Madame Lelica

struktura ACLY z CoA ujawnia produktywne i nieproduktywne konformacje CoA

we wszystkich naszych analizach biochemicznych i strukturalnych wyprodukowaliśmy rekombinowany, pełnowartościowy ACLY w Escherichia coli (dane Rozszerzone rys. 1a, b)., Różnicowa skaningowa fluorymetria enzymu z różnymi kofaktorami potwierdziła wiązanie i potencjalne zmiany strukturalne związane z ligandami dodawanymi pojedynczo lub w połączeniu (dane Rozszerzone rys. 1c). Wykorzystaliśmy te dane do określenia struktury ACLY z jego Ko-substratami lub produktami równoległymi.

przygotowaliśmy rekombinowane białko i początkowo wykonaliśmy negatywną analizę białka w postaci pojedynczych cząstek przy braku metabolitów (ACLY-apo)., Dwuwymiarowa (2D) klasa średnia z 3000 cząstek potwierdziła, że białko tworzy tetramer (dane Rozszerzone rys. 2a, b). Aby uzyskać więcej szczegółów strukturalnych, przeprowadziliśmy badanie cryo-EM na kompleksie ACLY-citrate-Coa. Po wielu rundach optymalizacji próbek cryo-EM, określiliśmy symetryczną strukturę cryo-EM D2 struktury ACLY-citrate-CoA do średniej ogólnej rozdzielczości 3,0 Å. (Rozszerzone Dane Rys. 2c, d, 3 i 4 oraz Tabela 1).,

struktura acly–citrate-Coa tworzy homotetramer z centralnym tetramerycznym modułem CSH i dwoma domenami ASH na przeciwległych końcach modułu CSH (protomery 1 & 2 i 3 & 4) (rys. 1a, b). Domena ASH (pozostałości 1-806) przyjmuje strukturę bardzo podobną do wcześniej opisanej architektury α / β izolowanej domeny N-końcowej związanej z cytrynianem i ADP24., Domena CSH (pozostałości 859-1101) składa się wyłącznie z Helis i krótkich pętli, z homologią strukturalną do dimeru dimerów syntazy cytrynianowej, które krzyżują się pod kątem ~90° (dane Rozszerzone rys. 5a). Domeny popiołu i CSH każdego łańcucha polipeptydowego są połączone w dużej mierze rozszerzonym ~ 50-pozostałym obszarem cewki, z wyjątkiem krótkiej helisy α między pozostałościami 824 i 829. Obszar spiralny w obrębie tego łącznika jest jedynym punktem znaczącego kontaktu (przez interakcję van der Waalsa) między dwoma domenami popiołu po jednej stronie cząsteczki., Rozszerzony łącznik pozwala CSH jednej podjednostki na interakcję z domeną ASH innej podjednostki po przeciwnej stronie modułu CSH. W przeciwieństwie do stosunkowo rzadkich interakcji między protomerami popiołu, domeny CSH tworzą rozległą sieć głównie interakcji van der Waalsa, które sugerowałyby, że domeny CSH funkcjonują jako sztywny moduł tetrameryczny, podczas gdy cztery domeny ASH są bardziej elastyczne. Jest to zgodne z obserwowaną estymacją rozdzielczości lokalnej EM na mapie EM, która jest najwyższa w domenie CSH (2,8 Å, dane Rozszerzone rys., 4c) oraz nasze wcześniejsze obserwacje, że domena CSH ma wyższą temperaturę topnienia w stosunku do popiołu wynoszącą odpowiednio ~75 °C w porównaniu z ~55 °C21.

CoA wiąże się na styku między domenami csh i ASH oddzielnych podjednostek i wydaje się „zszywać” superdomeny razem. Baza adeninowa i pierścień rybozy oddziałują z domeną CSH jednego monomeru oraz ramieniem pantotenowym i grupą β-merkapto wystającymi w miejsce aktywne domeny ASH innej podjednostki (ryc. 1c (po lewej) i Rys. 1d (po lewej))., Modelowanie CoA opiera się na obserwacji, że fosforylowana Grupa ADP jest dobrze rozwiązana w gęstości cryo-em. Grupa mercapto nie została jednak dobrze rozwiązana, co sugeruje elastyczność tego regionu. Chociaż kilka pozostałości z domen csh i ASH powoduje interakcje van der Waalsa z CoA, wiązania wodorowe z S574, R576 i S577 z domeny ASH i K964 z domeny CSH do tlenków fosforanu rybozy wydają się odgrywać szczególnie ważną rolę w zszywaniu CoA na interfejsie ASH–CSH., Co ciekawe, E599 znajduje się w odległości wiązania wodoru do modelowanego atomu siarki CoA, co sugeruje, że może odgrywać ważną rolę katalityczną. Znaczenie interakcji białko-CoA z domeny ASH i CSH jest wspierane przez wrażliwość mutacyjną reszt R576 i K964, a potencjalna rola katalityczna E599 jest wspierana przez jego wrażliwość mutacyjną Na A lub Q, ale nie na D (rys. 1f). Chociaż cytrynian został włączony do próbki do rekonstrukcji cryo-EM, nie można go było pewnie rozwiązać na mapie cryo-em.,

