Madame Lelica

– Struktur av ACLY med CoA avslører produktiv og uproduktiv CoA conformations

Vi produsert rekombinant, full-lengde ACLY i Escherichia coli for alle våre biokjemiske og strukturelle analyser (Extended Data Fig. 1a,b)., Differential scanning fluorimetry av enzymet med ulike kofaktorer bekreftet bindende og potensielle strukturelle endringer knyttet til ligander lagt alene eller i kombinasjon (Extended Data Fig. 1c). Vi har brukt disse dataene til å veilede strukturbestemmelse av ACLY med sin co-underlag eller co-produkter.

Vi forberedt rekombinant protein og utført først negative flekken enkelt-partikkel analyse av protein i fravær av alle metabolitter (ACLY-apo)., Den to-dimensjonale (2D) klasse gjennomsnitt fra 3,000 partikler bekreftet at protein dannet en tetramer (Extended Data Fig. 2a,b). For å få mer strukturelle detalj, har vi utført en cryo-EM studere på ACLY–citrate-CoA komplekse. Etter flere runder med optimalisering av cryo-EM prøvene, har vi konkludert med D2 symmetrisk cryo-EM struktur av ACLY–citrate-CoA struktur til en gjennomsnittlig samlet oppløsning på 3,0 Å. (Extended Data Fiken. 2c,d, 3 og 4 og Tabell 1).,

ACLY–citrate-CoA struktur danner en homotetramer med en sentral tetrameric CSH-modul og to BLITSEN domener på motsatte ender av CSH-modul (protomers 1 & 2 og 3 & 4) (Fig. 1a,b). BLITSEN domene (rester 1-806) vedtar en struktur som er veldig lik det som tidligere er rapportert α/β arkitektur av isolert N-terminal domene bundet til å citrate og ADP24., Den CSH domene (rester 859-1101) består utelukkende av helices og korte sløyfer, med strukturell homologi til en dimer av citrat syntase dimers som krysser på ~90° – vinkel (Extended Data Fig. 5a). BLITSEN og CSH domener for hver polypeptid-kjeden er forbundet med en stor grad utvidet ~50-rester coil-regionen, med unntak for en kort α-helix mellom rester 824 og 829. Den spiralformede region innenfor denne linker er den eneste punkt av betydelige kontakt (av van der Waals interaksjon) mellom de to BLITSEN domener på en side av molekylet., Den utvidede linker lar CSH av en subunit til å samhandle med BLITSEN domenet til en annen subunit over motsatt side av CSH-modulen. I motsetning til den relativt sparsomme interaksjoner mellom BLITSEN protomers, den CSH domener form et omfattende nettverk hovedsakelig av van der Waals interaksjoner som ville foreslå at CSH domener fungerer som en rigid tetrameric modul, mens de fire BLITSEN domener er mer fleksible. Dette er i samsvar med den observerte EM lokale oppløsning estimering på EM-kart er høyest i CSH domene (2.8 Å, Utvidede Data Fig., 4c), og våre tidligere observasjoner at CSH domene har en høyere smelte temperatur i forhold til BLITSEN på ~75 °C versus ~55 °C, respectively21.

CoA binder seg i grensesnittet mellom CSH og ASKE domener på separate underenhetene og ser ut til å ‘gjengangere’ den superdomains sammen. Den adenine base og ribose ring samhandle med CSH domene av en monomer og pantothenic arm og β-mercapto gruppe stikker inn i det aktive området av BLITSEN domenet til en annen subunit (Fig. 1c (til venstre) og Fig. 1d (til venstre))., Modellering av CoA er basert på observasjonen om at phosphorylated ADP-gruppen er godt løst i cryo-EM tetthet. Men mercapto-gruppen var ikke godt løst, noe som tyder på fleksibilitet i denne regionen. Selv om flere rester fra CSH og ASKE domener gjøre van der Waals interaksjoner med CoA, hydrogen obligasjoner fra S574, R576 og S577 fra ASKEN domene og K964 fra CSH domene til ribose-fosfat oxygens synes å spille en særlig viktig rolle i å stifte CoA på ASH–CSH-grensesnitt., Interessant, E599 er innen hydrogen-binding avstand til modellert svovel atom av CoA, trekker at det kan spille en viktig katalytisk rolle. Viktigheten av protein–CoA vekselsvirkningene fra ASKEN og CSH domenet er støttet av mutational følsomhet av rester R576 og K964, og potensialet katalytisk rolle E599 er støttet av sin mutational følsomhet til En eller Q, men ikke til D (Fig. 1f). Selv om citrate ble inkludert i utvalget for cryo-EM gjenoppbygging, det kunne ikke være trygt løst i cryo-EM kartet.,

