Madame Lelica

Det finns fyra familjer av intracellulära proteolytiska komplex allestädes närvarande i eubacteria: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP och FtsH. Förutom dessa fem är HtrA (DegP) ett periplasmiskt/utsöndrat proteolytiskt komplex, medan prokaryotisk proteasom endast finns i aktinomyceter. Strukturen, funktionen och rollen i patogenesen för varje proteas har tidigare granskats.,13, 17 Flera av dessa komplex har undersökts som potentiella antibakteriella mål, inklusive Lon,18 ClpXP,19 HtrA20 och proteasomen.21 av dessa har ClpXP undersökts mest utförligt och är det enda komplexet för vilket naturliga produkthämmare hittills har hittats.

clp-proteolytiska komplexet

ClpPs är väl bevarade hos de flesta bakteriearter och har en viktig roll i proteinomsättningen., Förutom proteinhomeostas och nedbrytning av missfoldade proteiner är ClpP också involverad i många regulatoriska processer genom att rikta transkriptionella regulatorer och remodeling av proteomen.22, 23, 24, 25 faktum är att ClpP har visat sig ha en nyckelroll vid reglering av processer som celldelning, stresstolerans, virulens, morfologisk differentiering och antibiotikaresistens.22, 23, 24 ClpP roll i dessa processer bygger på dess strikta urval av proteinsubstrat, vilket den uppnår genom att begränsa tillgången till dess katalytiska platser., Varje ClpP komplex bildas genom att stapla två heptameric ringar för att skapa en tetradecamer (Figur 2).26 kanalen som bildas rymmer 14 serinproteas katalytiska platser som inte kan nås utan passage genom de axiella öppningarna. Dessutom antar apo-ClpP en inaktiv, komprimerad konformation där dess katalytiska triad är feljusterad.27 Kontrollera konformationsanalys aktivering och tillgång till axiell öppningar Hsp100 proteiner av AAA+ grupp av ATPases: ClpA eller ClpX i Gram-negativa bakterier och ClpC eller ClpX i Gram-positiva., Dessa tillbehör ATPases bildar hexamera ringar som binder tetradecamers axiella ansikten med hjälp av tripeptid (L/i)GF motiv som passar in i hydrofoba fickor.28 bindning i denna hydrofoba ficka reglerar ClpP aktivitet på två sätt: först, genom att stabilisera komplexet i en aktiv, förlängd konformation med den katalytiska triaden i linje och, för det andra, genom proteinsubstrat utspelas., AAA + ATPas interagerar med proteinmål, antingen direkt eller genom ett samarbetsvilligt adapterprotein, och använder den energi som ATP tillhandahåller för att expandera substratet och mata det i den centrala porerna där det hydrolyseras på ett energioberoende sätt. Eftersom vikta proteiner annars är för stora för att komma in i kanalen reglerar dessa AAA+ – partners tätt vilka proteinsubstrat som är inriktade på avfettning.28

de flesta bakteriearter, inklusive E. coli, Bacillus subtilis och Staphylococcus aureus, har en clpP-gen som tillsammans med deras associerade AAA+ ATPas inte är nödvändiga för cellens viabilitet.25, 29, 30, 31, 32 Det har dock observerats att clpp-deletion hos dessa arter ökar deras mottaglighet för antibiotika såsom linezolid och rifampicin, och minskar virulens hos patogener såsom Listeria monocytogenes och S. aureus.,23, 33 förlust av virulens i ClpXP-deficient stammar har kopplats till stora störningar i den globala virulens transkriptionsfaktornivåer såsom Sar / agr regulatory network i S. aureus.23 intressant nog verkar effekten av ClpP-inaktivering på flera av dessa virulensregulatorer vara spänningsberoende och dessutom verkar vissa S. aureus-stammar som är bristfälliga i ClpXP-funktionen ha minskad känslighet för vankomycin, daptomycin och β-laktamantibiotika.,34, 35, 36

i motsats till de flesta bakterier finns två eller flera kopior av clpP i aktinobakterier och cyanobakterier och minst en funktionell kopia är nödvändig för livskraften.37, 38 I Mycobacterium tuberculosis, clpP1 och clpP2 bilda ett operon och båda generna är viktiga. Dessa isoformer arbeta tillsammans för att skapa en funktionell proteas genom att stapla ClpP1 och ClpP2 homoheptamers i en heterotetradecamer.37, 39 och en Av de fyra AAA+ ATPases i M. tuberculosis, ClpX och ClpC1 är avgörande för lönsamheten.,Med tanke på dess roll i cellviabilitet och virulens är ClpP-systemet ett lovande mål för nya antibakteriella medel med tre möjliga mekanismer för avreglering (Figur 2): hämning av ClpP-proteolys, aktivering av ClpP-proteolys eller störning av partner AAA+ ATPas.

