Madame Lelica

SSF-konceptet

tanken på att utföra enzymatisk hydrolys och jäsning samtidigt lades fram av Gauss et al. i ett patent från 1976 ., Författarna uppgav att glukosutbytet i en traditionell separat enzymatisk hydrolys (med hjälp av enzymer som produceras av svampen Trichoderma reesei) var låg, förmodligen på grund av slutproduktinhibering av hydrolysen med glukos och cellobiose. Författarna kunde dock visa att de erhöll ett högre totalt etanolutbyte vid användning av SSF, vilket de tillskrivna avlägsnandet av glukos och cellobiose genom jäsningen och den därav följande frisättningen av slutproduktinhibering., Termen SSF (förkortningen SSF används ofta också för fast tillståndsjäsning) användes inte av författarna vid den tiden, men blev den gemensamma notationen för denna process inom några år från den ursprungliga uppfinningen. Undvikande av hämning av slutprodukten är fortfarande förmodligen den viktigaste orsaken till att använda SSF, men det finns flera ytterligare potentiella fördelar. Gauss och medarbetare nämnde till exempel fördelen att glukos inte behöver separeras från lignin-fraktionen efter ett separat enzymatiskt hydrolyssteg och därigenom undviker en potentiell förlust av socker., Dessutom minskar kombinationen av hydrolys och jäsning det antal fartyg som behövs och därmed investeringskostnader. Minskningen av kapitalinvesteringar har uppskattats till mer än 20%. Detta är ganska viktigt, eftersom kapitalkostnaderna kan förväntas vara jämförbara med råvarukostnaderna vid etanolproduktion från lignocellulosa . Andra fördelar, som rör samkonsumtion av pentos-och hexossocker, och avgiftning har blivit uppenbara på senare tid, vilket kommer att diskuteras senare i denna översyn.,

oundvikligen finns det också nackdelar med SSF i jämförelse med den separata hydrolys-och fermentationsprocessen (SHF). Den optimala temperaturen för enzymatisk hydrolys är typiskt högre än för jäsning-åtminstone när man använder jäst som fermenterande organism. I en SHF-process kan temperaturen för den enzymatiska hydrolysen optimeras oberoende av jäsningstemperaturen, medan en kompromiss måste hittas i en SSF-process. Dessutom kan jästen inte återanvändas i en SSF-process på grund av problemen med att separera jästen från lignin efter jäsningen., Därför kommer jästen nödvändigtvis att utgöra en avkastningsförlust i en SSF-process, om jästen produceras från kolhydrater inom processen (se Figur 1) eller en löpande kostnad om den levereras externt. Enzymerna är lika svåra att återanvända, även i en SHF-process. Enzymerna produceras antingen inom processen – se Figur 1) – vilket innebär en förlust av substrat-eller levereras externt och därigenom tillför de kemiska kostnaderna., Återcirkulation av enzymer är lika svårt eftersom enzymerna binder till substratet, även om en partiell desorption kan erhållas efter tillsats av ytaktiva ämnen .

tillgången på lignocellulosiska insatsvaror varierar beroende på geografisk plats (se t. ex., Kim och Dale), och lignocellulosiska råvaror är ganska heterogena när det gäller både struktur och kemisk sammansättning (se Tabell 1). Denna heterogenitet har en stark inverkan på processdesignen, vilket påverkar praktiskt taget alla processteg, dvs den mekaniska hanteringen av materialet, förbehandlingsförhållanden, val av enzymer och jäststammar, samt separation och egenskaper hos det återstående lignin. Detta kommer att framgå i diskussionen nedan.,