Gitt uløste tetthet for mercapto gruppe av CoA, gjennomførte vi en annen rekonstruksjon av ACLY–citrate-CoA struktur uten å pålegge D2 symmetri for å finne ut om CoA kan vedta ulike conformations i forskjellige protomers. Vi var i stand til å forberede en rekonstruksjon uten å pålegge symmetri (C1, asymmetrisk lukket) til en nominell oppløsning 3,5-Å. I denne ACLY–citrate-CoA-C1 asymmetrisk lukket struktur, oppløsning rundt BLITSEN domenet er dårligere enn i D2 struktur, men den lokale oppløsning rundt CSH domenet er fortsatt relativt høy, fra 2,8 til 3,2 Å., Analyse av denne ACLY–citrate-CoA-C1 asymmetrisk lukket struktur avdekket at hver av BLITSEN domener, og tre av de fire CSH-domener og-CoA-molekyler, som ble vedtatt samme konfigurasjon som D2 struktur. Imidlertid, en av de CoA molekyler vedtar en alternativ konformasjon som phosphorylated ADP-fraksjonen er flyttet ~8 for Å mot CSH-modulen og pantothenic armen er bøyd over til å samhandle med CSH (Fig. 1b,c (høyre) og Fig. 1e). Den cryo-EM tetthet tilsvarende denne alternative CoA konformasjon er veldig tydelig (Fig. 1c (høyre))., Bemerkelsesverdig, cryo-EM tetthet er også observert for et velordnet vann molekylet, som ser ut til å bridge hydrogen bond interaksjoner mellom terminalen svovel atom av CoA med siden kjeden rester av H900, D1026 og R1065 med ekstra van der Waals interaksjoner fra L969, I973, H975 og R976 (Fig. 1d (høyre)). Samtidig med denne alternative CoA konformasjon, en sløyfe i CSH domene (rester 965-986) og de flankerer helices shift for å imøtekomme den alternative plasseringen av CoA adenine base (Fig. 1e)., Mutasjoner av H975, R976, D1026 og R1065 til alanin alle vis kompromittert aktivitet, noe som tyder på at binding av CoA til CSH domene er en eller annen måte involvert i enzymaktivitet (Fig. 1f). Gitt at CoA må reagere med citrate BLITSEN domene, henviser vi til CoA conformations med cysteamine av pantothenic arm som peker i retning av BLITSEN og CSH som «produktive» og «uproduktive’ CoA conformations, henholdsvis, bundet til ACLY.,

– Struktur av ACLY–citrate-CoA subpopulasjon avslører asymmetrisk BLITSEN retninger

I tillegg til de store ACLY–citrate-CoA partikkel-befolkning, som utgjør 57% av klasse 3 partikler, en subpopulasjon av ACLY–citrate-CoA komplekse partikler som representerer 23% av underklassen av partikler (10% totalt) ble også fanget i en 3D-rekonstruksjon uten å pålegge symmetri til en oppløsning på 4,3 Å (Extended Data Fig. 3)., Dette subpopulasjon av partikler som har en overordnet struktur som er lik den store ACLY–citrate-CoA befolkningen, bortsett fra at en av de fire BLITSEN domener er rotert ~50° mot sine nærmeste BLITSEN subunit å vedta en mer «åpne» konformasjon, slik vi omtaler det som «ACLY–citrate-CoA-C1 asymm åpne». I denne strukturen, tetthet er kun synlig for phosphorylated ADP-fraksjonen av to CoA molekyler bundet til to av symmetriske BLITSEN domener (Fig. 2a,b). En av de symmetriske og asymmetriske BLITSEN underenhetene viser ingen bevis for CoA bindende., Særlig, asymmetrisk BLITSEN domene vises uforenlig med produktiv CoA bindende (Fig. 2c). Vi foreslår at dette ACLY–citrate-CoA-C1 asymm åpne struktur representerer en mellomliggende tilstand av ACLY, der to aktive nettsteder er klar for katalyse og to er det ikke. Observasjon av denne strukturen også foreslår at de fire ACLY aktive nettsteder kan fungere uavhengig av hverandre.

