Madame Lelica

koncepcja SSF

pomysł przeprowadzenia hydrolizy enzymatycznej i fermentacji jednocześnie został przedstawiony przez Gauss et al. w patencie z 1976 roku ., Autorzy stwierdzili, że wydajność glukozy w tradycyjnej oddzielnej hydrolizie enzymatycznej (przy użyciu enzymów wytwarzanych przez grzyb Trichoderma reesei) była niska, prawdopodobnie z powodu hamowania hydrolizy przez glukozę i celobiozę produktu końcowego. Autorzy mogli jednak wykazać, że uzyskali wyższą ogólną wydajność etanolu podczas stosowania SSF, co przypisali usuwaniu glukozy i celobiozy przez fermentację, a w konsekwencji uwalnianiu hamowania produktu końcowego., Termin SSF (Skrót SSF jest często używany również do fermentacji w stanie stałym) nie był używany przez autorów w tym czasie, ale stał się powszechnym zapisem dla tego procesu w ciągu zaledwie kilku lat od pierwotnego wynalazku. Unikanie hamowania produktu końcowego jest nadal prawdopodobnie najważniejszym powodem stosowania SSF, ale istnieje kilka dodatkowych potencjalnych korzyści. Gauss i współpracownicy wymienili na przykład zaletę, że glukoza nie musi być oddzielona od frakcji ligniny po oddzielnym etapie hydrolizy enzymatycznej, unikając w ten sposób potencjalnej utraty cukru., Ponadto połączenie hydrolizy i fermentacji zmniejsza liczbę potrzebnych zbiorników, a tym samym koszty inwestycji. Szacuje się, że spadek inwestycji kapitałowych jest większy niż 20%. Jest to dość ważne, ponieważ można oczekiwać, że koszty kapitału będą porównywalne z kosztami surowców w produkcji etanolu z lignocelulozy . Inne korzyści, odnoszące się do wspólnego spożywania cukrów pentozy i heksozy oraz detoksykacji stały się widoczne niedawno, co zostanie omówione w dalszej części tego przeglądu.,

nieuchronnie, istnieją również wady SSF w porównaniu do oddzielnego procesu hydrolizy i fermentacji (SHF). Optymalna temperatura hydrolizy enzymatycznej jest zazwyczaj wyższa niż w przypadku fermentacji-przynajmniej w przypadku drożdży jako organizmu fermentującego. W procesie SHF temperatura hydrolizy enzymatycznej może być zoptymalizowana niezależnie od temperatury fermentacji, podczas gdy kompromis musi być znaleziony w procesie SSF. Ponadto drożdże nie mogą być ponownie użyte w procesie SSF ze względu na problemy z oddzieleniem drożdży od ligniny po fermentacji., W związku z tym drożdże będą musiały stanowić stratę wydajności w procesie SSF, jeśli drożdże są produkowane z węglowodanów w procesie (patrz rysunek 1) lub koszt eksploatacji, jeśli są dostarczane zewnętrznie. Enzymy są równie trudne do ponownego użycia, również w procesie SHF. Enzymy są wytwarzane w ramach procesu (patrz rysunek 1) – co oznacza utratę substratu-lub są dostarczane zewnętrznie i tym samym zwiększają koszty chemiczne., Recyrkulacja enzymów jest równie trudna, ponieważ enzymy wiążą się z substratem, chociaż częściową desorpcję można uzyskać po dodaniu środków powierzchniowo czynnych .

dostępność surowców lignocelulozowych różni się w zależności od lokalizacji geograficznej (patrz np., Kim i Dale), a półprodukty lignocelulozowe są raczej niejednorodne zarówno pod względem struktury, jak i składu chemicznego (zob. tabela 1). Ta niejednorodność ma duży wpływ na konstrukcję procesu, wpływając praktycznie na wszystkie etapy procesu, tj. mechaniczne obchodzenie się z materiałem, warunki obróbki wstępnej, wybór enzymów i szczepów drożdży, a także separację i właściwości pozostałej ligniny. Będzie to widoczne w poniższej dyskusji.,