ClpP-hämmare

kanske är det mest uppenbara sättet att rikta ClpP-systemet att utveckla en aktiv webbplatsinhibitor av ClpP. Bevis på principen om detta verkningssätt har visats i S. aureus, Streptococcus pneumoniae och L., monocytogenes, där clpP knockouts inte kan orsaka hudinfektions abscesser, lunginfektioner eller in vivo makrofag parasitism, respektive.22, 42, 43 Denna förlust av virulens och har varit associerad med en minskad aktivitet av extracellulära proteaser, lipaser, DNases och α-hemolysin i S. aureus, och α-listerolysin och listerial fosfolipas i L. monocytogenes.

Böttchers och Sieber44s banbrytande insatser för att rikta ClpP ledde till utvecklingen av en serie β-laktonhämmare., Inspirerad av reaktiviteten hos β-laktoner som finns i naturen syntetiserade de ett bibliotek av alkynmärkta derivat (till exempel lakton D3; figur 3a), som screenades mot flera bakteriella proteomer. Klicka kemi på alkyne tag användes för att fästa en fluorofor och möjliggöra identifiering av reaktiva enzymer. På detta sätt identifierades ClpP som ett mycket specifikt mål som bildar en kovalent addukt mellan dess aktiva platsser98 och β-lakton, vilket därigenom irreversibelt hämmar proteolytisk aktivitet (figur 3b).,Efterföljande karakterisering visade förmågan hos β-laktoner att minska virulensfaktoraktiviteten, inklusive α-hemolysin och listerolysin, i S. aureus respektive L. Monocytogenes.45, 46 denna minskning av virulensfaktorer korrelerade med förmågan hos optimerade β-laktonställningar (U1; figur 3a) för att signifikant minska S. aureus-infektion efter subkutan administrering i en hudabscessmodell och L. monocytogenes tillväxt i makrofager.46, 47 vidare visade sig β-laktonderivat (förening 7; figur 3a) vara bland den privilegierade gruppen av föreningar som kunde komma in i M., tuberkulos för att effektivt hämma tillväxten med en MIC på 28 µg ml-1.48 i slutändan, men låg plasmastabilitet på grund av snabb hydrolys av den cykliska estern utesluter ytterligare klinisk utveckling.

nyligen har Sieber och colleagues49 upptäckt en ny klass av potenta ClpP-hämmare, fenylestrarna (Av170; figur 3a). Upptäckt med hjälp av en objektiv skärm av 137 000 syntetiska föreningar i en fluorogen analys för ClpP-aktivitet verkar fenylestrar av samma kovalenta modifiering av Ser98 som β-laktoner., Intressant att vissa enantiomererna kan också utlösa deoligomerization av ClpP tetradecamer i heptamers, ett gynnsamt läge för åtgärder med tanke på att konformationsanalys kontroll av serin katalytisk triad ger det inaktiv i ClpP är heptameric form. Trots fenylestrarnas förbättrade styrka av proteashämning över β-laktoner reduceras deras anti-virulensaktivitet, eftersom de bara kan minska och inte avskaffa α-hemolysinproduktionen (figur 3C). Ansträngningar för att öka styrkan avslöjade en avvägning mellan stabilitet och reaktivitet.,49

Även om ClpP inhibition visar löfte som en verkningsmekanism, är det tydligt att ytterligare utveckling och upptäckt av nya byggnadsställningar krävs. Dessutom,med tanke på den senaste tidens bevis på läkemedelsresistens i vissa clpP knockout stammar, 34, 36 viss försiktighet på denna väg kan motiveras.

