materiały i metody
myszy.
myszy typu dzikiego C57BL/6 otrzymano z Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Myszy PDE8A KO były początkowo produkowane przez Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) na mocy umowy z Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Wielka Brytania). Następnie zostały wyhodowane do myszy C57BL / 6 na Uniwersytecie w Waszyngtonie przez 10 pokoleń. Do opisanych eksperymentów wykorzystano dopasowane do wieku myszy w wieku od 6 do 8 tygodni., Wszystkie stosowane procedury zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (Iacuc) Uniwersytetu w Waszyngtonie, zgodnie z National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
Real-Time PCR.
cDNA Jądra otrzymano z całkowitego RNA z jąder myszy typu dzikiego i pde8a-null przy użyciu SuperScript III i Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). PCR w czasie rzeczywistym został wykonany przy użyciu Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Podkłady (IDT, Coralville, IA) dla PDE8A, skierowane na obszar za kasetą celowniczą, były następujące: primer forward, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); primer reverse, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Podkłady dla fosforybozylotransferazy hipoksantynowo-guaninowej były następujące: primer forward ATTATGCCGAGGATTTGGAA; reverse primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
hybrydyzacja In Situ.
szablon do syntezy ryboprobów otrzymano metodą PCR za pomocą plazmidu zawierającego sekwencję pde8a myszy., W szczególności Region 3′ myszy PDE8A (eksony 17-20) wzmacniano za pomocą następujących podkładów: primer forward primer, aattaaccctcactaaagggcgtatttcctttccag (podkreślona Sekwencja promotorowa polimerazy T3 Fage RNA); primer reverse, TAATACGACTCACTATAGGGACACGGCACACTTAAT (podkreślona Sekwencja promotorowa polimerazy T7 Fage RNA). Produkty PCR zostały wyizolowane z żeli agarozowych i oczyszczone za pomocą zestawu do ekstrakcji żelu (Qiagen, Valencia, CA)., Ryboproby znakowane 35S zostały zsyntetyzowane przez transkrypcję in vitro za pomocą zestawu MAXIscript T3 / T7 (Ambion, Austin, TX), używając jako szablonu produktu PCR zawierającego promotory polimerazy T3 i T7 fagowego RNA. Transkrypcję in vitro przeprowadzono w 20-µl mieszaninie reakcyjnej zawierającej 5 µl UTP (PerkinElmer, Boston, MA) i polimerazy RNA T3 lub polimerazy RNA T7 w celu uzyskania, odpowiednio, ryboprobu sense lub antysensownego.
jądra zostały wycięte z myszy typu dzikiego i PDE8A KO i zostały szybko zamrożone w związku Tissue-Tek O. C. T. (Sakura, Torrence, CA) na suchym lodzie., Sekcje (20 µm) wycięto w kriostacie, zamontowano na Mikroslidzie Superfrost plus (VWR Scientific, West Chester, PA) i wysuszono powietrzem. Sekcje mocowano w 4% paraformaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej, obrabiano 0,25% bezwodnikiem octowym w 0,1 M trietanoloaminie (pH 8,0) przez 10 minut i odwodniono przez szereg stopniowanych etanolu (30, 60, 80, 95 i 100%). Sekcje inkubowano buforem hybrydyzacyjnym w wilgotnej komorze w temperaturze 60°C przez 4 godziny. po płukaniu w 2× SSC (standardowy cytrynian soli fizjologicznej; 1 × SSC = 0,15 m chlorek sodu/0,015 m cytrynian sodu, pH 7.,2), sekcje odwodniono poprzez stopniowane serie etanolowe. Hybrydyzację przeprowadzono w buforze zawierającym znakowaną 35S sondę antysensową lub sense (40 pg / 34 000–38 000 cpm na µl) pod plastikowymi osłonami w wilgotnej komorze w temperaturze 60°c na noc. Następnie sekcje inkubowano przez 30 minut w temperaturze 37°C z 20 µg/ml RNaseA w 0,5 M NaCl, 10 mm Tris·HCl (pH 7.,5) I 1 mm EDTA, następnie przemyto w 50% formamidu, 2× SSC zawierające 10 mm DTT przez 30 min w temperaturze 60°C, w 1× SSC zawierające 10 mM DTT przez 30 min w temperaturze 60°C, i dalej w 0,1× SSC zawierające 10 mm DTT przez 30 min w temperaturze 60°C. wreszcie, sekcje były odwodnione w etanolu (70, 95 i 100%), suszone powietrzem i narażone na działanie folii BioMax XAR (Eastman Kodak, Rochester, NY) przez 9 h. aby zobaczyć rozkład komórek hybrydyzacji mRNA pde8a, szkiełka zostały pokryte emulsją AUTORADIOGRAFICZNĄ NTB (Eastman Kodak) i wystawione na 1 tydzień w temperaturze 4°C., Prowadnice zostały opracowane, naprawione i kontrastowane hematoksyliną i zamontowane w kanadyjskim balsamie (Sigma-Aldrich).
