Madame Lelica

SSF concept

ideea de efectuarea enzimatice de hidroliză și de fermentație simultan a fost înaintat de către Gauss et al. într-un brevet din 1976 ., Autorii au declarat că randamentul glucozei într-o hidroliză enzimatică separată tradițională (folosind enzime produse de ciuperca Trichoderma reesei) a fost scăzut, probabil datorită inhibării produsului final al hidrolizei de către glucoză și celobioză. Autorii ar putea totuși să arate că au obținut un randament global mai mare de etanol atunci când au utilizat SSF, pe care l-au atribuit eliminării glucozei și celobiozei prin fermentație și eliberarea consecutivă a inhibării produsului final., Termenul SSF (abrevierea SSF este adesea folosită și pentru fermentarea în stare solidă) nu a fost folosit de autori la acea vreme, dar a devenit notația comună pentru acest proces în doar câțiva ani de la invenția originală. Evitarea inhibării produsului final este încă probabil cel mai important motiv pentru utilizarea SSF, dar există câteva avantaje potențiale suplimentare. Gauss și colegii săi au menționat, de exemplu, avantajul că glucoza nu trebuie separată de fracțiunea de lignină după o etapă separată de hidroliză enzimatică, evitând astfel o posibilă pierdere de zahăr., În plus, combinația de hidroliză și fermentare scade numărul de nave necesare și, prin urmare, costurile de investiții. Scăderea investițiilor de capital a fost estimată a fi mai mare de 20%. Acest lucru este destul de important, deoarece costurile de capital pot fi comparabile cu costurile materiilor prime în producția de etanol din lignoceluloză . Alte avantaje, legate de co-consumul de pentoză și hexoză zaharuri, și detoxifiere au devenit evidente mai recent, așa cum vor fi discutate mai târziu în această revizuire.,în mod inevitabil, există și dezavantaje ale SSF în comparație cu procesul separat de hidroliză și fermentare (SHF). Temperatura optimă pentru hidroliza enzimatică este de obicei mai mare decât cea a fermentației – cel puțin atunci când se utilizează drojdie ca organism de fermentare. Într-un proces SHF, temperatura pentru hidroliza enzimatică poate fi optimizată independent de temperatura de fermentație, în timp ce un compromis trebuie găsit într-un proces SSF. În plus, drojdia nu poate fi refolosită într-un proces SSF din cauza problemelor de separare a drojdiei de lignină după fermentare., Prin urmare, drojdia va reprezenta în mod necesar o pierdere de randament într-un proces SSF, dacă drojdia este produsă din carbohidrați în cadrul procesului (a se vedea Figura 1) sau un cost de funcționare dacă este furnizată extern. Enzimele sunt la fel de dificil de reutilizat, de asemenea într-un proces SHF. Enzimele sunt fie produse în cadrul procesului (a se vedea Figura 1) – reprezentând astfel o pierdere de substrat – fie sunt furnizate extern și, prin urmare, se adaugă la costurile chimice., Recircularea enzimelor este la fel de dificilă, deoarece enzimele se leagă de substrat, deși se poate obține o desorbție parțială după adăugarea de surfactanți .

disponibilitatea materiilor prime lignocelulozice variază în funcție de locația geografică (vezi de ex., Kim și Dale), iar materiile prime lignocelulozice sunt destul de eterogene atât din punct de vedere al structurii, cât și al compoziției chimice (vezi Tabelul 1). Această eterogenitate are un impact puternic asupra proiectării procesului, afectând practic toate etapele procesului, adică manipularea mecanică a materialului, condițiile de pretratare, alegerea enzimelor și tulpinilor de drojdie, precum și separarea și proprietățile ligninei rămase. Acest lucru va deveni evident în discuția de mai jos.,