– Struktur av ACLY-apo-stat er ugunstige for CoA bindende

Gitt den begrensede interaksjoner mellom CSH og ASKE domener, vi spurde om strukturen av ACLY i fravær av bundne ligander. For å gjøre dette, har vi bestemt cryo-EM struktur av ACLY i apo form, som vi var i stand til å løse 4,3-Å-oppløsning (Extended Data Fig. 4a og Tabell 1)., En sammenligning av ACLY-apo og ACLY–citrate-CoA strukturer avslører at, i apo-stat, hver av BLITSEN par på motsatte ender av tetramer er rotert mot hverandre med ~10° til å danne et mer åpent ACLY tetramer og til å plassere BLITSEN domener i posisjoner som ser ut til å disfavør produktive CoA bindende (Fig. 3). Spesielt, ASK looper sentrert på F533, S574 og K1018 (fra tilstøtende CSH domene) ville komme i konflikt med CoA som er bundet i ACLY–citrate-CoA struktur (Fig. 3b)., I tillegg er det to rester som er innen hydrogen-binding avstand til CoA fra ASKEN domene, R576 og E599, flytte ut av hydrogen-binding avstand i ACLY-apo-struktur (Fig. 3c). I mellomtiden, CSH-modulen er fortsatt i stor grad er uendret mellom de to strukturene. Sammen, en sammenligning av ACLY-apo og ACLY–citrate-CoA strukturer avslører at ACLY-apo-strukturen må omorganisere for å imøtekomme CoA underlaget.

ACLY–acetyl-CoA–OAA komplekse avslører CoA–citrate lyase reaksjon oppstår i ASKE domene

Differential scanning fluorimetry data viste at både acetyl-CoA og OAA produkter stabilisert ACLY protein (Extended Data Fig. 1c)., Dette funnet indikert at vi kunne fange ACLY–OAA–acetyl-CoA-produkt komplekse, og så bedre forstå reaksjonen mekanisme. For dette formål, har vi konkludert med cryo-EM struktur av komplekset, som vi løst 3,1-Å-oppløsning ved hjelp av D2-symmetri (Extended Data Fig. 4). Den overordnede strukturen av ACLY–co-produkt komplekse var mest lik den symmetriske ACLY–co-substrat (ACLY–citrate-CoA-D2) – kompleks, med en samlet root-mean-square avvik (r.m.s.d.) av 0.407 Å for Ca atomer (Fig. 4a)., Vi fant at acetyl-CoA okkupert samme bindende nettstedet som CoA og var også stabilisert av den samme grunnleggende rester, R576 og K964 (Fig. 4b). I tillegg var vi i stand til å entydig modell to OAA molekyler bundet til hver enkelt ACLY subunit (Fig. 4b-c). En OAA-molekylet (OAA1) overlapper med citrate bindende lomme innenfor ASH domene og proksimale til acetyl gruppe av acetyl-CoA. OAA1 gjør relativt beskjedne interaksjoner med protein, herunder hydrogen obligasjoner til N346 og T348 og van der Waals interaksjoner med F547., Den andre OAA-molekylet (OAA2) er bundet til CSH domene og gjør mer omfattende samhandling med ACLY enn OAA1. OAA2 kontakter CSH-modulen gjennom hydrogen obligasjoner til H900, D1026, R1065 og R1085 og gjennom van der Waals interaksjoner å F935 og F1061 fra en subunit, så vel som gjennom en hydrogen bånd til R1065 fra en annen subunit (Fig. 4c). OAA2 overlapper godt med bundet OAA i grisen hjertet citrate synthase25 (Extended Data Fig. 5b).