obróbka wstępna

celem obróbki wstępnej jest zmiana struktury lignocelulozowej i zwiększenie szybkości hydrolizy enzymatycznej głównie celulozy. Należy to zrobić przy minimalnym tworzeniu związków, które hamują fermentujące mikroorganizmy . Dostępna powierzchnia jest uważana za jeden z najważniejszych czynników wpływających na skuteczność enzymatycznej degradacji celulozy ., W rodzimym drewnie tylko niewielka część naczyń włosowatych ściany komórkowej jest dostępna dla enzymów . Obróbka wstępna zwiększa jednak dostępną powierzchnię na kilka sposobów ; i) powstają fragmenty i pęknięcia , dając zwiększoną powierzchnię , ii) frakcja hemicelulozowa jest hydrolizowana, co zmniejsza efekty ekranowania, iii) lignina ulega również zmianom strukturalnym, a drewno jest delignifikowane w różnym stopniu, w zależności od technologii obróbki wstępnej . W ten sposób można usunąć osłonę mikrofibryli i zamknięcie porów spowodowane ligniną., Inne czynniki, uważa się, że wpływ na strawność w SSF, są krystaliczność substratu i stopień polimeryzacji (DP).

metody obróbki wstępnej można podzielić na metody fizyczne i chemiczne, a kombinacje tych dwóch są powszechnie stosowane (patrz np. recenzja napisana przez Mosier et al. ). Rodzaj surowca silnie wpływa na wybór metody obróbki wstępnej. Hemiceluloza jest na przykład acetylowana w wysokim stopniu w materiałach bogatych w ksylan., Ponieważ octan jest uwalniany podczas hydrolizy, wstępna obróbka tych materiałów jest w pewnym stopniu autokatalityczna i wymaga mniej dodanego kwasu i łagodniejszych warunków procesu. Jednak uwolniony octan zwiększa toksyczność hydrolizatów hemicelulozy.

obróbka wstępna włókna amoniakalnego/zamrażania (AFEX) jest uważana za atrakcyjną metodę wstępnej obróbki pozostałości rolniczych, uzyskując wysoce strawną celulozę . AFEX depolimeryzuje ligninę, usuwa hemicelulozę i dekrystalizuje celulozę ., Umiarkowana temperatura i pH minimalizują również powstawanie produktów degradacji cukru. Metoda ta wiąże się jednak z wysokimi kosztami odzysku amoniaku i amoniaku . W tym kontekście należy również wspomnieć o metodzie wapiennej, opartej na wodorotlenku wapnia (lub sodu). Wstępna obróbka alkaliczna odbywa się w niższych temperaturach przez długi czas przebywania, a jeśli chodzi o metodę AFEX, uzyskuje się delignifikację biomasy.

eksplozja pary jest intensywnie badaną metodą obróbki wstępnej ., Wpływ eksplozji niezatalizowanej pary-i wstępnej obróbki ciekłej gorącej wody-na biomasę przypisuje się przede wszystkim usunięciu hemiceluloz. Poprzez dodanie katalizatora kwasowego, hydroliza może być jeszcze lepsza . Rozcieńczone kwasy wstępne z zastosowaniem H2SO4 lub SO2 są najczęściej badanymi metodami obróbki wstępnej ze względu na ich skuteczność i niedrogość. Metody te zostały zastosowane w instalacjach pilotażowych, a tym samym są bliskie komercjalizacji . Zabieg katalizowany kwasem poprawia usuwanie hemicelulozy, daje częściową hydrolizę celulozy i zmienia strukturę ligniny ., Główne wady są związane z wymaganiami urządzeń procesowych i tworzenia inhibitora . Do tej pory udana obróbka wstępna za pomocą alkaliów, AFEX i płynnej gorącej wody była ograniczona do pozostałości rolniczych i roślin zielnych, podczas gdy obróbka wstępna z katalizowaną kwasem parą przyniosła wysokie plony cukru z tych materiałów, a także z surowców z drewna iglastego .

prostym określeniem twardości procesu obróbki wstępnej parą jest tzw. Współczynnik dotkliwości, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., W przypadku katalizowanej kwasem obróbki wstępnej stosuje się łączony Współczynnik ciężkości, log (CS). Bierze to również pod uwagę pH, log (CS) = log ( R0) – pH, a typowe wartości dla wstępnej obróbki katalizowanej kwasem pary drzew iglastych mieszczą się w zakresie od 2 do 4 .