biorąc pod uwagę nierozwiązaną gęstość dla grupy mercapto CoA, przeprowadziliśmy kolejną rekonstrukcję struktury ACLY–citrate-CoA bez narzucania symetrii D2, aby określić, czy CoA może przyjmować różne konformacje w różnych protomerach. Udało nam się przygotować rekonstrukcję bez narzucania symetrii (C1, zamknięte asymetrycznie) do nominalnej rozdzielczości 3,5 Å. W tej asymetrycznej zamkniętej strukturze ACLY-cytrynian-CoA-C1 rozdzielczość wokół domeny ASH jest uboższa niż w strukturze D2, ale lokalna rozdzielczość wokół domeny CSH pozostaje stosunkowo wysoka, od 2,8 do 3,2 Å., Analiza tej asymetrycznej zamkniętej struktury ACLY-cytrynian-CoA-C1 wykazała, że każda z domen ASH oraz trzy z czterech domen CSH i cząsteczek Coa przyjęły taką samą konfigurację jak struktura D2. Jednak jedna z cząsteczek Coa przyjmuje alternatywną konformację, w której fosforylowana cząsteczka ADP jest przesunięta ~8 Å w kierunku modułu CSH, a ramię pantoteniczne jest pochylone do interakcji z CSH (rys. 1b, c (po prawej) i Rys. 1e). Gęstość cryo-EM odpowiadająca tej alternatywnej konformacji CoA jest bardzo wyraźna (rys. 1c (prawy))., Co ciekawe, gęstość cryo-EM jest również obserwowana dla dobrze uporządkowanej cząsteczki wody, która wydaje się mostkować interakcje wiązania wodorowego między końcowym atomem siarki CoA z resztami łańcucha bocznego H900, D1026 i R1065 z dodatkowymi oddziaływaniami van der Waalsa z L969, I973, H975 i R976 (rys. 1d (prawy)). Jednocześnie z tą alternatywną konformacją CoA, pętla w domenie CSH (pozostałości 965-986) i flankujące helisy przesuwają się, aby pomieścić alternatywną pozycję podstawy adeniny CoA (rys. 1e)., Mutacje H975, R976, D1026 i R1065 do alaniny wykazują upośledzoną aktywność, co sugeruje, że Wiązanie Coa z domeną CSH jest w jakiś sposób zaangażowane w aktywność enzymu (rys. 1f). Biorąc pod uwagę, że CoA musi reagować z cytrynianem w domenie popiołu, odnosimy się do konformacji Coa z cysteaminą ramienia pantotenowego, która wskazuje na popiół i CSH jako odpowiednio „produktywne” i „nieproduktywne” konformacje CoA związane z ACLY.,

struktura subpopulacji ACLY–cytrynian-CoA ujawnia asymetryczne orientacje popiołu

oprócz głównej populacji cząstek ACLY–cytrynian-Coa, stanowiącej 57% cząstek klasy 3, subpopulacja złożonych cząstek ACLY–cytrynian-CoA stanowiąca 23% podklasy cząstek (łącznie 10%) została również uchwycona w rekonstrukcji 3D bez narzucania symetrii do rozdzielczości 4.3 Å (rozszerzone dane rys. 3)., Ta subpopulacja cząstek ma ogólną strukturę podobną do głównej populacji ACLY-citrate-CoA, z wyjątkiem tego, że jedna z czterech domen popiołu jest obracana ~50° w kierunku najbliższej podjednostki popiołu, aby przyjąć bardziej „otwartą” konformację, więc nazywamy ją „acly–citrate-CoA-C1 asymm open”. W tej strukturze gęstość jest widoczna tylko dla fosforylowanej cząsteczki ADP dwóch cząsteczek CoA związanych z dwoma symetrycznymi domenami popiołu (rys. 2a, b). Jedna z symetrycznych i asymetrycznych podjednostek popiołu nie wykazuje żadnych dowodów na Wiązanie CoA., W szczególności asymetryczna domena popiołu wydaje się niezgodna z wydajnym wiązaniem Coa (rys. 2c). Proponujemy, aby ta otwarta struktura asymmatyczna ACLY–cytrynian-CoA-C1 reprezentowała stan pośredni ACLY, w którym dwa aktywne miejsca są wstępnie przygotowane do katalizy, a dwa nie. Obserwacja tej struktury sugeruje również, że cztery aktywne miejsca ACLY mogą funkcjonować niezależnie.

