materiale și metode
șoareci.
șoarecii de tip sălbatic C57BL / 6 au fost obținuți de la laboratoarele Charles River (Wilmington, MA). Șoarecii PDE8A KO au fost inițial produși de Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) sub contract cu Pfizer, Inc. (Pfizer global de cercetare și dezvoltare, Sandwich, MAREA BRITANIE). Ulterior au fost crescuți la șoareci C57BL / 6 la Universitatea din Washington timp de 10 generații. Pentru experimentele raportate, s-au folosit șoareci cu vârste cuprinse între 6 și 8 săptămâni., Toate procedurile utilizate au fost aprobate de Comitetul instituțional pentru îngrijirea și utilizarea animalelor (IACUC) al Universității din Washington, în conformitate cu Ghidul Național al institutelor de sănătate pentru îngrijirea și utilizarea animalelor de laborator.
PCR în timp Real.
testicul ADNc a fost preparat din ARN total din testicul de șoarece de tip sălbatic și PDE8A-nul prin utilizarea SuperScript III și Oligo dT (Invitrogen corp., Carlsbad, CA). PCR în timp real a fost realizat prin utilizarea Power SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Grunduri (IDT, Coralville, IA) pentru PDE8A, direcționat către zona aval de direcționare casete, au fost după cum urmează: înainte de grund, GCCACAGAAATGACGAAGC (exonul 19); primer invers, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Primerii pentru hipoxantin-guanin fosforiboziltransferază au fost după cum urmează: primer înainte ATTATGCCGAGGATTTGGAA; primer invers, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
hibridizare in Situ.
șablonul pentru sinteza riboprobului a fost obținut prin PCR utilizând o plasmidă care conține secvența PDE8A de șoarece., În special, a 3′ a regiunii de mouse-ul PDE8A (exoni 17-20) a fost amplificat prin utilizarea următoarelor primeri: forward primer, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (subliniat T3 fagi ARN polimeraza promotor secvență); primer invers, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (subliniat fagul T7 ARN polimeraza promotor secvență). Produsele PCR au fost izolate din geluri de agaroză și purificate cu un Kit de extracție cu Gel (Qiagen, Valencia, CA)., 35S-etichetate riboprobes au fost sintetizate prin in vitro transcriere cu un MAXIscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX) folosind ca șablon PCR produs care conține T3 și fagul T7 ARN polimeraza promotor site-uri. Transcripția in vitro a fost efectuată într-un amestec de reacție de 20 µl conținând 5 µl de UTP (PerkinElmer, Boston, MA) și polimeraza ARN T3 sau polimeraza ARN T7 pentru a obține riboprobul sens sau antisens, respectiv.
Testiculele au fost disecat de tip sălbatic și PDE8A KO șoareci și au fost înghețate rapid în Tissue-Tek O. C. T. compus (Sakura, Torrence, CA) pe gheață uscată., Secțiunile (20 µm) au fost tăiate într-un criostat, montate pe un superfrost plus microslid (VWR Scientific, West Chester, PA) și uscate la aer. Secțiunile au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 15 minute la temperatura camerei, tratate cu anhidridă acetică 0,25% în trietanolamină 0,1 M (pH 8,0) timp de 10 minute și deshidratate printr-o serie gradată de etanol (30, 60, 80, 95 și 100%). Secțiunile au fost apoi incubate cu tampon de hibridizare într-o cameră umedă la 60°C timp de 4 ore. după clătire în 2× SSC (citrat salin standard; 1× SSC = 0,15 m clorură de sodiu/0,015 m citrat de sodiu, pH 7.,2), secțiunile au fost deshidratate printr-o serie gradată de etanol. Hibridizarea a fost efectuată în tampon conținând antisens sau sondă de sens marcată 35S (40 pg/34,000–38,000 cpm per µl) sub capace de plastic într-o cameră umedă la 60°C peste noapte. Lamele au fost îndepărtat ușor, iar secțiunile au fost spălate cu 2× SSC conținând 10 mM DTT pentru 30 de min de doua ori la 60°C. secțiunile au fost apoi incubate timp de 30 min la 37°C cu 20 µg/ml RNaseA în 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5), și 1 mM EDTA, apoi se spală în 50% formamida, 2× SSC conținând 10 mM DTT pentru 30 min la 60°C, în 1× SSC conținând 10 mM DTT pentru 30 min la 60°C, și mai mult în 0.1× SSC conținând 10 mM DTT pentru 30 min la 60°C. în Final, secțiunile au fost deshidratat în etanol (70, 95 și 100%), aerul uscat, și expuse pe BioMax XAR film (Eastman Kodak, Rochester, NY) pentru 9 sec. Pentru a vedea celula de distribuție de PDE8A arnm hibridizare, slide-uri au fost filmate cu Autoradiografie TNB emulsie (Eastman Kodak) și expuși timp de 1 săptămână la 4°C., Toboganele au fost dezvoltate, fixate și contracostate cu hematoxilină și montate în Canada Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A Imunoprecipitare și test.