förbehandling

syftet med förbehandlingen är att ändra lignocellulosastrukturen och öka graden av enzymatisk hydrolys av främst cellulosa. Detta bör göras med en minsta bildning av föreningar, som hämmar fermenterande mikroorganismer . Den tillgängliga ytan betraktas som en av de viktigaste faktorerna som påverkar effektiviteten av enzymatisk cellulosanedbrytning ., I naturligt trä är endast en liten del av cellväggkapillärerna tillgängliga för enzymerna . Förbehandling ökar emellertid det tillgängliga området på flera sätt; i) fragment och sprickor bildas vilket ger ökat område , ii) hemicellulosfraktionen hydrolyseras vilket minskar avskärmningseffekterna , iii) lignin genomgår också strukturella förändringar och träet avgränsas i olika grad, beroende på förbehandlingstekniken . Således kan avskärmningen av mikrofibriller och ocklusion av porer, orsakad av lignin, avlägsnas., Andra faktorer, som tros påverka smältbarheten i SSF, är substratet kristallinitet och graden av polymerisation (DP) .

förbehandlingsmetoderna kan delas in i fysikaliska och kemiska metoder, och kombinationer av dessa två används vanligen (se t.ex. den recension som Mosier et al. ). Typen av råmaterial påverkar starkt valet av förbehandlingsmetod. Hemicellulosen är till exempel acetylerad i hög grad i xylanrika material., Eftersom acetat frigörs under hydrolys är förBehandlingen av dessa material till viss del autokatalytisk och kräver mindre tillsatta syra-och mildare processförhållanden. Det befriade acetatet bidrar emellertid till toxiciteten hos hemicelluloshydrolysaterna.

Ammoniakfiber / frysexplosion (AFEX) förbehandling betraktas som en attraktiv metod för förbehandling av jordbruksrester, vilket ger mycket smältbar cellulosa . AFEX depolymeriserar lignin, tar bort hemicellulos och dekrystalliserar cellulosa ., Den måttliga temperaturen och pH minimerar också bildandet av sockernedbrytningsprodukter. Metoden lider emellertid av höga kostnader för ammoniak och ammoniakåtervinning . I detta sammanhang bör kalkmetoden, baserad på kalcium (eller natrium) hydroxid, också nämnas. Alkali förbehandling körs vid lägre temperaturer för långa uppehållstider, och när det gäller AFEX-metoden erhålls en uppdelning av biomassan.

Ångexplosion är en intensivt studerad förbehandlingsmetod ., Effekterna av icke-katalyserad ångexplosion – och flytande varmvatten förbehandling-på biomassan är främst hänförliga till avlägsnande av hemicelluloser. Genom att tillsätta en syrakatalysator kan hydrolysen förbättras ytterligare . Utspädd syra förbehandling med H2SO4 eller SO2 är de mest undersökta förbehandlingsmetoderna på grund av deras effektivitet och billigt. Dessa metoder har tillämpats i pilotanläggningar och är därför nära kommersialisering . Syrakatalyserad behandling förbättrar hemicellulosavlägsnandet, ger en partiell hydrolys av cellulosa och förändrar ligninstrukturen ., De största nackdelarna är relaterade till kraven på processutrustning och inhibitorbildning . Hittills har framgångsrika förbehandlingar med alkali, afex och flytande varmvatten begränsats till jordbruksrester och örtgrödor , medan syrakatalyserade ångbehandlingar har genererat höga sockerutbyten från dessa material samt från foderråvaror av barrved .

en enkel kvantifiering av hårdheten i en ångbehandling är den så kallade Allvarlighetsfaktorn, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., För syrakatalyserade förbehandlingar används den kombinerade svårighetsgraden faktor, log (CS), någon gång. Detta tar också hänsyn till pH, log (CS) = log(R0) – pH och typiska värden för syrakatalyserad ångexplosion förbehandling av barrved ligger inom intervallet 2 till 4 .