ClpP-aktivatorer

aktivering av ClpP-proteassystemet är ett särskilt spännande terapeutiskt alternativ. Ett kännetecken för intracellulära proteaser är strikt reglering av aktivitet för att undvika nedbrytning av målproteiner. I eukaryoter uppnås detta ofta genom uppdelning i organeller., Däremot har bakterier utvecklat snäva reglerande proteinkomplex för att kontrollera proteasaktiviteten. Genom att aktivera proteolytisk aktivitet för att urskillningslöst försämra proteiner, skulle ett läkemedel kunna orsaka celldöd inte bara i de arter där ClpP är viktigt, men också de där ClpP är dispensbart. Mutationer som avskaffar ClpP: s aktivitet, medan teoretiskt ger motstånd, skulle vara dödliga i celler där ClpP är viktigt och försämrar virulens i celler där ClpP är dispensbart., Slutligen kan det aldrig tidigare skådade verkningsmekanismen genom aktivering snarare än hämning av dess mål göra det möjligt för ett sådant läkemedel att vara effektivt mot vilande persisterceller.

Serendipitous bevis på principen om denna unika verkningsmekanism rapporterades med upptäckten av acyldepsipeptider (ADEPs; figur 4a). ADEPs var först beskrivs i en patent-1985 som ”A54556 komplex”, en grupp av åtta närbesläktade substanser som produceras av Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP identifierades som ADEP: s molekylära mål under 2005 när Brötz-Oesterhelt et al.,51 tillämpade omvänd genomik på en ADEP-resistent E. coli-stam för att identifiera resistensdeterminanten som en mutation i ClpP som gör den inaktiv. Detta fynd tyder på att ADEPs aktiverar ClpP, vilket orsakar olämplig proteinnedbrytning. Ja, för in vitro-studier som mäter klyvning av fluorogenic peptider och in vivo-proteomik analys bekräftade att ADEP-aktiverad B. subtilis ClpP kunde för att bryta ned proteiner oberoende av AAA+ förordning eller ATP-hydrolys.,51

insikt i denna förlust av reglering har tillhandahållits av kristallstrukturer av ADEP-aktiverad ClpP från E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis och Neisseria meningitidis (figur 4b).52, 53, 54, 55 En ADEP molekylen binder till varje monomer i ClpP tetradecamer i samma vattenavvisande ficka som används av AAA+ ATPases, vilket hämmar deras interaktion (Figur 4d).,52, 55, 56 Bindningen efterliknar ATPas konformationskontroll av ClpP, inducerar inriktningen av serinkatalytisk triad och en stel kroppsrotation av ClpP-monomererna, vilket breddar axialporen från 10-12 Å till 20 Å i E. coli.27, 52, 55 en parningsmekanism tillhandahålls också av n-terminaldomänerna, som rör sig från en ner, eller sluten konformation till en upp, eller öppen konformation på ADEP bindning.,52, 55 ADEP-aktivering tillåter inte stabilt vikta proteiner att försämras, eftersom de fortfarande är för stora för att komma in i ClpP: s axiella lumen, men tillåter instabila proteiner och växande kedjor som kommer från ribosomen att försämras, särskilt om de viks långsamt.57 celldöd anses vara ett resultat av denna urskillningslösa nedbrytning, liksom hämning av normal ClpP-funktion.

ADEPs är aktiva mot en rad grampositiva bakterier, inklusive kliniskt relevanta meticillinresistenta S. aureus( MRSA), vankomycinresistenta enterokocker och penicillinresistenta S., pneumoniae, samt gramnegativa patogener N. meningitidis och Neisseria gonorrheae.51, 54 semisyntetiska ADEP-derivat är effektiva mot Enterococcus faecalis, S. aureus och S. pneumoniae i mus-och råttmodeller med aktivitet överlägsen linezolid, 51 och aktivitet mot MRSA i en Murin periotinitmodell är överlägsen vankomycin.58 resistens mot adepter utvecklas i en frekvens som är så hög som 10-6 hos dessa bakteriearter genom mutationer som minskar ClpP: s funktion, vilket är icke-nödvändigt., Icke desto mindre har kombinationsbehandlingar av ADEP och rifampicin visat sig fullständigt utrota en vankomycinresistent MRSA-population in vitro med hjälp av clpP-mutanter som en fördel.59

ännu mer lovande är ADEPs förmåga att eliminera persisterceller.59 Conlon et al.59 först beskrev denna egenskap när en ADEP effektivt dödade både stationär fas S. aureus och persister S. aureus kvar efter ciprofloxacinbehandling. Detta fynd har konsekvenser för användningen av adepter mot latenta tuberkulosinfektioner orsakade av läkemedelstolerant M. tuberculosis persisters., Hittills har aktivitet mot M. tuberculosis persisters inte beskrivits, men ADEPs har visat sig sakta tillväxten av M. tuberkulos i kombination med två effluxpumpshämmare, reserpin och verapamil.39