Pretratare

scopul de pretratare este de a modifica lignocelulozice structura și de a crește rata de hidroliză enzimatică în principal din celuloză. Acest lucru trebuie făcut cu o formare minimă de compuși, care inhibă microorganismele de fermentare . Suprafața accesibilă este considerată ca fiind unul dintre cei mai importanți factori care afectează eficacitatea degradării enzimatice a celulozei ., În lemn nativ doar o mică parte din capilarele peretelui celular sunt accesibile enzimelor . Pretratare, cu toate acestea, crește spațiul disponibil în mai multe moduri ; i) fragmente și fisuri sunt formate randament crescut zonă , ii) hemiceluloză fracțiune este hidrolizată care diminuează protectie efecte , iii) lignina, de asemenea, suferă modificări structurale și lemnul este delignified la diferite grade, în funcție de pretratare tehnologie . Astfel, ecranarea microfibrilelor și ocluzia porilor, cauzată de lignină, pot fi îndepărtate., Alți factori, despre care se crede că influențează digestibilitatea în SSF, sunt cristalinitatea substratului și gradul de polimerizare (DP) .metodele de pretratare pot fi împărțite în metode fizice și chimice, iar combinațiile acestor două sunt utilizate în mod obișnuit (a se vedea, de exemplu, recenzia scrisă de Mosier et al. ). Tipul de materie primă afectează puternic alegerea metodei de pretratare. Hemiceluloza este, de exemplu, acetilat într-un grad ridicat în materiale bogate în xilan., Deoarece Acetatul este eliberat în timpul hidrolizei, pretratarea acestor materiale este într-o oarecare măsură autocatalitică și necesită mai puțin acid adăugat și condiții de proces mai blânde. Cu toate acestea, acetatul eliberat adaugă la toxicitatea hidrolizatelor de hemiceluloză.

Amoniac fibre/freeze explozie (AFEX) pretratarea este privit ca o metodă atractivă pentru pretratare a reziduurilor agricole, obținându-se extrem de celuloză digestibilă . AFEX depolimerizează lignina, îndepărtează hemiceluloza și decristalizează celuloza ., Temperatura moderată și pH-ul minimizează, de asemenea, formarea produselor de degradare a zahărului. Cu toate acestea, metoda suferă de costuri ridicate de recuperare a amoniacului și a amoniacului . În acest context, trebuie menționată și metoda varului, bazată pe hidroxid de calciu (sau sodiu). Alcaline cromate sunt rulate la temperaturi mai mici de lungă ședere ori, și ca pentru AFEX metodă, o delignificare de biomasa este obținută.

explozia aburului este o metodă de pretratare intens studiată ., Efectele exploziei aburului necatalizat – și pretratării apei calde lichide-asupra biomasei sunt atribuite în primul rând eliminării hemicelulozelor. Prin adăugarea unui catalizator acid, hidroliza poate fi îmbunătățită în continuare . Pretratările acide diluate folosind H2SO4 sau SO2 sunt cele mai investigate metode de pretratament datorită eficacității și ieftinității lor. Aceste metode au fost aplicate în instalațiile pilot și, prin urmare, sunt aproape de comercializare . Tratamentul catalizat cu Acid îmbunătățește eliminarea hemicelulozei, dă o hidroliză parțială a celulozei și modifică structura ligninei ., Principalele dezavantaje sunt legate de cerințele echipamentelor de proces și formarea inhibitorilor . Până în prezent, cu succes cromate cu alcaline, AFEX și lichide, apă caldă s-au limitat la reziduuri agricole și culturile erbacee , întrucât acide catalizată de aburi cromate au generat ridicat de zahăr randamentele din aceste materiale, precum și de rasinoase materii prime .o simplă cuantificare a durității unui proces de pretratare a aburului este așa-numitul factor de severitate, log (R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Pentru acid catalizat pretratments factorul de severitate combinate, log (CS), este uneori folosit. Acest lucru ia, de asemenea, pH – ul în considerare, log(CS) = log(R0) – pH, și valorile tipice pentru acid catalizat abur explozie pretratare de rasinoase sunt în intervalul 2 la 4 .condițiile optime de pretratare într-un proces SSF nu diferă neapărat mult de cele ale unui proces SHF care utilizează biomasă lignocelulozică. Cu toate acestea, mai mulți compuși prezenți în hidrolizații pretratament, care inhibă hidroliza enzimatică sunt transformați de organismele de fermentare., Aceasta este o explicație probabilă în spatele randamentelor mai mari raportate de etanol în SSF comparativ cu SHF . Prin urmare, formarea inhibitorilor din pretratament poate fi tolerată într-o măsură mai mare într-un proces SSF. Compușii inhibitori pot fi puși în trei grupe majore; furaldehide, acizi slabi și fenoli. Cele două furaldehide cele mai comune, HMF (5-hidroximetil-2-furaldehidă) și furfural (2-furaldehidă), se formează în condiții severe din hexoze și, respectiv, pentoze ., Acizii slabi din materialele lignocelulozice, cum ar fi acidul acetic, formic și levulinic, se formează în principal prin de-acetilarea hemicelulozei sau a descompunerii HMF . Compușii fenolici se formează în principal în timpul descompunerii ligninei și se găsesc în numeroase variante, în funcție de tipul de lignină . Pentru o discuție mai aprofundată asupra inhibiției, a se vedea, de exemplu, revizuirea de către Almeida et al .

