Om Ligase:
En ligase är ett enzym som kan bilda en ny kemisk bindning för att katalysera sammansmältning av två stora molekyler genom en medföljande hydrolys av ett litet hänge kemiska grupp. Ligaser använder ATP för att bilda bindningarna och används vid rekombinant DNA-kloning, som förenar två kompletterande fragment av nukleinsyra.
Ligasfunktion
DNA-ligasenzymer bär EG-nummer 6.5.1.1 (CAS-nummer 9015-85-4) och används för sammanfogning av två DNA-strängar genom att reparera enkelsträngsbrott för att katalysera fosfodiesterbindningar., Förhållandet sker mellan 5 ’fosfatänden av donatornukleotid och 3’ hydroxyländerna av acceptornukleotid.
fyrastegsprocessen, som kräver AMP, innefattar: omorganisation av aktiviteten i DNA-segment eller Okazaki-fragment, adenyltation av en lysinrester till enzymets aktiva centrum för att frigöra pyrofosfatet, överföring av AMP till donatornukleotidens 5′ fosfatänd för att bilda en pyrofosfatänd, bildning av fosfodiesterbindningen mellan donatornukleotiden och acceptorns 3′ hydroxyl.,
Ligasinteraktioner
kodade av lig-genen, E. coli-DNA-ligasen vinner energi genom att klyva nikotinamidadenindinukleotid (NAD) för att generera en fosfodiesterbindning, men kan inte ansluta sig till RNA till DNA. DNA-polymeraskoncentrat kan användas för att öka aktiviteten hos E. coli-DNA-ligaset, men koncentraten måste vara mindre än de fragment som ska ligeras.
Escherichia-viruset T4 används främst i laboratorieforskning och kan ligeras till antingen de sammanhängande eller trubbiga ändarna av oligonukleotider utöver både RNA-och RNA-DNA-hybrider., Det går dock inte med enkelsträngad nukleinsyra eller använder NAD. T4 bygger på en ATP-kofaktor och har en optimal temperatur på 16 °C.
Ligasmekanism
det termostabila enzymet härrör från den termofila bakterien och aktiveras vid mycket högre temperaturer än andra DNA-ligaser, understrukna av halveringstider på över 1 timme vid 95 °C och 48 timmar vid 65 °C. Det tillåter hög hybridiseringstringens och ligeringsspecificitet, som visar aktivenhet för 500 termiska cykler.