Materialer og Metoder
Mus.
Wild-type C57BL/6-mus ble innhentet fra Charles River Laboratories (Wilmington, MA). PDE8A KO mus ble opprinnelig produsert av Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) i henhold til kontrakt med Pfizer, Inc. (Pfizer Global Forskning og Utvikling, Sandwich, STORBRITANNIA). De ble deretter brukt til å C57BL/6-mus ved University of Washington i 10 generasjoner. For de eksperimenter som er rapportert, alder matchet mus mellom 6 og 8 ukers alder ble brukt., Alle prosedyrene som ble brukt var godkjent av Institutional Animal Care and Use Komité (IACUC) fra University of Washington, i samsvar med National Institutes of Health Guide for Stell og Bruk av forsøksdyr.
Real-Time PCR.
Testis cDNA ble utarbeidet fra total RNA fra villtype-og PDE8A-null musen testis ved hjelp av SuperScript III og Oligo dT (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, usa). Real-Time PCR ble utført ved hjelp av Strøm SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, usa)., Primere (IDT, Coralville, IA) for PDE8A, dirigert til området nedstrøms av målretting kassett, var som følger: forward primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (ekson 19); revers primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (ekson 20). Den primere for hypoxanthine-guanin phosphoribosyltransferase var som følger: forward primer ATTATGCCGAGGATTTGGAA; revers primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
In Situ Hybridisering.
mal for riboprobe syntese ble oppnådd ved PCR ved hjelp av en plasmider som inneholder musen PDE8A rekkefølge., I særdeleshet, 3′ – område av musen PDE8A (exons 17-20) ble amplifisert ved hjelp av følgende primere: forward primer, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (understreket T3 phage RNA polymerase promotersekvens); revers primer, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (understreket T7 phage RNA polymerase promotersekvens). PCR-produktene ble isolert fra agarose gel og renset med en Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, usa)., 35S-merket riboprobes ble syntetisert av in vitro transkripsjon med en MAXIscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX) ved å bruke som mal PCR-produktet inneholder T3 og T7 phage RNA polymerase arrangøren nettsteder. In vitro transkripsjon ble gjennomført i 20 ĩl reaksjonsblandingen inneholder 5 µl av UTP (PerkinElmer, Boston, MA) og T3 RNA polymerase eller T7 RNA polymerase å få tak i den forstand eller antisense riboprobe, henholdsvis.
Testiklene ble dissekert fra villtype-og PDE8A KO mus og ble raskt frosne i Vev-Tek O. C. T. sammensatte (Sakura, Torrence, CA) på tørr is., Seksjoner (20 µm) ble kuttet i en kryostat, montert på en Superfrost pluss microslide (VWR Vitenskapelige, West Chester, PA), og luft tørket. Delene ble fiksert på 4% paraformaldehyde for 15 min i romtemperatur, behandlet med 0.25% eddiksyre i 0,1 M trietanolamin (pH 8,0) i 10 min, og dehydrert gjennom en gradert etanol-serien (30, 60, 80, 95 og 100%). Delene ble deretter inkubert med hybridiseringsbuffer i et fuktig kammer ved 60°C i 4 h. Etter skylling i 2× SSC (standard saltvann citrate; 1× SSC = 0,15 M natriumklorid/0.015 M natriumsitrat, pH 7.,2), deler var dehydrert gjennom en gradert etanol-serien. Hybridisering ble utført i buffer som inneholder 35S-merket antisense eller følelse probe (40 pg/34,000–38,000 cpm per µl) under plast coverslips i et fuktig kammer ved 60°C over natten. Den coverslips var forsiktig fjernet, og delene ble vasket med 2× SSC inneholder 10 mM DTT-for 30 min to ganger ved 60°C. seksjoner ble deretter inkubert i 30 min ved 37°C med 20 µg/ml RNaseA i 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5), og 1 mM EDTA, deretter vaskes i 50% formamide, 2× SSC inneholder 10 mM DTT-for 30 min ved 60°C i 1× SSC inneholder 10 mM DTT-for 30 min ved 60°C, og videre i 0.1× SSC inneholder 10 mM DTT-for 30 min ved 60°C. til Slutt, ble de delene dehydrert i etanol (70, 95 og 100%), air-tørket, og eksponert på BioMax XAR film (Eastman Kodak, Rochester, NY, usa) for 9 h. For å se cellen distribusjon av PDE8A mRNA hybridisering, lysbilder var belagt med Autoradiography NTB emulsjon (Eastman Kodak) og eksponert for 1 uke ved 4°C., Sidene ble utviklet, fast, og counterstained med hematoxyline og montert i Canada Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A Immunoprecipitation og Analyse.
Mus sperm ble isolert fra cauda bitestikkel av en svømme-ut metoden (38) og homogeniserte i PBS som inneholder 1% Nonidet (Roche Anvendt Vitenskap, Indianapolis, I), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidine, og Sigma protease inhibitor blanding (Sigma-Aldrich)., Den homogenate var sentrifugerte for 5 min på 16 000 × g i en mikrosentrifuge og 200 µl alikvoter av supernatanten, tilsvarende 106 sperm, ble inkubert over natten med 20 µl av en 1:1 blanding av protein G-agarose perler (Santa Cruz Bioteknologi Inc. Santa Cruz, CA, usa) i nærvær eller fravær av PDE8A antistoff (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Neste dag, den immunoprecipitate ble skylt tre ganger med PBS og deretter analysert for PDE aktivitet i nærvær av 10 nM cAMP substrat, 40 mM Mopper (pH 7.5), 15 mM Mg-acetat, 2 mM EGTA, og 0,2 mg/ml BSA som i ref. 39.,
Immunohistotochemistry.
