Madame Lelica

Structura de ACLY cu CoA dezvăluie productive și neproductive CoA conformații

Am produs recombinant, full-lungime ACLY în Escherichia coli pentru toate biochimice și structurale analize (Extended Date Fig. 1A,b)., Fluorimetria de scanare diferențială a enzimei cu diferiți cofactori a confirmat legarea și potențialele modificări structurale asociate cu liganzii adăugați singuri sau în combinație (date extinse Fig. 1C). Am folosit aceste date pentru a ghida determinarea structurii ACLY cu co-substraturile sau co-produsele sale.

am preparat proteina recombinantă și am efectuat inițial o analiză negativă a unei singure particule a proteinei în absența oricăror metaboliți (ACLY-apo)., Mediile clasei bidimensionale (2D) de la 3.000 de particule au confirmat că proteina a format un tetramer (date extinse Fig. 2A,b). Pentru a obține mai multe detalii structurale, am efectuat un studiu crio-EM asupra complexului ACLY-citrat-CoA. După mai multe runde de optimizare a probelor crio-EM, am determinat structura crio-EM simetrică D2 a structurii acly–citrat-CoA la o rezoluție generală medie de 3,0 Å. (Date Extinse Fig. 2C, d, 3 și 4 și Tabelul 1).,

ACLY–citrat-CoA structura formează un homotetramer cu o centrală tetramerică CSH module și două ASH domenii pe capetele opuse ale CSH module (protomers 1 & 2 și 3 & 4) (Fig. 1A,b). Domeniul cenușii (reziduurile 1-806) adoptă o structură foarte asemănătoare cu arhitectura α/β raportată anterior a domeniului N-terminal izolat legat de citrat și ADP24., De CSH domeniu (reziduuri 859-1101) este format exclusiv din spirale și bucle scurte, cu omologie structurală de la un dimer de citrat sintetazei dimeri care trec de la ~unghiuri de 90° (Extended Date Fig. 5a). Domeniile de cenușă și CSH ale fiecărui lanț polipeptidic sunt conectate printr-o regiune de bobină extinsă ~50-reziduu, cu excepția unei scurte α-helix între reziduurile 824 și 829. Regiunea elicoidală din cadrul acestui linker este singurul punct de contact semnificativ (prin interacțiunea van der Waals) între cele două domenii de cenușă de pe o parte a moleculei., Linker-ul extins permite CSH-ului unei subunități să interacționeze cu domeniul de cenușă al unei alte subunități de-a lungul părții opuse a modulului CSH. În contrast relativ rare interacțiuni între CENUȘĂ protomers, la CSH domenii forma o rețea extinsă de predominant van der Waals interacțiuni care ar sugera că CSH domenii funcționa ca un rigid tetramerică module, în timp ce patru ASH domenii sunt mai flexibile. Acest lucru este în concordanță cu estimarea observată a rezoluției locale EM pe harta EM fiind cea mai mare la domeniul CSH (2.8 Å, date extinse Fig., 4C) și observațiile noastre anterioare conform cărora domeniul CSH are o temperatură de topire mai ridicată față de cenușă de ~75 °C față de ~55 °C, respectiv21.

CoA se leagă la interfața dintre domeniile CSH și cenușă ale subunităților separate și pare să „capseze” superdomenele împreună. La bază adenina și riboza inel interacționa cu CSH domeniu de un monomer și pantotenic braț și β-mercapto grup lipirea în site-ul activ de CENUȘĂ domeniu de o altă subunitate (Fig. 1C (stânga) și Fig. 1d (stânga))., Modelarea CoA se bazează pe observația că grupul ADP fosforilat este bine rezolvat în densitatea crio-EM. Cu toate acestea, grupul mercapto nu a fost bine rezolvat, sugerând flexibilitatea acestei regiuni. Deși mai multe reziduuri de CSH și CENUȘĂ domenii face van der Waals interacțiuni cu CoA, legături de hidrogen din S574, R576 și S577 de CENUȘĂ domeniu și K964 de CSH domeniu la riboza fosfat de oxigen par să joace un rol deosebit de important în capsare CoA la ASH–CSH interfață., Interesant este că e599 se află la o distanță de legare a hidrogenului față de atomul de sulf modelat al CoA, ceea ce implică faptul că ar putea juca un rol catalitic important. Importanța de proteine–CoA interacțiuni de CENUȘĂ și CSH domeniu este susținută de mutatii sensibilitate de reziduuri R576 și K964, și potențialul rol de catalizator al E599 este susținută de mutatii sensibilitate la O sau Q dar nu D (Fig. 1F). Deși citratul a fost inclus în eșantionul pentru reconstrucția crio-EM, acesta nu a putut fi rezolvat cu încredere în harta crio-EM.,