optimala förbehandlingsförhållanden i en SSF-process skiljer sig inte nödvändigtvis mycket från en SHF-process som använder lignocellulosisk biomassa. Flera föreningar som finns i förbehandling Hydrolysater, som hämmar enzymatisk hydrolys omvandlas emellertid av fermenterande organismer., Detta är en sannolik förklaring bakom de högre rapporterade etanolutbytena i SSF jämfört med SHF . Inhibitorbildning från förbehandling kan därför tolereras i högre grad i en SSF-process. Hämmande föreningar kan sättas in i tre huvudgrupper; furaldehyder, svaga syror och fenoliker. De två vanligaste furaldehyderna, HMF (5-hydroximetyl-2-furaldehyd) och furfural (2-furaldehyd), bildas vid svåra förhållanden från hexoser respektive pentoser ., Svaga syror från lignocellulosiska material, såsom ättiksyra, myrsyra och levulinsyra, bildas huvudsakligen genom de-acetylering av hemicellulosa eller HMF-nedbrytning . Fenolföreningar bildas huvudsakligen under lignin nedbrytning, och återfinns i många varianter, beroende på vilken typ av lignin . För en mer djupgående diskussion om hämning, se t. ex. översynen av Almeida et al .

enzymatisk hydrolys

en framgångsrik förbehandling har i stor utsträckning avlägsnat hemicellulos och lämnat cellulosa tillgänglig för hydrolys., Eftersom de vanligaste mikroorganismerna för etanolproduktion enbart använder sockermonomerer, måste cellulosa hydrolyseras, vilket i en SSF uppträder samtidigt med jäsningen. Historiskt har industriell cellulosaförtunning gjorts med syrahydrolys och optimering av syrahydrolys av olika lignocellulosiska material utförts för etanolproducerande ändamål ., Syrahydrolys producerar emellertid Hydrolysater som är relativt giftiga för fermenterande mikroorganismer, och det maximala glukosutbytet är begränsat till cirka 60% i en satsprocess av kinetiska skäl . Enzymatisk nedbrytning av cellulosafraktionen har å andra sidan potentialen att ge relativt giftfria Hydrolysater med högre sockerutbyten.

enzymer specialiserade på att bryta upp β-1-4-glykosidbindningar av glukan kallas kollektivt cellulaser. År 1950 presenterade Reese et al en modell av enzymatisk cellulosahydrolys baserad på flera enzymer (C1 och CX)., C1-enzymet antogs producera kortare polyanhydro-glukoskedjor, medan solubiliseringen tillskrevs CX-enzymet. I grund och botten samma bild gäller idag, men det har skett en enorm framsteg i kunskap om alla de olika specifika enzymkomponenter inblandade. Cellulaserna är indelade i tre underkategorier som representerar tre typer av aktivitet: endoglukanaser, exoglukanaser (cellobiohydrolaser) och β-glukosidaser., Endoglukanaser minskar signifikant graden av polymerisering av substratet genom att slumpmässigt attackera de inre delarna, huvudsakligen i de amorfa regionerna av cellulosa. Exoglukanaser (eller cellobiohydrolaser), å andra sidan, gradvis förkorta glukanmolekylerna genom att binda till glukanändarna och släppa huvudsakligen cellobiose enheter. Slutligen delar β-glukosidaserna disackariden cellobiosen i två enheter glukos.,

flera typer av mikroorganismer kan producera cellulassystem, inklusive aeroba filamentösa svampar, aeroba aktinomyceter, anaeroba hypertermofila bakterier och anaeroba svampar (se t.ex. granskning av Lynd et al. ). Intensiv forskning om aeroba filamentösa svampar T. reesei under de senaste decennierna har resulterat i en effektiv cellulasproducerande organism, som för närvarande dominerar den industriella cellulasproduktionen .

som redan nämnts är en viktig fördel med SSF jämfört med SHF minskningen av slutproduktinhibering av sockerarter som bildas i hydrolysen., Jäsningsprodukten etanol hämmar också hydrolys, men i mindre utsträckning än cellobiose eller glukos . En annan fördel är att hämmare från förbehandlingen kan metaboliseras av mikroorganismerna . SSF-processen kan emellertid också drabbas av ofullständig hydrolys av den fasta lignocellulosiska fraktionen. Med undantag för hämning av slutprodukter eller andra komponenter kan detta bero på enzymavaktivering , oproduktiv enzymabsorption, minskad tillgänglighet av kedjeländar och ökad kristallinitet med omvandling av förbehandlad cellulosa .,

