSA och 0,1% Triton X-100 för 2 h vid rumstemperatur och tvättas., Glidbanorna inkuberades vidare med blockerande buffert innehållande 5% getserum för 1 h vid rumstemperatur, inkuberades med cytokrom P450-antikropp (CYP11A) (200 µl, 1: 250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) över natt vid 4°C, tvättas i PBS med steg om 0,05% Tween 20 tre gånger i 20 min, och inkuberas med get anti-kanin Alexa488 (1:500; Invitrogen) som ovan. Sektionerna motverkades slutligen med TO-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) i PBS i 5 min, tvättades och monterades i SlowFade Gold antifade reagens (Invitrogen)., För att testa pde8a-antikroppsspecificiteten preinkuberades antikroppslösningen med 2,5 µg / ml antigenpeptid (Santa Cruz bioteknik) för 2 h vid rumstemperatur före färgning. Vissa sektioner inkuberades utan de primära antikropparna för att bestämma bakgrunden på grund av de sekundära antikropparna. De immunostaining signalerna visualiserades med ett konfokalmikroskop (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). β-galaktosidasaktivitet, uttryckt med en nukleär lokaliseringssignal av LacZ-genen i målkassetten, utvärderades genom x-gal-färgning., Sektionerna inkuberades först med anti-CYP11A antikropp följt av anti-kanin alkaliskt fosfatas konjugat (1:500; Invitrogen) och NBT/BCIP (Roche) för färgutveckling. X-gal-färgning utfördes sedan enligt beskrivningen (40) i X-gal-blandningen vid 37°C över natten. Sektionerna tvättades och monterades med glycerol / Tris-buffrad saltlösning.
Leydig Cellrening.
Leydig-celler isolerades enligt beskrivningen i ref. 41. Kort sagt, testiklar från vuxna möss dekapslas och dispergerades i ett skakande vattenbad vid 34 ° C under 10 min i 10 ml Medium 199 (m-199) med 0.,25 mg/ml kollagenas D, 35 me/ml Dispase II och 6 µg/ml DNas I. För att avsluta vävnadsdispersionen tillsattes 40 ml 1% BSA I m-199-media innehållande 15 mm Hepes, 4 mM natriumbikarbonat och 25 µg/ml sojaböna trypsinhämmare för att späda den ursprungliga suspensionen. Rören var sedan kapade och inverterade flera gånger. Sädeskanalerna tilläts sedimentera av gravitation, och supernatanten som innehöll de interstitiella cellerna samlades in. Förfarandet upprepades två gånger för att ytterligare skörda interstitiella celler., Cellerna var pelleterat i 50-ml-rör genom centrifugering vid 800 × g i 20 min vid 4°C och sedan fraktionerade med hjälp av en kontinuerlig Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) lutning (55% Percoll i HBSS buffrad med 15 mM Hepes och 25 µg/ml soja trypsin inhibitor) i en total volym på 35 ml. Gradienterna bildades på plats genom centrifugering i en ja-20 fast vinkel rotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) vid 23,700 × g för 30 min vid 4°C. Ett rör innehållande densitet markör pärlor (GE Healthcare) användes som en referens för att identifiera de olika densitetsskikten., Leydig-celler återfanns med början vid en densitet av 1,07 g / ml till botten av gradienten. Fem volymer av HBSS tillsattes för att späda Perkollen, och cellerna pelleterades vid 200 × g under 10 min vid 4 ° C. Den slutliga pelleten erhållen från två testiklar, berikad i Leydig-celler, återsuspenderades i 4 ml DMEM / F-12 kompletterad med 1% BSA och användes omedelbart för experimenten.
3β-Hydroxisteroiddehydrogenasanalys.
mätning av testosteronproduktionen.
Leydig-celler resuspenderades enligt ovan och 100-µl-alikvoter gavs i 96-brunnsplattor., Celler stimuleras i 150 µl slutliga volymen med de angivna koncentrationer av rekombinant LH för 3 h i 5% CO2 inkubator vid 37°C. Rekombinant humant LH var erhållas från den Nationella Hormon & Peptid Program (A. F. Parlow, Torrance, CA). Testosteron som frigörs i mediet av dubbla cellprover för varje LH-koncentration mättes genom att använda ett immunoenzymatiskt analyssats från Neogen (Lexington, KY).
Alla data uttrycks som medelvärdet ± SD., EC50-värdena för LH-verkan på testosteronproduktion beräknades genom icke-linjär montering av LH-koncentrationsberoende kurvor erhållna för varje Leydig-cellberedning genom att använda ett mjukvarupaket (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Statistisk analys utfördes av studentens t-test. Skillnader betraktades som signifikanta vid P < 0,05.