Având în vedere nerezolvate densitate pentru mercapto grup de CoA, am efectuat o altă reconstrucție a ACLY–citrat-CoA structura fără a impune D2 simetrie pentru a determina dacă Cc ar putea adopta diferite conformații în diferite protomers. Am reușit să pregătim o reconstrucție fără a impune simetrie (C1, asimetrică închisă) la o rezoluție nominală de 3,5 Å. În această structură închisă asimetrică ACLY–citrat-CoA-C1, rezoluția în jurul domeniului ASH este mai slabă decât în structura D2, dar rezoluția locală în jurul domeniului CSH rămâne relativ ridicată, de la 2,8 la 3,2 Å., Analiza acestei structuri închise asimetrice ACLY–citrat-CoA-C1 a arătat că fiecare dintre domeniile de cenușă și trei dintre cele patru domenii CSH și molecule CoA au adoptat aceeași configurație ca structura D2. Cu toate acestea, una dintre moleculele CoA adoptă o conformație alternativă în care partea fosforilată ADP este deplasată ~8 Å spre modulul CSH și brațul pantotenic este aplecat pentru a interacționa cu CSH (Fig. 1b, c (dreapta) și Fig. 1e). Densitatea crio-EM corespunzătoare acestei conformații CoA alternative este foarte clară (Fig. 1c (dreapta))., Remarcabil, crio-EM densitatea este de observat, de asemenea, pentru o bine-dispus moleculă de apă, care apare la podul de legatura de hidrogen, interacțiuni între borna atom de sulf de CoA cu lanț lateral reziduuri de H900, D1026 și R1065 suplimentare van der Waals interacțiuni din L969, I973, H975 și R976 (Fig. 1d (dreapta)). Concomitent cu această conformație CoA alternativă, o buclă din domeniul CSH (reziduurile 965-986) și helicele de flancare se deplasează pentru a acomoda poziția alternativă a bazei de adenină CoA (Fig. 1e)., Mutații ale H975, R976, D1026 și R1065 să alanina toate show compromis activitate, sugerând că legarea de CoA la CSH domeniu este cumva implicat în activitatea enzimei (Fig. 1F). Având în vedere că CoA trebuie să reacționeze cu citratul în domeniul cenușii, ne referim la conformațiile CoA cu cisteamina brațului pantotenic care indică spre cenușă și CSH ca fiind conformații CoA „productive” și „neproductive”, respectiv, legate de ACLY.,

Structura ACLY–citrat-CoA subpopulații dezvăluie asimetrice ASH orientări

În plus față de marile ACLY–citrat-CoA particule populației, reprezentând 57% din clasa 3 de particule, o subpopulatie de ACLY–citrat-CoA complex de particule, reprezentând 23% din subclasa de particule (10% din total) a fost, de asemenea, capturat într-o reconstrucție 3D fără a impune o simetrie la o rezoluție de 4.3 Å (Extended Date Fig. 3)., Această subpopulație de particule are o structură de ansamblu, care este similar cu marile ACLY–citrat-CoA populației, cu excepția faptului că unul din patru ASH domenii este rotit ~50° față de cel mai apropiat de CENUȘĂ subunitate să adopte o mai „deschis” conformație, așa că ne referim la ea ca ‘ACLY–citrat-CoA-C1 asymm deschis’. În această structură, densitatea este vizibilă numai pentru partea fosforilată ADP a două molecule CoA legate de două domenii simetrice de cenușă (Fig. 2A,b). Una dintre subunitățile Ash simetrice și asimetrice nu prezintă dovezi pentru legarea CoA., În special, domeniul Ash asimetric pare incompatibil cu legarea CoA productivă (Fig. 2c). Ne propunem ca în acest ACLY–citrat-CoA-C1 asymm structură deschisă reprezintă o stare intermediară de ACLY, în cazul în care două site-uri active sunt amorsate pentru cataliză și două nu. Observarea acestei structuri sugerează, de asemenea, că cele patru situri ACLY active pot funcționa independent.