Vi også raffinert cryo-EM kart over ACLY–OAA–acetyl-CoA struktur uten symmetri begrensninger og fikk et identisk struktur med D2 symmetri, bortsett fra at en av de fire acetyl-CoA molekyler viste to mulige conformations av pantothenic arm av acetyl-CoA, med cysteamine av CoA mot BLITSEN domene, som i de tre andre protomers, og den andre mot CSH domene (Extended Data Fig. 6a)., Imidlertid, i motsetning til den alternative konformasjon av CoA funnet i ACLY–citrate-CoA struktur, plasseringen av phosphorylated ADP-gruppen gjorde ikke endring i disse to conformations. Den potensielle alternative konformasjon av acetyl-CoA kunne foreslå en mulig substrat utgivelsen vei i enzym omsetning eller en autoinhibitory tilstand av enzymet (diskutert nedenfor).

observasjon av OAA1 og acetyl-CoA produkter i ASKE domene sterkt anbefalt at lyase kjemi er utført der, i motsetning til tidligere forslag som dette i kjemi, er gjennomført i CSH domain22,23., Vi spekulerer i at OAA2 kan fungere for å hjelpe organisere CSH domene for samarbeid med BLITSEN domene og/eller fungere som et andre OAA produktet autoinhibitory nettstedet som kan sequester den pantothenic arm av acetyl-CoA (eller cysteamine av CoA) til å sitte over CSH domene, slik at de gjensidig utelukkende binding av CoA i en produktiv konformasjon er hemmet på høy cellular OAA konsentrasjoner (Extended Data Fig. 6a)., Det som er interessant, mens produktiv utvidet CoA retning med cysteamine peker mot BLITSEN domene kan ikke modellert inn ACLY-apo uten betydelig steriske sammenstøt (Fig. 2b), den snudd retning med cysteamine peker mot CSH domene kan (Extended Data Fig. 6b). Dette er i samsvar med våre funn at CoA, er i stand til å binde seg til ACLY i fravær av citrate og/eller ATP (data ikke vist), men vi foreslår en bøyd, konformasjon, som observert i en av de ACLY–citrate-CoA-C1 protomers (Fig. 1c (til høyre) og Fig., 1d (til høyre) og også den isolerte strukturen i CSH domain22.

Konsistent med hypotesen om at OAA2 kan tjene som en ACLY autoinhibitory-område, en tidligere studie viste at OAA er i stand til å hemme rotte leveren ACLY på en måte som er ikke-konkurrerende med citrate26. For å validere den funksjonelle betydningen av de to OAA nettsteder observert i ACLY–OAA–acetyl-CoA struktur, vi ansatt en steady-state fluorescens leskende eksperiment., Som en kontroll eksperiment, må vi først titrated citrate i ACLY i fravær eller tilstedeværelse av en mette konsentrasjon av CoA og var i stand til å tilpasse dataene til en citrate bindende nettstedet med Kd-verdier på 3,4 ± 0.5 µM og 1.4 ± 0.3 µM i fravær eller tilstedeværelse av CoA, med god R2-verdiene av 0.92 og 0.84, henholdsvis (Fig. 4d). Dette er konsistent med en citrate bindende nettstedet observert i ACLY BLITSEN domene krystallstruktur bundet til å citrate13 og krystall struktur intakt ACLY bundet til CoA og citrate22, som viser at CoA stabilisert citrate bindende i ACLY BLITSEN domain22., Vi neste titrated OAA inn ACLY og funnet at data passer betydelig bedre til en to-site-modellen (R2 = 0.99) enn en én-siden modellen (R2 = 0.93) (Fig. 4e). De to-området bindende modellen bedre tilpasset bifasisk fluorescens nedgang som blir tydelig ved høyere OAA konsentrasjoner, og gir opphav til en høy affinitet OAA bindende nettstedet (Kd = 15 ± 4 µM) som står for en tredjedel av den totale fluorescens endre og en lav affinitet OAA bindende nettstedet (Kd = ca 1300 ± 500 µM) som står for de resterende to tredjedeler av den totale fluorescens endre (Fig. 4e)., Disse dataene er i samsvar med den funksjonelle betydning av de to OAA bindende områder observert i ACLY–OAA–acetyl-CoA struktur.