Mouse-ul spermei au fost izolate din cauda epididymis de o baie metoda (38) și omogenizat în PBS conținând 1% Nonidet (Roche applied Science, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0.2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidine, și Sigma inhibitor de protează amestec (Sigma-Aldrich)., Omogenatul a fost centrifugat timp de 5 min la 16,000 × g într-o microcentrifugă și 200-µl alicote ale supernatantului, echivalent cu 106 spermatozoizi, au fost incubate peste noapte cu 20 µl dintr-o suspensie 1:1 de granule de proteină g-agaroză (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) în prezența sau absența anticorpului PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). A doua zi, immunoprecipitate a fost spălat de trei ori cu PBS și apoi testate pentru PDE activitatea în prezența a 10 nM tabără de substrat, 40 mM Perii (pH 7,5), 15 mM Mg acetat, 2 mM EGTA, și 0,2 mg/ml BSA ca în ref. 39.,
Imunohistotochimie.
Proaspăt congelate mouse-ul testiculele au fost încorporate în Tissue-Tek O. C. T. compus și apoi secționat pe un criostat la 20 µm pe fiecare felie. Secțiunile de țesut sau celulele Leydig izolate au fost uscate și fixate în 4% (wt/vol) paraformaldehidă/PBS (pH 7,4) la temperatura camerei timp de 10 min și spălate de trei ori cu PBS. Lamelele au fost preincubate cu tampon blocant (5% ser măgar, 1 mg/ml BSA și 0.,1% Triton X-100 în PBS) pentru 1 h la temperatura camerei, incubate cu un anti-PDE8A anticorp (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) în PBS conținând 1% măgar ser, 1 mg/ml BSA, și 0,1% Triton X-100 peste noapte la 4°C, spălate cu PBS conținând de 0,05% Tween 20 de trei ori, timp de 20 min, incubate cu măgarul anti-capra Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) în PBS conținând 1 mg/ml BSA și 0,1% Triton X-100, timp de 2 h la temperatura camerei și se spală., Slide-urile au fost incubate cu tampon de blocare cu conținut de 5% capra ser pentru 1 h la temperatura camerei, incubate cu citocromul P450 lanț lateral clivaj enzimatic (CYP11A) anticorp (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) peste noapte la 4°c, spălat în PBS conținând 0,05% Tween 20 de trei ori timp de 20 min, și incubat cu capra anti-iepure Alexa488 (1:500; Invitrogen) ca mai sus. Secțiunile au fost în cele din urmă counterstained cu A-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) în PBS pentru 5 min, se spală, și montate în SlowFade Aur antifade reactiv (Invitrogen)., Pentru a testa PDE8A anticorp specific, anticorpi soluție a fost preincubated cu 2,5 µg/ml antigenul peptidic (Santa Cruz Biotechnology) timp de 2 h la temperatura camerei înainte de colorare. Unele secțiuni au fost incubate fără anticorpii primari pentru a determina fundalul datorită anticorpilor secundari. Semnalele imunostimulatoare au fost vizualizate cu un microscop confocal (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). activitatea β-galactozidazei, exprimată cu un semnal de localizare nucleară de către gena LacZ în caseta de direcționare, a fost evaluată prin colorarea X-gal., Secțiunile au fost incubate mai întâi cu anticorp anti-CYP11A urmat de conjugat fosfatază alcalină anti-iepure (1:500; Invitrogen) și NBT/BCIP (Roche) pentru dezvoltarea culorii. Colorarea cu X-gal a fost apoi efectuată conform descrierii (40) în amestecul X-gal la 37°C peste noapte. Secțiunile au fost spălate și montate cu soluție salină tamponată cu glicerol/Tris.