optymalne warunki obróbki wstępnej w procesie SSF niekoniecznie różnią się znacznie od warunków w procesach SHF wykorzystujących biomasę lignocelulozową. Jednak kilka związków obecnych w hydrolizatach wstępnej obróbki, które hamują hydrolizę enzymatyczną, jest przekształcanych przez organizmy fermentujące., Jest to prawdopodobne wytłumaczenie wyższych notowanych plonów etanolu w SSF w porównaniu do SHF . Wytwarzanie inhibitorów z obróbki wstępnej może być zatem tolerowane w większym stopniu w procesie SSF. Związki hamujące można podzielić na trzy główne grupy; furaldehydy, słabe kwasy i fenole. Dwa najczęstsze furaldehydy, HMF (5-hydroksymetylo-2-furaldehyd) i furfural (2-furaldehyd), powstają w ciężkich warunkach z odpowiednio heksoz i pentoz., Słabe kwasy z materiałów lignocelulozowych, takie jak kwas octowy, mrówkowy i lewulinowy, powstają głównie w wyniku de acetylacji hemicelulozy lub rozkładu HMF . Związki fenolowe powstają głównie podczas rozkładu ligniny i występują w wielu wariantach, w zależności od rodzaju ligniny . Aby uzyskać bardziej dogłębną dyskusję na temat hamowania, patrz np. przegląd Almeida et al.

hydroliza enzymatyczna

udana obróbka wstępna w dużym stopniu usuwa hemicelulozę, pozostawiając celulozę dostępną do hydrolizy., Ponieważ najczęściej stosowane mikroorganizmy do produkcji etanolu wykorzystują wyłącznie monomery cukru, celuloza musi być hydrolizowana, co w SSF zachodzi równocześnie z fermentacją. Historycznie, przemysłowe trawienie celulozy zostało wykonane z hydrolizy kwasowej i optymalizacji hydrolizy kwasowej różnych materiałów lignocelulozowych przeprowadzono do celów produkcji etanolu ., Hydroliza kwasowa wytwarza jednak hydrolizaty, które są stosunkowo toksyczne dla drobnoustrojów fermentujących, a maksymalna wydajność glukozy jest ograniczona do około 60% W procesie wsadowym ze względów kinetycznych . Enzymatyczna degradacja frakcji celulozowej ma natomiast potencjał uzyskania stosunkowo nietoksycznych hydrolizatów o wyższych plonach cukru.

enzymy specjalizujące się w rozkładaniu β-1-4-wiązania glikozydowe glukanu są zbiorczo nazywane celulazami. W 1950 r. Reese i wsp. przedstawili model enzymatycznej hydrolizy celulozy oparty na wielu enzymach (C1 i CX)., Zakłada się, że enzym C1 wytwarza krótsze łańcuchy polianhydro-glukozowe, natomiast rozpuszczalność przypisuje się enzymowi CX. Zasadniczo ten sam obraz dotyczy dzisiaj, ale nastąpił ogromny postęp w wiedzy na temat wszystkich różnych specyficznych składników enzymu zaangażowanych. Celulazy dzielą się na trzy podkategorie, reprezentujące trzy rodzaje aktywności: endoglukanazy, egzoglukanazy (cellobiohydrolazy) i β-glukozydazy., Endoglukanazy znacznie zmniejszają stopień polimeryzacji podłoża poprzez przypadkowe atakowanie części wewnętrznych, głównie w amorficznych regionach celulozy. Egzoglukanazy (lub celobiohydrolazy), z drugiej strony, stopniowo skracają cząsteczki glukanu przez wiązanie się z końcami glukanu i uwalnianie głównie jednostek celobiozy. W końcu β-glukozydazy dzielą komórkę disacharydową na dwie jednostki glukozy.,

kilka rodzajów mikroorganizmów może wytwarzać układy celulazy, w tym tlenowe grzyby nitkowate, tlenowe actinomycetes, beztlenowe bakterie hipertermofilne i grzyby beztlenowe (patrz np. przegląd Lynd et al. ). Intensywne badania nad tlenowymi grzybami nitkowatymi T. reesei w ciągu ostatnich dziesięcioleci zaowocowały wydajnym organizmem produkującym celulazę, który obecnie dominuje w przemysłowej produkcji celulazy .

jak już wspomniano, ważną zaletą SSF w porównaniu do SHF jest zmniejszenie hamowania produktu końcowego przez cukry utworzone w hydrolizie., Produkt fermentacji Etanol również hamuje hydrolizę, ale w mniejszym stopniu niż celobioza czy glukoza . Kolejną zaletą jest to, że inhibitory z obróbki wstępnej mogą być metabolizowane przez mikroorganizmy . Jednak również proces SSF może cierpieć z powodu niepełnej hydrolizy stałej frakcji lignocelulozowej. Z wyjątkiem hamowania przez produkty końcowe lub inne składniki, może to być spowodowane dezaktywacją enzymu, bezproduktywną adsorpcją enzymu, zmniejszeniem dostępności końców łańcucha i zwiększeniem krystalizacji z konwersją wstępnie przetworzonej celulozy .,