Structura ACLY-apo stat este nefavorabil pentru CoA obligatorii

Având în vedere numărul limitat de interacțiuni între CSH și CENUȘĂ domenii, ne-am întrebat despre structura ACLY în absența legat de liganzi. Pentru a face acest lucru, am determinat structura cryo-EM A ACLY în forma apo, pe care am reușit să o rezolvăm la rezoluția 4.3-Å (date extinse Fig. 4a și Tabelul 1)., O comparație a ACLY-apo și ACLY–citrat-CoA structuri relevă faptul că, în apo stat, fiecare dintre FRASIN perechi pe capetele opuse ale spectrina sunt rotite unul față de celălalt de ~10° pentru a forma o mai deschide ACLY spectrina și de la locul de CENUȘĂ domenii în poziții care par să defavorizeze productive CoA obligatorii (Fig. 3). În mod special, FRASIN bucle centrat pe F533, S574 și K1018 (de la adiacente CSH domeniu) ar conflict cu CoA fi legat în ACLY–citrat-CoA structură (Fig. 3b)., În plus, cele două reziduuri care sunt în termen de hidrogen-lipire distanta de la CoA din CENUȘĂ domeniu, R576 și E599, mut de hidrogen-lipire distanța în ACLY-apo structură (Fig. 3c). Între timp, modulul CSH rămâne în mare parte neschimbat între cele două structuri. Împreună, o comparație a ACLY-apo și ACLY–citrat-CoA structuri relevă faptul că ACLY-apo structură trebuie să rearanja pentru a se potrivi CoA substrat.

ACLY–acetil-CoA–OAA complex dezvăluie CoA–liază citrat de reacție apare în CENUȘĂ domeniu

scanare Diferențială fluorimetry date a arătat că atât în acetil-CoA și OAA produse stabilizat ACLY proteine (Extended Date Fig. 1C)., Această constatare a indicat că am putea capta complexul de produse ACLY-OAA-acetil-CoA și astfel să înțelegem mai bine mecanismul de reacție. În acest scop, am determinat structura crio-EM a complexului, pe care am rezolvat-o la rezoluția 3.1-Å folosind simetria D2 (date extinse Fig. 4). Structura generală a ACLY–co-produs complex a fost cel mai similar cu cel simetric ACLY–co-substrat (ACLY–citrat-CoA-D2) complexe, cu un ansamblu de rădăcină-mean-square abatere (r.m.s.d.) de 0.407 Å pentru Ca atomi (Fig. 4a)., Am constatat că acetil-CoA ocupat același caracter obligatoriu ca site-ul CoA și a fost, de asemenea, stabilizat prin aceeași bază de reziduuri, R576 și K964 (Fig. 4b). În plus, am reușit să modelăm fără echivoc două molecule OAA legate de fiecare subunitate ACLY (Fig. 4b,c). Unul OAA moleculă (OAA1) se suprapune cu citrat de legare buzunar în CENUȘĂ domeniu și proximal gruparea acetil de la acetil-CoA. OAA1 face relativ modeste interacțiuni cu proteine, inclusiv legăturile de hidrogen pentru a N346 și T348 și van der Waals interacțiuni cu F547., Alte OAA moleculă (OAA2) este obligat să CSH domeniu și de a face mai extinse interacțiuni cu ACLY decât OAA1. OAA2 contact cu CSH modul prin legături de hidrogen pentru a H900, D1026, R1065 și R1085 și prin van der Waals interacțiuni pentru a F935 și F1061 de la o subunitate, precum și printr-o legătură de hidrogen pentru a R1065 de la o altă subunitate (Fig. 4c). OAA2 se suprapune cu bine legat OAA în inimă de porc citrat synthase25 (Extended Date Fig. 5b).