Pde8a Immunoprecypitacja i test.
plemniki myszy wyizolowano z najądrza ogona metodą swim-out (38) i homogenizowano w PBS zawierającym 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mm EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidyny i mieszaninę inhibitorów proteazy Sigma (Sigma-Aldrich)., Homogenit odwirowywano przez 5 minut w temperaturze 16 000 × g w mikrokentryfie, a 200-µl podliczników supernatantu, co odpowiada 106 plemnikom, inkubowano przez noc z 20 µl zawiesiny białkowej g-agarozy 1:1 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) w obecności lub braku przeciwciał PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Następnego dnia immunoprecypitat był trzykrotnie przemywany PBS, a następnie testowany pod kątem aktywności PDE w obecności substratu cAMP 10 nM, Mops 40 mM( pH 7,5), 15 mm mg-octanu, 2 mm EGTA i 0,2 mg/ml BSA, jak w ref. 39.,
Immunohistotochemia.
świeżo zamrożone jądra myszy osadzono w związku Tissue-Tek O. C. T., a następnie sekowano na kriostacie w ilości 20 µm na plasterek. Sekcje tkanek lub izolowane komórki Leydiga były suszone i utrwalane w 4% (wt/obj.) paraformaldehydu/PBS (pH 7,4) w temperaturze pokojowej przez 10 min i trzykrotnie przemywane PBS. Szkiełka były wstępnie inkubowane buforem blokującym (5% osła w surowicy, 1 mg/ml BSA i 0.,1% Triton X-100 w PBS) przez 1 h w temperaturze pokojowej, inkubowany z przeciwciałem anty-PDE8A (200 µl, 1:100, C-15; Biotechnologia Santa Cruz) w PBS zawierającym 1% osła surowicy, 1 mg/ml BSA i 0,1% Triton X-100 przez noc w temperaturze 4°C, przemywany w PBS zawierający 0,05% Tween 20 trzy razy przez 20 min, inkubowany z osła anty-kozą Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) w PBS zawierającym 1 mg/ml BSA i 0,1% Triton X-100 przez 2 h w temperaturze pokojowej i umytym., Szkiełka były następnie inkubowane z buforem blokującym zawierającym 5% surowicy koziej przez 1 h w temperaturze pokojowej, inkubowane z przeciwciałem enzymu dekoltu łańcucha bocznego cytochromu P450 (CYP11A) (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) przez noc w temperaturze 4°C, przemyte w PBS zawierającym 0,05% Tween 20 trzy razy przez 20 min i inkubowane z kozim anty-królikiem Alexa488 (1: 500; Invitrogen) jak wyżej. Sekcje zostały ostatecznie skontrowane z TO-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) w PBS przez 5 min, przemyte i zamontowane w odczynniku antyfadowym Slowfade Gold (Invitrogen)., Aby sprawdzić swoistość przeciwciała PDE8A, roztwór przeciwciała przed barwieniem był wstępnie inkubowany peptydem antygenu 2,5 µg/ml (Santa Cruz Biotechnology) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Niektóre sekcje inkubowano bez przeciwciał pierwotnych w celu określenia tła z powodu przeciwciał wtórnych. Sygnały immunostaining zostały wizualizowane za pomocą mikroskopu konfokalnego (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). aktywność β-galaktozydazy, wyrażona sygnałem lokalizacji jądrowej przez gen LacZ w kasecie celowniczej, była oceniana przez barwienie X-gal., Sekcje najpierw inkubowano przeciwciałem anty-CYP11A, a następnie koniugatem fosfatazy alkalicznej (1:500; Invitrogen) i NBT / BCIP (Roche)w celu uzyskania koloru. Następnie barwienie x-gal przeprowadzono zgodnie z opisem (40) w mieszaninie x-gal w temperaturze 37°C przez noc. Sekcje zostały umyte i zamontowane z glicerolu / tris buforowanej soli fizjologicznej.