ACLY-E599 er i posisjon til å virke som en viktig katalysator rester

ACLY–co-produkt struktur tillatt oss å ta en langvarig spørsmålet om ACLY molekylær mekanisme. ACLY er foreslått å cleave citryl-CoA mellomliggende ved hjelp av en generell base for å trekke ut et proton fra citrate substratet og/eller en generell syre for å reprotonate den OAA forlater group16,27,28., Dette er konsistent med en pH-verdi pris profil analyse av ACLY med en pKa av ~8.5 (Fig. 5a). Vi oppfatte hva andre tenker at evolusjonært bevart E599 er posisjonert til å spille en viktig katalytisk rolle, som en generell base og/eller syre, og/eller for å stabilisere phospho-citryl-CoA, middels (se neste avsnitt og Fig. 4b). En relativt høy pKa for en nedgravd glutamat rester har blitt bemerket previously29. I tråd med et viktig katalytisk rolle for E599, finner vi at den E599A og E599Q mutanter har betydelig nedsatt aktivitet (Fig. 1f), selv om kofaktor bindende var upåvirket (Fig. 5b)., I motsetning til dette, fant vi at en tilsvarende sure E599D mutant utstilt lignende aktivitet som WT ACLY (Fig. 1f), med en tilsvarende pH pris profil (Fig. 5a). Tatt sammen, data argumentere for viktigheten av E599 for katalyse av ACLY.

ACLY katalyse går gjennom en phospho-citryl-CoA middels i ASKE domene

identifisering av E599 som en viktig katalysator for rester spalting av citryl-CoA addukt til acetyl-CoA og OAA produkter gitt oss en mulighet til å felle en reaksjon mellomliggende av en ACLY-E599Q mutant i nærvær av ATP, citrate og CoA co-underlag., Derfor har vi blandet ACLY-E599Q mutant med mette konsentrasjoner av ATP, citrate og CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA) og bestemt dens cryo-EM struktur, som vi var i stand til å løse til en samlet løsning av 2.85 Å. Strukturen ble bestemt ved å pålegge D2 symmetri, og avslørte at BLITSEN og CSH domener av ACLY ble arrangert på samme måte ACLY–citrate-CoA produktet og ACLY–OAA–acetyl-CoA strukturer med r.m.s.d. verdier for Ca atomer av 0.584 og 0.620 Å, henholdsvis., Men i motsetning til disse andre substrat og produkt komplekser, den ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA komplekse avslørt bemerkelsesverdig godt definert cryo-EM tetthet i ASKE domene aktive området, som kan bli modellert som ADP (hydrolysert ATP) og en phospho-citryl-CoA, middels (Fig. 6a,b). Også, i motsetning til alle de andre ACLY strukturer som er rapportert i denne studien, aminosyre 752-767 loop harboring H760 rester, noe som har vist seg å megle fosfat overføring fra ATP til citrate, er godt organisert i den ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA struktur (Fig. 6c)., I tillegg, en magnesium ion eller vann molekylet også foreslått å stabilisere H760, er observert å være bundet til E599 og fosfat gruppe (Fig. 6c). Denne observasjonen tyder på at His760 rester, fosfat gruppe-og magnesium-ion-kan samarbeide for å stabilisere citrate for ligation å CoA i ASKE domene aktive nettstedet. I tillegg er det faktum at acetyl-CoA og OAA produkter er ikke observert i denne strukturen videre støtter vår konklusjon at E599 spiller en viktig katalytisk rolle i spalting av phospho-citryl-CoA middels til acetyl-CoA og OAA produkter innenfor ASH domene.,