Även om ADEPs lovar leads för läkemedelskandidater, har de ogynnsamma farmakologiska egenskaper, inklusive dålig vattenlöslighet, snabb systemisk clearance och kemisk instabilitet.51, 60 efter upptäckten av ADEPs verkningssätt lanserades ett läkemedelskemiskt SAR-program av Bayer AG för att utveckla ett stabilare och potent derivat av ADEP., Detta arbete resulterade i utvecklingen av ADEP4, en mycket potent ADEP1 derivat med tre viktiga ändringar: Phe ersättas med 3,5-difluorophenylalanine, som är tänkt att bilda H obligationer med ClpP, den acyl polyene är ersatt av en α,β-omättade hexenoyl svansen för att förbättra stabilitet och N-MeAla ersättas med pipecolate, vilket ökar ADEP: s styvhet.ADEP4: s aktivitet förbättrades ytterligare av Carney et al.61 genom att ersätta Ser med Allo-Thr och Pip med 4-MePip att ytterligare förstelnar ADEP., Genom att kvantifiera vätedeuteriumväxelkurser med hjälp av 1H NMR, visades rigidifiering av ADEP-molekylen för att stärka de transannulära H-bindningarna och därigenom minska de entropiska kostnaderna för bindning till ClpP. Carney är ADEP derivat har 600-1200 gånger högre potens än ADEP1 mot grampositiva patogener.61

trots den ökade styrkan hos dessa ADEP-derivat har de fortfarande endast begränsad aktivitet mot gramnegativa bakterier och avlägsnas effektivt från cellen genom aktiv efflux, särskilt i M. tuberkulos.,39, 62 många andra syntetiska kemininsatser har utforskat motiv för att övervinna dessa begränsningar, men de flesta har resulterat i minskad aktivitet (figur 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 med tanke på ADEP: s intima bindning i sin hydrofoba ficka är detta resultat kanske förutsägbart och föreslår att modifiering på ADEP-ställningen kan ha nått en dödläge.

två skärmar med hög genomströmning har monterats för att identifiera nya ClpP-aktivatorer.65, 68 båda identifierade småmolekylära aktivatorer av E., coli ClpP genom att använda en in vitro-analys som mäter ökningar i fluorescens orsakad av klyvning av fluorescein isotiocyanat-kasein, ett modellsubstrat för ClpP. I den första, Leung et al.65 screenade 60 000 läkemedels-liknande syntetiska kemikalier och identifierade fem föreningar kallade ACP1-5 (figur 4a). De mest aktiva av dessa föreningar var 10-20 gånger mindre potenta än ADEP1 vid aktivering av ClpP och visade endast blygsam antibakteriell aktivitet även i närvaro av permeabiliserande medel. Lavey et al.,68 i stället skärmad >20 450 svamp-och bakteriella extrakt eller metaboliter och identifierade en enda ClpP aktivator, sclerotiamide (Figur 4a). Detta paraherquamide-relaterade indolinone var 73 gånger mindre potent än ADEP1 på att aktivera EcClpP och det gick inte att hindra tillväxten av utflödet bristfällig E. coli eller Pseudomonas aeruginosa.

trots de begränsade verkningarna av ACPs och sclerotiamid ger dessa studier nya byggnadsställningar för derivatisering och öppnar dörren till framtida studier för att identifiera ClpP-aktivatorer., Man kan till exempel föreställa sig att identifiera alternativa aktiveringsbindningsställen på ClpP. ClpP: s reglering innebär inte bara kontroll av substratinmatning genom att pore breddas på AAA + ATPas association, men också bildandet av serinkatalytisk plats genom oligomerisering till tetradekamrar.69 kanske en liten molekyl som inducerade aktiv platsbildning samtidigt som ClpP upprätthölls som en heptamer kunde möjliggöra enkel åtkomst till denna aktiva plats genom urskillningslösa substrat.,