w przemysłowym SSF stężenie enzymów i komórek powinno być odpowiednio zrównoważone, aby zminimalizować koszty produkcji drożdży i enzymów. Synergie między enzymami, np. endo-exo synergizm, exo-exo synergizm oraz synergizm między endo – lub egzoglukanazami i β-glukozydazami, powinny być również optymalizowane poprzez dostrajanie składu mieszanin enzymów. Optymalny skład z pewnością zależy od surowca lignocelulozowego.,

mikroorganizmy fermentujące

ogólne wymagania dla organizmu, który ma być stosowany w produkcji etanolu, to to, że powinien on dawać wysoką wydajność etanolu, wysoką wydajność i być w stanie wytrzymać wysokie stężenia etanolu, aby utrzymać niskie koszty destylacji . Oprócz tych ogólnych wymagań, tolerancja inhibitora, tolerancja temperatury i zdolność do wykorzystania wielu cukrów są niezbędne dla zastosowań SSF. Tolerancja na niskie wartości pH minimalizuje ryzyko zanieczyszczenia., Koń roboczy w produkcji etanolu na bazie skrobi lub sacharozy to popularne drożdże piekarskie, Saccharomyces cerevisiae. Organizm ten wytwarza Etanol z wysoką wydajnością (powyżej 0,45 g g-1 w optymalnych warunkach) i wysoką szybkością właściwą (do 1,3 g g-1 masa komórkowa h-1 ). Ma również bardzo wysoką tolerancję na Etanol, ponad 100 g L-1 odnotowano dla niektórych szczepów i mediów . Ponadto organizm okazał się być odporny na inne inhibitory, a zatem nadaje się do fermentacji materiałów lignocelulozowych .,

hemiceluloza z drewna liściastego i pozostałości rolniczych jest zazwyczaj bogata w ksylan (por. Tabela 1) – drewno liściaste zawierające głównie o-Acetylo-4-o-metylo-glukuronoksylan, podczas gdy trawy zawierają arabinoksylan . Z drugiej strony hemiceluloza z drewna iglastego zawiera więcej mannanów-głównie w postaci galaktoglukomannanu – i mniej ksylanu. Fermentacja mannozy jest zwykle wydajna w S., cerevisiae, podczas gdy zdolność do fermentacji galaktozy jest zależna od szczepu, a geny do wykorzystania galaktozy są ponadto tłumione przez glukozę, co prowadzi do typowego sekwencyjnego wykorzystania cukrów. Oczywiście fermentacja ksylozowa jest bardziej znaczącym problemem dla pozostałości rolniczych i drewna liściastego niż dla drewna iglastego. Ksyloza nie jest metabolizowana przez S. cerevisiae typu dzikiego, z wyjątkiem niewielkiego zmniejszenia do ksylitolu. To, a w niektórych przypadkach także tolerancja temperatury, było głównym powodem zainteresowania testowaniem również innych mikroorganizmów pod kątem konwersji lignocelulozy w SSF.,

naturalnie fermentujące ksylozy drożdże, takie jak Pichia stipitis i Candida shehatae , mogą potencjalnie być korzystne do stosowania w SSF materiałów o wysokiej zawartości ksylanu. Jednak Ich tolerancja na związki hamujące w niedetoksyfikowanych hydrolizatach lignocelulozy jest raczej niska, a ponadto bardzo niska i dobrze kontrolowana podaż tlenu jest wymagana do wydajnej fermentacji ksylozy . Głównymi „konkurentami” drożdży były bakterie zymomonas mobilis i genetycznie zmodyfikowana Escherichia coli. Z., mobilis, bakteria beztlenowa, która nie posiada funkcjonalnego systemu fosforylacji oksydacyjnej, produkuje etanol i dwutlenek węgla jako główne produkty fermentacji. Co ciekawe, Z. mobilis wykorzystuje szlak Entnera-Duodoroffa, który daje mniejszą produkcję ATP na katabolizowaną glukozę . To z kolei daje niższą wydajność biomasy i wyższą wydajność etanolu na glukozie w porównaniu z S. cerevisiae . Jednak dziki Z. mobilis nie ma zdolności do fermentacji cukrów pentozowych, a główną wadą jest to, że nie jest to bardzo silny organizm., Ogólnie rzecz biorąc, bakterie wydają się być mniej tolerancyjne dla inhibitorów pochodnych lignocelulozy, a etap detoksykacji może być potrzebny przed fermentacją. W przeciwieństwie do drożdży piekarskich i Z. mobilis, E. coli jest w stanie metabolizować wiele różnych substratów (w tym heksozy, pentozy i laktozy), ale organizm typu dzikiego ma mieszaną ścieżkę fermentacyjną, a zatem jest słabym producentem etanolu. W przełomowym wkładzie, przyznany numer patentu USA 5000000, szczep E., coli zostało genetycznie zmodyfikowane w producenta etanolu przez nadekspresję PDC (kodowanie dekarboksylazy pirogronianowej) i adhB (kodowanie dehydrogenazy alkoholowej) z Z. mobilis . Doskonałe wyniki uzyskano dzięki rekombinacji E. coli, np. szczep KO11, który wykazał wydajność etanolu od 86 do blisko 100% teoretycznego i końcowego stężenia etanolu do 40 g L-1 na hydrolizatach hemicelulozy z bagassy, stover kukurydzy i łusek kukurydzy ., Jednak tylko frakcja ciekła została użyta w zgłoszonych badaniach, a hydrolizaty zostały ponadto odtrute przed użyciem przez overlimining do pH 9 wodorotlenkiem wapnia, a następnie dostosowane do pH 6,0-6,5 z HCl. Ponadto, ponieważ optymalne pH wynosi 6,5, E. coli jest mniej odpowiednie dla procesów SSF z celulazami T. reesei, które ogólnie uważa się za optymalne pH około 4,8 .