Fersk frossen musen testiklene ble innebygd i Vev-Tek O. C. T. sammensatte og deretter snittes på en kryostat på 20 µm per skive. Vevsprøver eller isolert Leydig cellene ble tørket og fast i 4% (wt/vol) paraformaldehyde/PBS (pH 7.4) ved romtemperatur i 10 min og vasket tre ganger med PBS. Lysbildene var preincubated med å blokkere buffer (5% esel serum, 1 mg/ml BSA, og 0.,1% Triton X-100 i PBS) for 1 time ved romtemperatur, inkubert med en anti-PDE8A antistoff (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Bioteknologi) i PBS som inneholder 1% esel serum, 1 mg/ml BSA, og 0,1% Triton X-100 over natten ved 4°C, vasket i PBS som inneholder 0.05% Tween 20 tre ganger for 20 min, inkubert med donkey anti-geit Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) i PBS som inneholder 1 mg/ml BSA og 0,1% Triton X-100 for 2 h ved romtemperatur og vasket., Lysbildene ble ytterligere inkubert med å blokkere buffer som inneholder 5% geit serum for 1 time ved romtemperatur, inkubert med cytokrom P450-side kjede spalting enzym (CYP11A) antistoff (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) over natten ved 4°C, vasket i PBS som inneholder 0.05% Tween 20 tre ganger etter 20 min, og inkubert med geit anti-kanin Alexa488 (1:500; Invitrogen) som ovenfor. Delene ble til slutt counterstained med TIL-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) i PBS i 5 min, vasket, og montert i SlowFade Gull antifade reagens (Invitrogen)., For å teste PDE8A antistoff-spesifisitet, antistoff-løsning ble preincubated med 2,5 µg/ml antigen peptid (Santa Cruz Bioteknologi) for 2 h i romtemperatur før farging. Enkelte deler ble inkubert uten den primære antistoffer for å finne ut bakgrunnen på grunn av sekundær antistoffer. Den immunostaining signaler ble visualisert med en konfokal mikroskop (Leica SL Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). β-galactosidase aktivitet, uttrykt med et kjernefysisk lokalisering signal av LacZ genet i målretting kassett, ble vurdert av X-gal farging., Delene ble først inkubert med anti-CYP11A antistoff etterfulgt av anti-kanin alkalisk fosfatase-konjugat (1:500; Invitrogen) og NBT/BCIP (Roche) for farge utvikling. X-gal farging ble deretter utført som beskrevet (40) i X-gal blandingen ved 37°C over natten. Delene ble vasket og montert med glyserol/Tris-bufret saltvann.
Leydig Celle Rensing.
Leydig cellene ble isolert som beskrevet i ref. 41. Kort, testiklene fra voksne mus ble decapsulated og spres i en risting vannbad ved 34°C i 10 min i 10 ml Medium 199 (M-199) med 0.,25 mg/ml kllagenase D, 35 mU/ml Dispase II, og 6 µg/ml DNase I. for Å avslutte vev spredning, 40 ml 1% BSA i M-199 medier som inneholder 15 mM Hepes, 4 mM sodium bicarbonate, og 25 µg/ml soyabønner trypsin-hemmer ble lagt til for å fortynne den opprinnelige suspensjon. Rør deretter ble avkortet og ned flere ganger. Seminiferous tubuli fikk lov til å bosette seg av tyngdekraften, og supernatanten inneholder den interstitielle celler ble samlet inn. Prosedyren ble gjentatt to ganger for å ytterligere harvest interstitielle celler., Cellene ble pelletert i 50-ml rør ved sentrifugering på 800 × g i 20 min ved 4°C, og deretter fraksjonert ved hjelp av en kontinuerlig Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) gradient (55% Percoll i HBSS bufret med 15 mM Hepes-og 25 µg/ml soyabønner trypsin-hemmer) i et samlet volum på 35 ml. Graderinger ble dannet i situ ved sentrifugering i en JA-20 fast vinkel rotoren (Beckman Coulter, Fullerton, CA, usa) på 23,700 × g i 30 min ved 4°C. rør som inneholder tetthet markør perler (GE Healthcare) ble brukt som en referanse for å identifisere de ulike tetthet lag., Leydig cellene ble gjenopprettet som starter på en tetthet på 1,07 g/ml til bunnen av fargeovergangen. Fem bind av HBSS ble lagt til for å fortynne Percoll, og cellene ble pelletert på 200 × g i 10 min ved 4°C. Den endelige pellet innhentet fra to testikler, beriket i Leydig cellene ble resuspendert i 4 ml av DMEM/F-12 supplert med 1% BSA og brukes umiddelbart for eksperimenter.
3β-Hydoxysteroid Dehydrogenase Analysen.
Måling av Testosteron Produksjon.
Leydig cellene ble resuspendert som over 100 µl alikvoter som ble utlevert i 96-bra plater., Cellene ble stimulert i 150-µl endelig volum med den angitte konsentrasjoner av rekombinant LH for 3 h i 5% CO2 inkubator ved 37°C. Rekombinant human LH ble hentet fra den Nasjonale Hormon & Peptid-Programmet (A. F. Parlow, Torrance, CA, usa). Testosteron sluppet ut i media med dupliserte cellen prøvene for hver LH konsentrasjon ble målt ved hjelp av en immunoenzymatic assay kit fra Neogen (Lexington, KY).
Alle data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD., Den EC50-verdier for LH action på testosteron produksjonen ble beregnet ved ikke-lineære montering av LH konsentrasjon-avhengighet kurver oppnådd for hver Leydig cellene forberedelse ved hjelp av en programvare-pakke (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Programvare, San Diego, CA, usa). Statistiske analyser ble utført av Student ‘ s t-test. Forskjeller ble ansett som signifikant på P < 0.05.