hidroliza enzimatică

o pretratare reușită a îndepărtat în mare măsură hemiceluloza, lăsând celuloza disponibilă pentru hidroliză., Deoarece microorganismele cele mai frecvent utilizate pentru producția de etanol utilizează exclusiv monomeri de zahăr, celuloza trebuie hidrolizată, care într-un SSF are loc concomitent cu fermentația. Istoric, digestia celulozei industriale a fost făcută cu hidroliza acidă și optimizarea hidrolizei acide a diferitelor materiale lignocelulozice au fost efectuate în scopuri de producere a etanolului ., Cu toate acestea, hidroliza acidă produce hidrolizați care sunt relativ toxici pentru microorganismele de fermentare, iar randamentul maxim de glucoză este limitat la aproximativ 60% într-un proces lot din motive cinetice . Degradarea enzimatică a fracției de celuloză, pe de altă parte, are potențialul de a produce hidrolizați relativ netoxici cu randamente mai mari de zahăr.

enzime specializate în descompunerea β-1-4-legăturile glicozidice ale glucanului sunt denumite colectiv celulaze. În 1950, Reese et al au prezentat un model de hidroliză enzimatică a celulozei pe baza mai multor enzime (C1 și CX)., S-a presupus că enzima C1 produce lanțuri de polianhidro-glucoză mai scurte, în timp ce solubilizarea a fost atribuită enzimei CX. Practic aceeași imagine se aplică astăzi, dar a existat un progres imens în cunoașterea tuturor diferitelor componente enzimatice specifice implicate. De celulaze sunt împărțite în trei sub-categorii, reprezentând trei tipuri de activitate: endoglucanases, exoglucanases (cellobiohydrolases) și β-glucosidases., Endoglucanazele reduc semnificativ gradul de polimerizare a substratului prin atacarea aleatorie a părților interioare, în principal în regiunile amorfe ale celulozei. Exoglucanazele (sau celobiohidrolazele), pe de altă parte, scurtează treptat moleculele de glucan prin legarea la capetele glucanului și eliberarea în principal a unităților de celobioză. În cele din urmă, β-glucozidazele împart celobioza dizaharidică în două unități de glucoză.,mai multe tipuri de microorganisme pot produce sisteme de celulază, inclusiv ciuperci filamentoase aerobe, actinomicete aerobe, bacterii hipertermofile anaerobe și ciuperci anaerobe (vezi de exemplu revizuirea de Lynd et al. ). Cercetările Intensive asupra fungilor filamentoși aerobi T. reesei din ultimele decenii au dus la un organism eficient producătoare de celulază, care domină în prezent producția industrială de celulază .după cum sa menționat deja, un avantaj important cu SSF în comparație cu SHF este reducerea inhibării produsului final de către zaharurile formate în hidroliză., Etanolul produsului de fermentație inhibă, de asemenea, hidroliza, dar într-o măsură mai mică decât celobioza sau glucoza . Un alt avantaj este că inhibitorii din pretratament pot fi metabolizați de microorganisme . Cu toate acestea, procesul SSF poate suferi și de hidroliza incompletă a fracției lignocelulozice solide. Cu excepția inhibiției de către produsele finale sau alte componente , aceasta se poate datora dezactivării enzimei, adsorbției enzimatice neproductive , scăderii disponibilității capetelor lanțului și creșterii cristalinității cu conversia celulozei pretratate .,într-un SSF industrial, concentrațiile de enzime și celule ar trebui să fie echilibrate corespunzător pentru a minimiza costurile pentru producția de drojdie și enzime. Sinergiile dintre enzime , de exemplu endo-EXO-sinergismul , exo – exo-sinergismul și sinergismul dintre endo-sau exoglucanaze și β-glucozidaze , ar trebui, de asemenea, optimizate prin reglarea compoziției amestecurilor enzimatice. Compoziția optimă va depinde cu siguranță de materia primă lignocelulozică.,

