o Ligazie:
ligaza jest enzymem, który może tworzyć nowe wiązanie chemiczne, aby katalizować stapianie się dwóch dużych cząsteczek poprzez towarzyszącą hydrolizę małej grupy chemicznej. Ligazy wykorzystują ATP do tworzenia wiązań, i jest stosowany w rekombinacji DNA klonowania, łączenia dwóch komplementarnych fragmentów kwasu nukleinowego.
funkcja ligazy
enzymy ligazy DNA posiadają numer EC 6.5.1.1 (numer CAS 9015-85-4) i są używane do łączenia dwóch nici DNA poprzez naprawę przerw pojedynczych nici w celu katalizowania wiązań fosfodiestrowych., Związek zachodzi między 5′ fosforanowym końcem nukleotydu dawcy i 3′ hydroksylowym końcem akceptora nukleotydu.
czteroetapowy proces, który wymaga AMP, obejmuje: reorganizację aktywności w segmentach DNA lub fragmentach Okazaki, adenylotację pozostałości lizyny do aktywnego centrum enzymu w celu uwolnienia pirofosforanu, przeniesienie AMP do końca fosforanu 5′ dawcy nukleotydu w celu utworzenia końca pirofosforanu, tworzenie wiązania fosfodiestrowego między dawcą nukleotydu i 3 ' hydroksylu akceptora.,
interakcje ligazy
kodowana przez gen lig ligaza DNA E. coli zyskuje energię poprzez rozszczepienie dinukleotydu nikotynamidowo-adeninowego (NAD) w celu wytworzenia wiązania fosfodiestrowego, ale nie może połączyć RNA z DNA. Koncentraty polimerazy DNA mogą być stosowane do zwiększenia aktywności ligazy DNA E. coli, ale koncentraty muszą być mniejsze niż fragmenty, które mają być ligowane.
wirus Escherichia T4 jest stosowany głównie w badaniach laboratoryjnych i może być ligowany do kohezyjnych lub tępych końców oligonukleotydów oprócz hybryd RNA i RNA-DNA., Nie łączy się jednak z jednoniciowym kwasem nukleinowym ani nie używa NAD. T4 opiera się na KOFAKTORZE ATP i ma optymalną temperaturę 16 °C.
Mechanizm ligazy
enzym termostabilny pochodzi z termofilnej bakterii i aktywuje się w znacznie wyższych temperaturach niż inne ligazy DNA, podkreślone przez okresy półtrwania powyżej 1 godziny w temperaturze 95 °C i 48 godzin w temperaturze 65 °C. Pozwala to na wysoką sztywność hybrydyzacji i specyficzność ligacji, wykazując aktywność dla 500 cykli termicznych.