AAA+ ATPas uncouplers as therapeutics

eftersom ClpP förlitar sig på AAA+ Atpaser för att välja och utveckla proteinsubstrat, kan störning av dessa partners också avreglera ClpP proteolytiska systemet. I synnerhet gäller detta i M. tuberculosis där ClpC1 och ClpX ATPas är väsentliga för cellviabiliteten.40, 41 faktum är att var och en av de tre föreningarna som riktar sig till ClpC1 som hittills kännetecknades av screening av naturliga produktextrakt för anti-M. tuberkulosaktivitet., Den första av dessa som ska upptäckas är cyclomarin A (cymA), en cyklisk heptapeptid som produceras av den marina bakterien Streptomyces sp. CNB-982 (Figur 5a).70 även om det beskrevs 1999 som ett potent antiinflammatoriskt medel med cytotoxicitet mot cancerceller, var det inte förrän 2011 som aktivitet mot M. tuberkulos upptäcktes under en naturlig produkt helcellsskärm.71 i ett första försök att identifiera cymas molekylära mål togs en omvänd genomikstrategi. Men efter ingen spontan resistent M., tuberkulosmutanter kunde återvinnas, affinitetskromatografi användes istället för att visa att cymA riktar sig mot ClpC1 med hög specificitet. Efterföljande samkristalisering av cymA med ClpC1: s n-terminaldomän identifierade rester som är viktiga för bindning och, trots oförmågan att generera spontana resistenta mutanter, tillåtna för skapandet av ClpC1-mutanter som ger resistens mot cymA.72

2014, ecumicin, en makrocyklisk tridecapeptid från Nonomuraea sp., MJM5123,73 och lassomycin, en 16-ledade lasso-peptid från Lentzea kentuckyensis sp., 74 isolerades både genom screening rå aktinomycete extrakt (figur 5a). N-terminaldomänen för ClpC1 identifierades som molekylärt mål för dessa föreningar genom omvänd genomik på spontana resistenta mutanter. Trots cymA, ecumicin och lassomycin delar ett gemensamt mål, strukturell karakterisering och position av mutationer om tilldelning av motstånd till varje förening föreslår att varje binder på en något annorlunda position på N-terminal domän av ClpC1 (Figur 5b)., Till exempel, i motsats till cymA och ecumicin, är lassomycin mycket grundläggande, innehållande flera Arg rester, och bryggor i en mycket sur region av ClpC1. 74

CymA, ecumicin och lassomycin är alla bakteriedödande mot replikering M. tuberkulos, en rad andra mykobakteriella arter, och multidrogresistent M. tuberkulos. Viktigt är att de också är aktiva mot icke-reproducerande M. tuberkulos. I överensstämmelse med bristen på essentialitet av AAA+ Atpaser saknar var och en aktivitet mot andra Gram-positiva och gramnegativa arter som S. aureus och P. aeruginosa., Denna specificitet har fördelar, eftersom de också saknar aktivitet mot commensala medlemmar av human microbiota.

för att orsaka celldöd i M. tuberculosis, ecumicin och lassomycin verkar stimulera ATPas-aktivitet, men koppla bort den från proteinnedbrytning.73, 74 på detta sätt hämmas nedbrytning av naturliga substrat och leder till uppbyggnad och toxicitet, liknande verkan av både ClpP-hämmare och aktivatorer i M. tuberkulos., I motsats till ecumicin och lassomycin har cymA föreslagits öka proteinnedbrytningen, vilket framgår av en minskning av LeuAspAsp tripeptidmärkt grön fluorescerande proteinfluorescens riktad mot ClpC1 på inkubation med cymA.71 det är emellertid möjligt att denna minskning av fluorescensen är resultatet av att ClpC1 utvecklar grönt fluorescerande protein i stället för nedbrytning, och cymA kan därför ha samma frikopplingsmekanism som ecumicin och lassomycin., Flera frågor kvarstår obesvarade om verkningsmekanismen för dessa läkemedel, inklusive deras effekter på proteinutveckling och hur ATPas-aktivitet stimuleras och proteolys hämmas, till exempel genom att hämma interaktion med ClpP1P2. Vidare karakterisering är fortfarande igång för ännu en ClpC1 hämmare nyligen upptäckte, rufomycin analog RUF-I. 75

Trots den relativt höga potens av cymA, ecumicin och lassomycin mot M. tuberculosis, optimering av farmakologiska egenskaper krävs., CymA uppvisar till exempel leverclearance och en kort halveringstid hos möss, och ecumicin har begränsad löslighet och dålig tarmabsorption.13, 73 senaste totalsyntes och fermentationsoptimering kan hjälpa till i denna utveckling.76, 77, 78