Fermentare microorganisme

cerințe generale pe un organism pentru a fi utilizate în producția de etanol este că ar trebui să dea o mare etanol randament, o productivitate ridicată și să fie capabil să reziste la mari concentrații de etanol, în scopul de a menține cheltuielile de distilare scăzut . În plus față de aceste cerințe generale, toleranța la inhibitor, toleranța la temperatură și capacitatea de a utiliza mai multe zaharuri sunt esențiale pentru aplicațiile SSF. Toleranța față de valorile scăzute ale pH-ului va reduce la minimum riscul de contaminare., Calul de lucru în producția de amidon sau de etanol pe bază de zaharoză este drojdia de panificație comună, Saccharomyces cerevisiae. Acest organism produce etanol la un randament ridicat (mai mare de 0,45 g g-1 în condiții optime) și o rată specifică ridicată (până la 1,3 g g-1 masă celulară h-1 ). De asemenea, are o toleranță foarte mare la etanol, peste 100 g L-1 a fost raportat pentru unele tulpini și medii . În plus, organismul sa dovedit a fi robust față de alți inhibitori și, prin urmare, este potrivit pentru fermentarea materialelor lignocelulozice .,hemiceluloza din lemn de esență tare și reziduurile agricole sunt de obicei bogate în xilani (cf. Tabelul 1) – Lemn de esență tare care conține în principal o-acetil-4-O-metil-glucuronoxilan, în timp ce ierburile conțin arabinoxilan . Hemiceluloza din lemn de esență moale, pe de altă parte, conține mai multe manane – în primul rând sub formă de galactoglucomannan – și mai puțin xilan. Fermentarea manozei este în mod normal eficientă în S., cerevisiae, în timp ce capacitatea de fermentare a galactozei este dependentă de tulpină , iar genele pentru utilizarea galactozei sunt în plus reprimate de glucoză , ceea ce duce la o utilizare secvențială tipică a zaharurilor. În mod evident, fermentarea xilozei este o problemă mai importantă pentru reziduurile agricole și lemnul de esență tare decât pentru lemnul de esență moale. Xiloza nu este metabolizată de S. cerevisiae de tip sălbatic, cu excepția unei reduceri minore la xilitol. Aceasta, și pentru unele părți toleranța la temperatură, au fost principalul motiv din spatele interesului de a testa și alte microorganisme pentru Conversia lignocelulozei în SSF.,

în mod Natural xiloză-fermentare drojdii, cum ar fi Pichia stipitis și Candida shehatae , ar putea fi avantajos să se utilizeze în SSF din materiale de înaltă xilan conținutul. Cu toate acestea, toleranța lor la inhibitoare compuși în undetoxified transformarea lignocelulozei hydrolyzates este destul de scăzut , și, în plus, un nivel foarte scăzut și bine controlate furnizarea de oxigen este necesar pentru eficienta xiloză fermentare . Principalii „concurenți” ai drojdiei au fost bacteriile Zymomonas mobilis și Escherichia coli modificate genetic. Z., mobilis, o bacterie anaerobă obligatorie, care nu are un sistem funcțional de fosforilare oxidativă, produce etanol și dioxid de carbon ca produse principale de fermentație. Interesant este că Z. mobilis utilizează calea Entner-Duodoroff, care oferă o producție mai mică de ATP pe glucoză catabolizată . Aceasta, la rândul său, dă un randament mai mic de biomasă și un randament mai mare de etanol pe glucoză în comparație cu S. cerevisiae . Cu toate acestea, tipul sălbatic Z. mobilis nu are capacitatea de a fermenta zaharurile de pentoză, iar un dezavantaj major este, de asemenea, că nu este un organism foarte robust., În general , bacteriile par a fi mai puțin tolerante la inhibitorii derivați de lignoceluloză și poate fi necesară o etapă de detoxifiere înainte de fermentație. Spre deosebire de drojdia de panificație și Z. mobilis, E. coli este capabilă să metabolizeze o mare varietate de substraturi (inclusiv hexoze, pentoze și lactoză), dar organismul de tip sălbatic are o cale fermentativă mixtă și este astfel un producător slab de etanol. Într-o contribuție de referință, acordat numărul de brevet american 5000000 , o tulpină de E., coli a fost modificat genetic într-un producător de etanol prin supraexprimarea PDC (care codifică piruvat decarboxilaza) și adhB (care codifică alcool dehidrogenaza) de la Z. mobilis . Rezultate excelente au fost obținute cu recombinant E. coli, de exemplu KO11 tulpina, care au arătat etanol randamentele de la 86 la aproape 100% din teoretică, și finală etanol concentrații de până la 40 g L-1 pe hemiceluloză hydrolyzates de trestie de zahăr, porumb stover și porumb coji ., Cu toate acestea, doar fracțiunea lichidă a fost folosit raportat în studii, și hydrolyzates au fost mai mult detoxifiat înainte de utilizarea de către overliming la pH 9 cu hidroxid de calciu și apoi ajustat la pH 6.0–6.5 cu HCl. În plus, deoarece pH-ul optim este 6.5, E. coli este mai puțin potrivit pentru procesele SSF cu celulaze T. reesei, care în general este considerat a avea un pH optim în jurul valorii de 4.8 .