acly–acetylo-CoA–OAA complex ujawnia reakcję liazy cytrynianowej Coa zachodzi w domenie popiołu

różnicowe skanowanie danych fluorymetrycznych wykazało, że zarówno Produkty acetylo–CoA, jak i OAA stabilizują białko ACLY (dane Rozszerzone rys. 1c)., To odkrycie wskazało, że możemy uchwycić kompleks produktu ACLY-OAA-acetylo-CoA, a więc lepiej zrozumieć mechanizm reakcji. W tym celu określiliśmy strukturę cryo-EM kompleksu, którą rozwiązaliśmy do rozdzielczości 3,1-Å za pomocą symetrii D2 (dane Rozszerzone rys. 4). Ogólna struktura kompleksu acly-co-product była najbardziej podobna do symetrycznego kompleksu ACLY–co-substrat (acly–cytrynian-Coa-D2), z ogólnym odchyleniem od średniej kwadratowej korzenia (rmsd) wynoszącym 0,407 Å dla atomów Ca (rys. 4a)., Okazało się, że acetylo-CoA zajmował to samo miejsce wiązania CoA i był również stabilizowany przez te same podstawowe pozostałości, R576 i K964 (rys. 4b). Ponadto udało nam się jednoznacznie modelować dwie cząsteczki OAA związane z każdą podjednostką ACLY (rys. 4b, c). Jedna cząsteczka OAA (OAA1) pokrywa się z kieszenią wiążącą cytrynian w domenie popiołu i jest bliższa grupie acetylowej acetylo-CoA. OAA1 wykazuje stosunkowo niewielkie interakcje z białkiem, w tym wiązania wodorowe z N346 i T348 oraz interakcje van der Waalsa z F547., Druga cząsteczka OAA (OAA2) jest związana z domeną CSH i wykonuje bardziej rozległe interakcje z ACLY niż OAA1. OAA2 styka się z modułem CSH poprzez wiązania wodorowe do H900, D1026, R1065 i R1085 oraz poprzez interakcje van der Waalsa z F935 i F1061 z jednej podjednostki, a także poprzez wiązanie wodorowe do R1065 z innej podjednostki (rys. 4c). OAA2 dobrze pokrywa się ze związanym OAA w syntezie cytrynianu serca wieprzowiny25 (dane Rozszerzone rys. 5b).

udoskonaliliśmy również mapę cryo-EM struktury ACLY–OAA–acetylo-CoA bez ograniczeń symetrii i uzyskaliśmy identyczną strukturę z symetrią D2, z tym wyjątkiem, że jedna z czterech cząsteczek acetylo-CoA wykazała dwie możliwe konformacje pantotenowego ramienia acetylo-CoA, jedna z cysteamina CoA w kierunku domeny Ash, podobnie jak w pozostałych trzech protomerach, a drugi w kierunku domeny csh (dane rozszerzone rys. 6a)., Jednak w przeciwieństwie do alternatywnej konformacji Coa znalezionej w strukturze acly–cytrynian-Coa, pozycja fosforylowanej grupy ADP nie zmieniła się w tych dwóch konformacjach. Potencjalna alternatywna konformacja acetylo-CoA może sugerować możliwy szlak uwalniania substratu w obrocie enzymu lub stan autoinhibicyjny enzymu (omówiony poniżej).

obserwacja produktów oaa1 i acetylo-CoA w domenie ASH zdecydowanie sugerowała, że chemia liazy jest tam przeprowadzana,w przeciwieństwie do wcześniejszych propozycji, że chemia ta jest przeprowadzana w domenie CSH22, 23., Spekulujemy, że OAA2 może działać w celu organizacji domeny CSH do współpracy z domeną ASH i / lub działać jako drugi produkt OAA miejsce autoinhibicyjne, które może sekwestrować ramię pantoteniczne acetylo-CoA (lub cysteaminy Coa), aby zasiedlić domenę CSH, tak że wzajemnie wykluczające się Wiązanie CoA w produktywnej konformacji jest hamowane przy wysokich stężeniach komórkowych OAA (rozszerzone dane rys. 6a)., Co ciekawe, podczas gdy produktywna Rozszerzona orientacja Coa z cysteaminą skierowaną w domenę popiołu nie może być modelowana w ACLY-apo bez znaczącego zderzenia sterycznego (rys. 2b), odwrócona orientacja z cysteaminą skierowaną w stronę puszki domeny CSH (rozszerzone dane rys. 6b). Jest to zgodne z naszymi ustaleniami, że CoA jest w stanie wiązać się z ACLY przy braku cytrynianu i / lub ATP( dane nie pokazano), ale proponujemy wygiętą konformację, jak zaobserwowano w jednym z protomerów ACLY-citrate-CoA-C1 (rys. 1c (po prawej) i Rys., 1d (po prawej)), a także izolowaną strukturę domeny CSH22.