i en industriell SSF bör enzym-och cellkoncentrationer balanseras på lämpligt sätt för att minimera kostnaderna för jäst-och enzymproduktion. Synergier mellan enzymerna , t.ex. endo-exo-synergism , EXO – exo-synergism och synergism mellan endo-eller exoglukanaser och β-glukosidaser , bör också optimeras genom att enzymblandningarnas sammansättning justeras. Den optimala kompositionen kommer säkert att bero på lignocellulosiskt råmaterial.,

fermenterande mikroorganismer

de allmänna kraven på en organism som ska användas vid etanolproduktion är att den ska ge ett högt etanolutbyte, en hög produktivitet och tåla höga etanolkoncentrationer för att hålla destillationskostnaderna låga . Förutom dessa Allmänna krav är inhibitortolerans, temperaturtolerans och förmågan att utnyttja flera sockerarter väsentliga för SSF-applikationer. Tolerans mot låga pH-värden minimerar risken för kontaminering., Arbetshästen i stärkelse – eller sackarosbaserad etanolproduktion är den vanliga Bakersjästen, Saccharomyces cerevisiae. Denna organism producerar etanol vid ett högt utbyte (högre än 0,45 g g-1 vid optimala förhållanden) och en hög specifik hastighet (upp till 1,3 g g-1 cellmassa h-1 ). Det har också en mycket hög etanoltolerans, över 100 g L-1 har rapporterats för vissa stammar och media . Dessutom har organismen visat sig vara robust mot andra hämmare, och den är därför lämplig för jäsning av lignocellulosiska material .,

hemicellulosa från lövträ och jordbruksrester är vanligtvis rika på xylaner (jfr. Tabell 1) – lövträ som huvudsakligen innehåller o-acetyl-4-o-metyl-glukuronoxylan, medan gräs innehåller arabinoxylan . Barrträ hemicellulosa, å andra sidan, innehåller mer mannaner – främst i form på galactoglucomannan – och mindre xylan. Mannos jäsning är normalt effektiv i S., cerevisiae , medan förmågan att jäsa galaktos är stamberoende, och generna för galaktosutnyttjande undertrycks dessutom av glukos, vilket leder till ett typiskt sekventiellt utnyttjande av sockerarterna. Det är uppenbart att xylos-jäsning är en viktigare fråga för jordbruksrester och lövträ än för barrved. Xylos metaboliseras inte av wild-type S. cerevisiae, förutom en mindre minskning till xylitol. Detta, och för vissa delar temperaturtoleransen, har varit den främsta orsaken bakom intresset att testa även andra mikroorganismer för lignocellulosomvandling i SSF.,