Avem, de asemenea, rafinat crio-EM hartă a ACLY–OAA–acetil-CoA structură fără constrângeri de simetrie și a obținut o structură identică cu D2 simetrie, cu excepția faptului că unul din patru acetil-CoA molecule arătat două conformații posibile ale pantotenic brațul de acetil-CoA, unul cu cisteamină de CoA spre ASH domeniu, ca și în alte trei protomers, și alte către CSH domeniu (Extended Date Fig. 6a)., Cu toate acestea, spre deosebire de conformația alternativă a CoA Găsită în structura acly–citrat-CoA, poziția grupului ADP fosforilat nu s-a modificat în aceste două conformații. Conformația alternativă potențială a acetil-CoA ar putea sugera o posibilă cale de eliberare a substratului în turnover-ul enzimatic sau o stare autoinhibitorie a enzimei (discutată mai jos).

observarea OAA1 și acetil-CoA produse în CENUȘĂ domeniu sugerat că liază chimie se desfășoară acolo, în contrast cu propunerile anterioare că această chimie este efectuată în CSH domain22,23., Putem specula că OAA2 poate să funcționeze pentru a ajuta la organizarea CSH domeniu de cooperare cu CENUȘĂ de domeniu și/sau să acționeze ca un al doilea OAA produs autoinhibitory site-ul care ar putea să sechestreze pantotenic brațul de acetil-CoA (sau cisteamină de CoA) a sta la CSH domeniu, astfel că se exclud reciproc obligatoriu de CoA într-un productive conformație este inhibată la mare celulare OAA concentrații (Extended Date Fig. 6a)., Interesant este că, în timp ce orientarea CoA extinsă productivă cu cisteamina îndreptată spre domeniul cenușii nu poate fi modelată în ACLY-apo fără o ciocnire sterică semnificativă (Fig. 2B), orientarea întoarsă cu cisteamina îndreptată spre domeniul CSH poate (date extinse Fig. 6b). Acest lucru este în concordanță cu constatările noastre care CoA este capabil de a se lega la ACLY în absența citrat și/sau ATP (datele nu sunt prezentate), dar ne propunem un îndoit conformație, cum s-a observat într-una din ACLY–citrat-CoA-C1 protomers (Fig. 1C (dreapta) și Fig., 1d (dreapta)) și, de asemenea, structura izolată a domeniului CSH22.

în Concordanță cu ipoteza că OAA2 poate servi ca un ACLY autoinhibitory site-ului, un studiu anterior a arătat că OAA este capabil de a inhiba ficat de șobolan ACLY într-un mod care este non-competitiv cu citrate26. Pentru a valida semnificația funcțională a celor două OAA-urile observate în ACLY–OAA–acetil-CoA structura, am angajat-o la starea de echilibru fluorescență de stingere experiment., Ca un experiment de control, trebuie mai întâi titrate citrat în ACLY în absența sau prezența unui saturarea concentrația de CoA și au fost în măsură pentru a se potrivi de date la unul citrat de site-ul de legare cu Kd valori de 3,4 ± 0,5 µM și 1,4 ± 0,3 µM, în absența sau prezența de CoA, cu bun R2 valorile de 0,92 și 0.84, respectiv (Fig. 4D). Acest lucru este în concordanță cu cel citrat de site-ul de legare a observat în ACLY ASH domeniu structură de cristal obligat să citrate13 și structura cristalină a intact ACLY obligat să-CoA și citrate22, arătând că CoA stabilizează citrat obligatoriu în ACLY ASH domain22., Am urmatoarea titrate OAA în ACLY și a constatat că datele se potrivesc în mod semnificativ mai bine să o două-ul model (R2 = 0.99) decat un site de model (R2 = 0.93) (Fig. 4e). Cele două site-ul de legare model mai bine adaptat bifazic fluorescență scădere care devine evident, la mai mare OAA concentrații și dă naștere la o mare afinitate OAA site-ul de legare (Kd = 15 ± 4 µM), care reprezintă o treime din totalul de fluorescență schimbare și o afinitate scăzută OAA site-ul de legare (Kd = 1.300 de ± 500 µM), care reprezintă restul de două treimi din numărul total de fluorescență modifica (Fig. 4e)., Aceste date sunt în concordanță cu relevanței funcționale dintre cele două OAA site-uri de legare a observat în ACLY–OAA–acetil-CoA structura.