fermentarea Pentozei prin inginerie S. cerevisiae

datorită proprietăților foarte atractive ale S., cerevisiae în fermentațiile industriale, s-au depus eforturi semnificative în ultimele decenii pentru a proiecta tulpini de fermentare recombinante de xiloză și arabinoză ale acestei drojdii. Tulpinile de xiloză care fermentează S. cerevisiae pot fi construite în principal fie prin introducerea genelor care codifică izomeraza xiloză (XI) din bacterii și ciuperci , fie prin gene care codifică xiloză reductază (XR) și xilitol dehidrogenază (XDH) din ciuperci . De asemenea, gena endogenă xks1 care codifică xilulokinaza (XK) trebuie supraexprimată pentru a obține o fermentare semnificativă a xilozei ., Proteinele de Transport sunt necesare pentru absorbția xilozei, precum și a altor zaharuri în drojdie. În S. cerevisiae, s-a constatat că xiloza este transportată de transportorii de hexoză,, dar afinitatea pentru xiloză este de aproximativ 200 de ori mai mică decât pentru glucoză . În consecință, absorbția xilozei este inhibată competitiv de glucoză.

sunt 20 de gene diferite de codare zahăr de transport legate de proteine, 18 sisteme individuale (Hxt1-17 și Gal2) și două legate de semnal proteine (Snf3p și Rgt2p)., Transportorii prezintă afinități diferite pentru zaharuri, iar expresia genelor lor corespunzătoare este reglementată de concentrațiile de zahăr, adică disponibilitatea sursei de carbon . S – a sugerat anterior că xiloza este preluată atât de sistemele transportoare de glucoză cu afinitate mare, cât și de cele cu afinitate mică (Figura 2), dar absorbția este crescută în prezența unor concentrații scăzute de glucoză . Studiile au indicat faptul că de înaltă și intermediară afinitate hexoze transportatorii; Hxt4, Hxt5 Hxt7 și Gal2 sunt în fapt cele mai importante transportatorii de xiloză ., În plus, s-a demonstrat că este necesară o concentrație scăzută (dar diferită de zero) de glucoză în mediu pentru o absorbție eficientă a xilozei . Acest lucru a fost explicat printr-o nevoie de glucoză pentru exprimarea enzimelor glicolitice și a intermediarilor , precum și generarea de metaboliți intermediari pentru etapele inițiale ale metabolismului xilozei și calea fosfatului de pentoză . O altă explicație posibilă, dedusă atât din experimente, cât și din modelarea pe calculator, este că glucoza este necesară pentru exprimarea transportorilor de hexoză cu proprietăți favorabile de transport al xilozei, de exemplu Hxt4 ., Prin urmare, în scopul de a obține eficiente de co-fermentarea xilozei și glucoză în SSF (uneori notată SSCF – zaharificarea și co-fermentare) cu recombinare a S. cerevisiae, este necesar pentru a menține concentrația de glucoză scăzută, care a fost demonstrat în practică în ultimii SSF studii .