naturligt xylos-fermenterande jäst , såsom Pichia stipitis och Candida shehatae , kan potentiellt vara fördelaktigt att använda i SSF av material med högt xylaninnehåll. Emellertid är deras tolerans mot hämmande föreningar i obetoxifierade lignocelluloshydrolysater ganska låg, och dessutom krävs en mycket låg och välkontrollerad tillförsel av syre för effektiv xylos-jäsning . De viktigaste ”konkurrenterna” till jästen har varit bakterierna Zymomonas mobilis och genetiskt konstruerade Escherichia coli. Z., mobilis, en obligatoriskt anaerob bakterie, som saknar ett funktionellt system för oxidativ fosforylering, producerar etanol och koldioxid som huvudsakliga jäsningsprodukter. Intressant, Z. mobilis använder Entner-Duodoroff vägen som ger en lägre ATP-produktion per kataboliserad glukos . Detta ger i sin tur ett lägre biomassautbyte och ett högre etanolutbyte på glukos jämfört med S. cerevisiae . Wild-type Z. mobilis saknar emellertid förmågan att jäsa pentossocker, och en stor nackdel är dessutom att det inte är en mycket robust organism., I allmänhet verkar bakterier vara mindre toleranta mot lignocellulosa-härledda hämmare , och ett avgiftningssteg kan behövas före jäsningen. I motsats till Bagers jäst och Z. mobilis kan E. coli metabolisera en mängd olika substrat (inklusive hexoser, pentoser och laktos), men den vilda organismen har en blandad fermentativ väg och är därmed en dålig etanolproducent. I en milstolpe bidrag, tilldelas amerikanska patent nummer 5000000, en stam av E., coli konstruerades genetiskt till en etanolproducent genom överexpression av PDC (kodning av pyruvatdekarboxylas) och adhB (kodning av alkoholdehydrogenas) från Z. mobilis . Utmärkta resultat har uppnåtts med rekombinant E. coli, t. ex. ko11-stammen, som har visat etanolutbyten från 86 till nära 100% av de teoretiska och slutliga etanolkoncentrationerna upp till 40 g L – 1 på hemicelluloshydrolysat av bagass, majsstover och majsskrov ., Emellertid användes endast den flytande fraktionen i rapporterade studier, och hydrolysaterna avgiftades vidare före användning genom att man överlimmade till pH 9 med kalciumhydroxid och justerades sedan till pH 6, 0–6, 5 med HCl. Eftersom det optimala pH-värdet är 6.5 är E. coli dessutom mindre lämpligt för SSF-processer med T. reesei-cellulaser, vilket i allmänhet anses ha ett pH optimalt runt 4.8 .

Pentosjäsning genom konstruerad S. cerevisiae

På grund av de mycket attraktiva egenskaperna hos S., cerevisiae i industriella fermentationer har det gjorts betydande ansträngningar under de senaste decennierna för att utforma rekombinanta xylos och arabinosjäsande stammar av denna jäst. Xylosefermenterande stammar av S. cerevisiae kan i princip konstrueras antingen genom att införa gener som kodar för xylosisomeras (XI) från bakterier och svampar , eller gener som kodar för xylosreduktas (XR) och xylitoldehydrogenas (XDH) från svampar . Även den endogena xks1-genen som kodar för xylulokinas (XK) måste överuttryckas för att erhålla signifikant xylos-jäsning ., Transportproteiner behövs för upptag av xylos, liksom av andra sockerarter i jäst. I S. cerevisiae har xylos befunnits transporteras av hexostransportörerna, men affiniteten för xylos är cirka 200 gånger lägre än för glukos . Följaktligen hämmas xylosupptaget kompetitivt av glukos.

Det finns 20 olika gener som kodar för socker transport relaterade proteiner, 18 individuella system (Hxt1-17 och Gal2) och två tillhörande signal proteiner (Snf3p och Rgt2p)., Transportörerna uppvisar olika affiniteter för sockerarter, och uttrycket av deras motsvarande gener regleras av sockerkoncentrationerna, dvs. tillgången till kolkällan . Det har tidigare föreslagits att xylos tas upp av både hög-och lågaffinitetssystem för glukostransportörer (Figur 2), men upptaget ökar i närvaro av låga glukoskoncentrationer . Studier har visat att hexostransportörerna med hög – och mellanaffinitet; hxt4, Hxt5 hxt7 och Gal2 är faktiskt de viktigaste transportörerna för xylos ., Dessutom har det visats att en låg (men icke-noll) glukoskoncentration behövs i mediet för effektiv xylos upptag . Detta har förklarats av ett behov av glukos för uttryck av glykolytiska enzymer och intermediärer , liksom generering av intermediära metaboliter för de första stegen i xylosmetabolismen och pentosfosfatvägen . En annan möjlig förklaring, som framgår av både experiment och datormodellering, är att glukosen behövs för uttryck av hexostransportörer med gynnsamma xylos transportegenskaper, t .ex. Hxt4., För att erhålla effektiv samfermentering av xylos och glukos i SSF (ibland betecknad SSCF-samtidig sackarifiering och samfermentering) med rekombinant S. cerevisiae är det därför nödvändigt att hålla glukoskoncentrationen låg, vilket har visats i praktiken i de senaste SSF – studierna .