ACLY-E599 este în poziția de a funcționa ca un catalizator important reziduu

ACLY–co-produs de structură ne-a permis să abordeze o lungă durată de întrebare cu privire la ACLY mecanism molecular. ACLY este propus pentru a despica citryl-CoA intermediar cu ajutorul unui general de bază pentru a extrage un proton din citrat de substrat și/sau generale, acid reprotonate la OAA lăsând group16,27,28., Acest lucru este în concordanță cu o analiză a profilului ratei pH-ului ACLY cu un pKa de ~8.5 (Fig. 5a). Presupunem că e599 conservat evolutiv este poziționat pentru a juca un rol catalitic important, ca bază generală și/sau acid și / sau pentru stabilizarea intermediarului fosfo-citril-CoA (vezi secțiunea următoare și Fig. 4b). Un pKa relativ ridicat pentru un reziduu de glutamat îngropat a fost observat anterior29. În concordanță cu un rol catalitic important pentru E599, am constatat că mutanții E599A și e599q au compromis semnificativ activitatea (Fig. 1f), chiar dacă legarea cofactorului nu a fost afectată (Fig. 5b)., În schimb, am constatat că un mutant e599d similar acid a prezentat o activitate similară cu WT ACLY (Fig. 1F), cu un profil similar al ratei pH-ului (Fig. 5a). Luate împreună, datele susțin importanța e599 pentru cataliza de ACLY.

ACLY cataliză veniturile printr-o fosfo-citryl-CoA intermediar în CENUȘĂ domeniu

identificarea E599 ca un catalizator important de reziduuri pentru scindarea citryl-CoA aduct la acetil-CoA și OAA produse ne-a oferit o oportunitate de a prinde un intermediar de reacție de un ACLY-E599Q mutant în prezența ATP, citrat și CoA co-substraturi., Prin urmare, am amestecat ACLY-E599Q mutant cu saturarea concentrații de ATP, citrat și CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrat-CoA) și a determinat sa crio-EM structură, pe care am fost capabil de a rezolva la un ansamblu de rezoluție de 2,85 Å. Structura a fost determinată prin impunerea D2 simetrie și a dezvăluit că CENUȘA și CSH domenii de ACLY au fost aranjate în mod similar la ACLY–citrat-CoA produs și ACLY–OAA–acetil-CoA structuri cu r.m.s.d. valorile pentru Ca atomii de 0.584 până și 0.620 Å, respectiv., Cu toate acestea, în contrast cu aceste alte substrat și produse complexe, ACLY-E599Q–ATP-citrat-CoA complexe a arătat extrem de bine definite crio-EM densitate în CENUȘĂ domeniu-ul activ, care ar putea fi modelat ca ADP (hidrolizat de ATP) și un fosfo-citryl-CoA intermediare (Fig. 6a, b). De asemenea, în contrast cu fiecare dintre celelalte ACLY structuri raportate în acest studiu, aminoacizi 752-767 buclă adapostirea H760 reziduuri, care a fost demonstrat de a media fosfat de transfer de la ATP citrat, este bine ordonat în ACLY-E599Q–ATP-citrat-CoA structură (Fig. 6c)., În plus, se observă că un ion de magneziu sau o moleculă de apă, propusă și pentru stabilizarea H760, este legată de e599 și de gruparea fosfat (Fig. 6c). Această observație sugerează că His760 reziduuri, grup fosfat și magneziu ion pot coopera pentru a stabiliza citrat de ligatura a CoA în CENUȘĂ domeniu-ul activ. În plus, faptul că acetil-CoA și OAA produse nu sunt respectate în această structură susține, în continuare, concluziile noastre care E599 joacă un important rol de catalizator în scindarea fosfo-citryl-CoA intermediar la acetil-CoA și OAA produse în CENUȘĂ domeniu.,