purificarea celulelor Leydig.
celulele Leydig au fost izolate așa cum este descris în ref. 41. Pe scurt, testiculele de la șoarecii adulți au fost decapulate și dispersate într-o baie de apă agitată la 34°C timp de 10 min în 10 ml de mediu 199 (M-199) cu 0.,25 mg/ml colagenazei D, 35 mU/ml Dispase II, și 6 µg/ml DNase I. Pentru a termina de țesut dispersie, 40 ml de 1% BSA în M-199 mass-media care conțin 15 mM Hepes, 4 mM bicarbonat de sodiu, și 25 µg/ml soia inhibitor de tripsină a fost adăugat pentru a dilua suspensie originale. Tuburile au fost apoi acoperite și inversate de mai multe ori. Tubulii seminiferi au fost lăsați să se așeze prin gravitație, iar supernatantul care conține celulele interstițiale a fost colectat. Procedura a fost repetată de două ori pentru a recolta în continuare celule interstițiale., Celulele au fost granulate în 50 ml tuburi de centrifugare la 800 × g timp de 20 min la temperatura de 4°C și apoi fractionata cu ajutorul unui continuă Percoll (GE Healthcare, Piscataway, new JERSEY) gradient (55% Percoll în HBSS tamponat cu 15 mM Hepes și 25 µg/ml soia inhibitor de tripsină) într-un volum total de 35 ml. Gradienții au fost formați in situ prin centrifugare într-un rotor cu unghi fix JA-20 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) la 23,700 × g timp de 30 min la 4°C. Un tub care conține margele de marcaj de densitate (GE Healthcare) a fost utilizat ca referință pentru identificarea diferitelor straturi de densitate., Celulele Leydig au fost recuperate începând de la o densitate de 1, 07 g/ml până la fundul gradientului. Cinci volume de HBSS au fost adăugate pentru a dilua Percoll, iar celulele au fost granulate la 200 × g timp de 10 min la temperatura de 4°C. La final extractul obținut din două testicule, îmbogățit în celulele Leydig, a fost resuspendat în 4 ml de DMEM/F-12 suplimentat cu 1% BSA și utilizate imediat pentru experimente.
testul 3β-Hidoxisteroid dehidrogenazei.
măsurarea producției de testosteron.
celulele Leydig au fost resuspendate ca mai sus și alicote de 100 µl au fost distribuite în plăci cu 96 de puțuri., Celulele au fost stimulate în volum final de 150 µl cu concentrațiile indicate de LH recombinant timp de 3 ore într-un incubator de 5% CO2 la 37°C. LH uman Recombinant a fost obținut din hormonul Național & programul peptidic (A. F. Parlow, Torrance, CA). Testosteronul eliberat în mediile probelor de celule duplicate pentru fiecare concentrație de LH a fost măsurat utilizând un kit de testare imunoenzimatică de la Neogen (Lexington, KY).toate datele sunt exprimate ca medie ± DS., Valorile EC50 pentru acțiunea LH asupra producției de testosteron au fost calculate prin potrivirea neliniară a curbelor de dependență de concentrație de LH obținute pentru fiecare preparare a celulelor Leydig prin utilizarea unui pachet software (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Analiza statistică a fost efectuată prin testul T al elevului. Diferențele au fost considerate semnificative la P < 0, 05.