zgodnie z hipotezą, że OAA2 może służyć jako miejsce autoinhibicyjne ACLY, poprzednie badanie wykazało, że OAA jest w stanie hamować ACLY wątroby szczurów w sposób niezgodny z cytratem26. Aby potwierdzić funkcjonalne znaczenie dwóch miejsc OAA obserwowanych w strukturze ACLY-OAA-acetylo-CoA, zastosowaliśmy eksperyment hartowania fluorescencyjnego w stanie stacjonarnym., Jako eksperyment kontrolny najpierw miareczkowaliśmy cytrynian do ACLY w przypadku braku lub obecności nasycającego stężenia CoA i byliśmy w stanie dopasować dane do jednego miejsca wiązania cytrynianu o wartościach Kd 3,4 ± 0,5 µM i 1,4 ± 0,3 µM w przypadku braku lub obecności CoA, z dobrymi wartościami R2 odpowiednio 0,92 i 0,84 (rys. 4d). Jest to zgodne z jednym miejscem wiązania cytrynianu obserwowanym w strukturze krystalicznej domeny popiołu ACLY związanej z cytrynianem 13 oraz ze strukturą krystaliczną nienaruszonego ACLY związanego z CoA i cytrynianem 22, co pokazuje, że CoA stabilizuje Wiązanie cytrynianu w domenie popiołu ACLY 22., Następnie miareczkowaliśmy OAA do ACLY i stwierdziliśmy, że dane znacznie lepiej pasują do modelu dwusekcyjnego (R2 = 0,99) niż do modelu jednostkowego (R2 = 0,93) (rys. 4e). Model wiązania w dwóch miejscach lepiej uwzględniał dwufazowy spadek fluorescencji, który staje się widoczny przy wyższych stężeniach OAA i powoduje powstanie miejsca wiązania OAA o wysokim powinowactwie (Kd = 15 ± 4 µM), które odpowiada za jedną trzecią całkowitej zmiany fluorescencji i miejsca wiązania OAA o niskim powinowactwie (Kd = 1300 ± 500 µM), które odpowiada za pozostałe dwie trzecie całkowitej zmiany fluorescencji (rys. 4e)., Dane te są zgodne z funkcjonalnym znaczeniem dwóch miejsc wiązania OAA obserwowanych w strukturze ACLY-OAA-acetylo-CoA.

ACLY-E599 jest w stanie funkcjonować jako ważna pozostałość katalityczna

struktura współproduktu acly pozwoliła nam odpowiedzieć na długotrwałe pytanie dotyczące mechanizmu molekularnego ACLY. ACLY proponuje się rozszczepienie pośredniego cytrylu-CoA za pomocą ogólnej zasady do ekstrakcji protonu z substratu cytrynianu i / lub ogólnego kwasu do reprotonacji OAA opuszczającej grupę 16, 27,28., Jest to zgodne z analizą profilu pH ACLY z pKa wynoszącą ~8,5 (rys. 5a). Stawiamy hipotezę, że ewolucyjnie zachowany E599 jest ustawiony, aby odgrywać ważną rolę katalityczną, jako ogólna zasada i / lub kwas, i / lub do stabilizacji pośredniego fosfo-cytrylu-Coa (patrz następna sekcja i Rys. 4b). Wcześniej odnotowano stosunkowo wysoki poziom pKa dla zakopanej pozostałości glutaminianu 29. Zgodnie z ważną rolę katalityczną dla E599, okazało się, że mutanty E599A i E599Q mają znacznie obniżoną aktywność (rys. 1f), nawet jeśli Wiązanie kofaktora nie uległo zmianie (rys. 5b)., W przeciwieństwie do tego, odkryliśmy, że podobnie kwaśny mutant E599D wykazuje podobną aktywność jak WT ACLY (rys. 1f), o podobnym profilu pH (rys. 5a). Łącznie dane argumentują znaczenie E599 dla katalizy przez ACLY.