oczyszczanie komórek Leydiga.
komórki Leydiga wyizolowano zgodnie z opisem w ref. 41. Krótko, jądra dorosłych myszy były dekapsulowane i rozproszone w łaźni wodnej w temperaturze 34°C przez 10 min w 10 ml Medium 199 (M-199) z 0.,25 mg/ml kolagenaza D, 35 MJ/ml Dispase II i 6 µg/ml DNase I. aby zakończyć dyspersję tkankową, dodano 40 ml 1% BSA w mediach m-199 zawierających 15 mm Hepes, 4 mM wodorowęglan sodu i 25 µg/ml inhibitor trypsyny sojowej w celu rozcieńczenia oryginalnej zawiesiny. Rurki były następnie kilkakrotnie zakręcane i odwrócone. Kanaliki nasienne mogły się osadzać grawitacyjnie, a supernatant zawierający komórki śródmiąższowe został zebrany. Zabieg powtórzono dwukrotnie w celu dalszego pobierania komórek śródmiąższowych., Komórki granulowano w probówkach o pojemności 50 ml przez odwirowanie w temperaturze 800 × g przez 20 min w temperaturze 4°C, a następnie frakcjonowano przy użyciu ciągłego gradientu Percoll (GE, Piscataway, NJ) (55% Percoll w HBSS buforowanego 15 mm Hepes i 25 µg/ml inhibitora trypsyny sojowej) w całkowitej objętości 35 ml. Gradienty uformowano in situ przez odwirowanie w wirniku ja-20 o stałym kącie (Redlica Beckmana, Fullerton, CA) przy 23 700 × g przez 30 min w temperaturze 4°C. do identyfikacji różnych warstw gęstości użyto rurki zawierającej znacznik gęstości (GE Healthcare)., Komórki Leydiga odzyskiwano od gęstości 1,07 g / ml do dna gradientu. W celu rozcieńczenia Percollu dodano pięć objętości HBSS, a komórki granulowano w temperaturze 200 × g przez 10 minut w temperaturze 4°C. końcowy granulat otrzymany z dwóch jąder, wzbogacony w komórki Leydiga, ponownie zawieszono w 4 ml DMEM / F-12 uzupełniony 1% BSA i natychmiast wykorzystano do eksperymentów.
Test dehydrogenazy 3β-Hydoksysteroidowej.
pomiar produkcji testosteronu.
komórki Leydiga ponownie zawieszono jak wyżej i 100-µl alikwotów wydano w 96-stu płytkach., Komórki stymulowano w 150-µl objętości końcowej ze wskazanym stężeniem rekombinowanego LH przez 3 godziny w inkubatorze 5% CO2 w temperaturze 37°C. rekombinowany ludzki LH otrzymywano z Krajowego hormonu & programu peptydowego (A. F. Parlow, Torrance, CA). Testosteron uwolniony do mediów duplikatów próbek komórek dla każdego stężenia LH mierzono za pomocą immunoenzymatycznego zestawu testowego z Neogen (Lexington, KY).
wszystkie dane są wyrażone jako średnia ± SD., Wartości EC50 dla działania LH na produkcję testosteronu zostały obliczone przez nieliniowe dopasowanie krzywych zależności stężenia LH uzyskanych dla każdego preparatu komórek Leydiga za pomocą pakietu oprogramowania (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Analiza statystyczna została przeprowadzona za pomocą testu t Studenta. Różnice uznano za znaczące w P < 0.05.