fermentacja Pentozowa przez S. cerevisiae

ze względu na bardzo atrakcyjne właściwości S., cerevisiae w fermentacji przemysłowej w ostatnich dziesięcioleciach poczyniono znaczne wysiłki w celu zaprojektowania rekombinowanych szczepów fermentujących ksylozę i arabinozę tych drożdży. Szczepy fermentujące ksylozę S. cerevisiae mogą być zasadniczo skonstruowane albo poprzez wprowadzenie genów kodujących izomerazę ksylozy (XI) z bakterii i grzybów , albo genów kodujących reduktazę ksylozy (XR) i dehydrogenazę ksylitolową (XDH) z grzybów . Również endogenny Gen xks1 kodujący ksylulokinazę (XK) musi być nadekspresowany, aby uzyskać znaczącą fermentację ksylozy ., Białka transportowe są potrzebne do wychwytu ksylozy, a także innych cukrów w drożdżach. U S. cerevisiae stwierdzono, że ksyloza jest transportowana przez transportery heksozy, ale powinowactwo do ksylozy jest około 200 razy mniejsze niż do glukozy . W konsekwencji wychwyt ksylozy jest kompetycyjnie hamowany przez glukozę.

istnieje 20 różnych genów kodujących białka związane z transportem cukru, 18 pojedynczych układów (Hxt1-17 i Gal2) oraz Dwa powiązane białka sygnałowe (Snf3p i Rgt2p)., Transportery wykazują różne powinowactwa do cukrów, a ekspresja odpowiadających im genów jest regulowana przez stężenia cukru, tj. dostępność źródła węgla . Wcześniej sugerowano, że ksyloza jest pobierana zarówno przez układy o wysokim, jak i niskim powinowactwie transporterów glukozy( ryc. 2), ale wychwyt jest zwiększany w obecności niskich stężeń glukozy . Badania wykazały, że transportery heksozy o wysokim i pośrednim powinowactwie; Hxt4, Hxt5 Hxt7 i Gal2 są w rzeczywistości najważniejszymi transporterami dla ksylozy ., Ponadto wykazano, że niskie (ale niezerowe) stężenie glukozy w pożywce jest potrzebne do efektywnego wychwytu ksylozy . Zostało to wyjaśnione potrzebą glukozy do ekspresji enzymów glikolitycznych i półproduktów , a także wytwarzania metabolitów pośrednich dla początkowych etapów metabolizmu ksylozy i Szlaku pentozofosforanowego . Innym możliwym wyjaśnieniem, wynikającym zarówno z eksperymentów, jak i modelowania komputerowego, jest to, że glukoza jest potrzebna do ekspresji transporterów heksozy o korzystnych właściwościach transportowych ksylozy, np. Hxt4 ., W związku z tym, w celu uzyskania efektywnej kofermentacji ksylozy i glukozy w SSF (czasami oznaczanej jako SSCF-jednoczesne scukrzanie i kofermentacja) z rekombinowanym S. cerevisiae, konieczne jest utrzymanie stężenia glukozy na niskim poziomie, co wykazano w praktyce w ostatnich badaniach SSF .