även om läkemedel som riktar sig mot ClpC1 är en spännande möjlighet för anti-M. tuberculosis therapeutics, har de i allmänhet inte bakteriedödande aktivitet mot andra arter än aktinobakterier., I dessa arter där ClpP och tillhörande AAA + Atpaser är dispensbara är det möjligt att rikta dessa Atpaser skulle ha antivirala effekter liknande dem som observerats med ClpP-hämmare. En sådan förening skulle dock sannolikt behöva kunna rikta in sig på flera ATPas-partner för att få en så utbredd effekt som direkt åtgärd på ClpP. Dessa potentiella antivirulence effekterna har inte undersökts för cymA, lassomycin eller ecumicin.,

uppnå specificitet

av de bakteriella proteolytiska komplexen, alla utom HslUV har en mänsklig ortholog och många är faktiskt intensivt studerade som potentiella anticancermål. Till exempel, mitokondriell proteaser LONP1, ClpXP och m-AAA (FtsH homolog) har viktiga roller i kvalitetskontroll i mitokondrierna, särskilt under luftvägarna stress.79 mutationer i m-AAA är också inblandade i spastisk paraplegi, en ärftlig neurodegenerativ sjukdom.80 som sådan är det viktigt att antimikrobiella medel kan rikta in sina bakteriella homolog specifikt.,

När det gäller proteashämmare som syftar till att fungera som självmordssubstrat kan det vara svårt att uppnå specificitet på grund av konserverade katalytiska mekanismer. Faktum är att brist på specificitet har påträffats i ansträngningar för att utveckla hämmare av både prokaryotisk proteasom och bakteriell Lon-proteas. Prokaryotisk proteasom i M. tuberculosis ger ett lovande mål för hämning, eftersom det är dispensbart för tillväxt in vitro men är viktigt för överlevnad av kväveoxidstress81 och persistens hos möss.,62, 82 många försök har gjorts för att utveckla ett läkemedel mot mykobakterialproteasomen, vanligtvis som peptidylepoxyketoner, aldehyder eller boronater, men de flesta hämmar däggdjursproteasomen mer potent än för M. tuberkulos.83 selektivitet saknar dock motstycke, vilket framgår av upptäckten av oxatiazol-2-on-föreningarna GL5 och HT1171 (Figur 6). Dessa föreningar är bakteriedödande mot icke-replikerande M., tuberkulos behandlas med subinhibitoriska nivåer av kväveoxid21 och har >1000-faldigt ökad aktivitet mot mykobakteriella över humana proteasomer. Specificitet tros ges genom interaktion mellan läkemedlet och rester utanför det aktiva stället som inte konserverats i däggdjursproteasomer.21

Lon gör också för en lovande måltavla, eftersom det har varit inblandad i biofilm formation, motilitet och stresstolerans, och mutanter har visat sig ha reducerad kolonisering och virulens hos Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, Vibrio cholera och P. aeruginosa.84, 85, 86, 87 i den enda ansträngningen hittills för att identifiera bakteriella Lon-hämmare, proteasomhämmare screenades in vitro och peptidylboronat MG262 identifierades.,18 emellertid är denna förening fortfarande 2000-faldigt mer potent mot 20s proteasom.I likhet med oxatiazol-2-on-föreningar kommer det sannolikt att krävas att rester som skiljer sig åt i humana homologer utvecklar en mycket specifik Lon-hämmare.

specificitet kan också uppnås genom att flytta utanför det katalytiska aktiva stället till bindningsställen som perturb proteasfunktionen, men som är dåligt bevarade mellan människa och bakterier ortologer. ADEPs visar träffande potentialen i detta tillvägagångssätt., Även om de inte direkt har testats på mänskliga ClpP (hClpP), ADEPs är icke-giftigt för mänskliga celler upp till 25 µg ml−1, vilket tyder på att de har dålig, om någon, affinitet för det mänskliga enzymet.58 Strukturell jämförelse av E. coli (EcClpP) och hClpP stöder denna uppfattning. Deras ryggradsstruktur är i stor utsträckning bevarad, med en rotmedelkvadrerad avvikelse på 0.,63 Å;88 dock inspektion av den vattenavvisande ficka som används för ADEP bindande visar att hClpP har flera ersättningar minska dess vattenavvisande egenskaper (Asn55Pro, His60Tyr och His112Phe) tillsammans med en avgift inversion (Glu56Lys) på den distala delen av den för groove. Det är mycket möjligt att dessa förändringar kommer att förhindra ADEP bindande i hClpP. Det bör dock noteras att EcClpX, men inte EcClpA, kan aktivera hClpP.88 i vilket fall som helst kan sökandet efter läkemedel som binder mindre bevarade regleringsställen vara nyckeln till att hitta mycket specifika antibakteriella medel.