Madame Lelica

De SSF konsept

ideen om å utføre enzymatisk hydrolyse og fermentering samtidig ble lagt frem av Gauss et al. i et patent fra 1976 ., Forfatterne uttalte at glukose avkastning i en tradisjonell separat enzymatisk hydrolyse (ved hjelp av enzymer som produseres av soppen Trichoderma reesei) var lav, trolig på grunn av end-produkt hemming av hydrolyse av glukose og cellobiose. Forfatterne kunne imidlertid vise at de har oppnådd en høyere samlet etanol yield ved bruk av SSF, som de tilskrives fjerning av glukose og cellobiose ved gjæring, og påfølgende utslipp av end-produkt-hemming., Begrepet SSF (forkortelsen SSF er ofte brukt også for solid state-gjæring) ble ikke brukt av forfattere på den tiden, men ble vanlig notasjon for denne prosessen i løpet av noen få år fra den opprinnelige oppfinnelse. Unngå end-produkt hemming er likevel trolig den viktigste grunnen for å bruke SSF, men det er flere andre mulige fordeler. Gauss og co-arbeidere, nevnes for eksempel den fordelen at glukose trenger ikke å være adskilt fra lignin brøkdel følgende separat enzymatisk hydrolyse trinn, og dermed unngå en potensiell tap av sukker., Videre kombinasjon av hydrolyse og fermentering reduserer antall fartøy som er nødvendig, og dermed investeringskostnadene. Nedgangen i hovedstaden investeringen har blitt anslått til å være større enn 20%. Dette er ganske viktig, siden den kapital som kan forventes å være sammenlignbare med de råvarepriser i etanol produksjon fra lignocellulose . Andre fordeler knyttet til co-forbruk av pentose og hexose sukker og avgiftning har blitt klart mer nylig, som vil bli diskutert senere i denne anmeldelsen.,

Uunngåelig, det er også ulemper av SSF i forhold til egen hydrolyse og fermentering (SHF) prosess. Den optimale temperaturen for enzymatisk hydrolyse er vanligvis høyere enn for gjæring – i hvert fall når du bruker gjær som gjæring organismen. I en SHF prosessen, temperaturen for enzymatisk hydrolyse kan være optimalisert uavhengig av gjæring temperatur, mens et kompromiss må bli funnet i en SSF prosessen. Videre gjær ikke kan gjenbrukes i en SSF prosessen på grunn av problemene med å skille gjær fra lignin etter gjæring., Derfor, gjær vil nødvendigvis representerer en avkastning tap i en SSF prosessen, hvis gjæren er produsert fra karbohydrater i prosessen (se Figur 1) eller en løpende kostnad hvis det er eksternt er levert. Enzymer er like vanskelig å bruke, også i en SHF prosessen. Enzymer er enten produsert i prosessen (se Figur 1) – og dermed representerer et tap av substrat – eller er eksternt er levert og dermed legge til kjemisk kostnader., Resirkulasjon av enzymer som er like vanskelig siden de enzymene som binder seg til underlaget, selv om en delvis desorpsjon kan fås etter tillegg av tensider .

tilgjengeligheten av lignocellulosic feedstocks varierer avhengig av geografisk plassering (se f.eks., Kim og Dale ), og lignocellulosic feedstocks er ganske heterogent i form av både struktur og kjemisk sammensetning (se Tabell 1). Dette mangfold har en sterk innvirkning på prosessen design, som berører nesten alle prosess-steg, dvs. mekanisk håndtering av materialet, forbehandling, betingelser, valg av enzymer og gjær stammer, samt separasjon og egenskaper til den gjenværende lignin. Dette vil bli tydelig i diskusjonen nedenfor.,

Forbehandling

formålet med forbehandling er å endre lignocellulosic struktur og øke frekvensen av enzymatisk hydrolyse av først og fremst av cellulose. Dette bør gjøres med et minimum av dannelse av forbindelser som hemmer gjæring mikroorganismer . Tilgjengelig areal er ansett som en av de viktigste faktorer som påvirker effektiviteten av enzymatisk nedbrytning av cellulose ., I det opprinnelige tre bare en liten brøkdel av cellen vegg kapillærer er tilgjengelig for enzymer . Forbehandling, men øker den tilgjengelige området på flere måter ; i) fragmenter og sprekker er dannet gir økt området , ii) hemicellulose brøkdel er hydrolysed som reduserer skjerming effekter , iii) lignin også gjennomgår strukturelle endringer, og skogen er delignified til ulike grader, avhengig av forbehandling teknologi . Dermed skjerming av microfibrils og occluding av porene, forårsaket av lignin, kan bli fjernet., Andre faktorer som er antatt å påvirke fordøyelighet i SSF, er underlaget crystallinity og graden av polymerisering (DP) .

forbehandling metoder kan deles inn i fysiske og kjemiske metoder, og kombinasjoner av disse to blir ofte brukt (se for eksempel anmeldelsen er skrevet av Mosier et al. ). Den type råstoff sterkt påvirker valg av forbehandling metode. Den hemicellulose er, for eksempel, acetylated til en høy grad i xylan-rikt materiale., Siden acetate er frigjort i løpet av hydrolyse, forbehandling av disse materialer, til en viss grad autocatalytic og krever mindre tilsatt syre og mildere prosessen forhold. Imidlertid, de frigjorte acetate legger til toksisitet av hemicellulose hydrolyzates.

Ammoniakk fiber/frys eksplosjon (AFEX) forbehandling er ansett som en attraktiv metode for forbehandling av landbruks-rester, noe som gir lett fordøyelig cellulose . AFEX depolymerizes den lignin, fjerner hemicellulose og decrystallizes den cellulose ., Moderat temperatur-og pH-også minimere dannelse av sukker nedbrytning produkter. Men metoden lider av høye kostnader av ammoniakk og ammoniakk recovery . I denne sammenheng er den lime-metoden, basert på kalsium (eller sodium) hydroksid bør også nevnes. Alkali pretreatments kjøres ved lavere temperaturer for lang residence ganger, og som for AFEX metode, en delignification av biomasse er oppnådd.

Steam eksplosjon er et intensivt studert forbehandling metode ., Effekten av uncatalyzed steam eksplosjon – og flytende varmt vann pretreatments – på biomasse er først og fremst knyttet til fjerning av hemicelluloses. Ved å legge til en syre katalysator, hydrolyse kan bli ytterligere forbedret . Fortynnet syre pretreatments ved hjelp av H2SO4 eller SO2 er mest undersøkt forbehandling metoder på grunn av sin effektivitet og inexpensiveness. Disse metodene har blitt brukt i pilot planter og, derfor, er nær kommersialisering . Syre catalyzed behandling forbedrer hemicellulose fjerning , gir en delvis hydrolyse av cellulose og endrer lignin struktur ., De viktigste ulempene er knyttet til prosess krav til utstyr og hemmer dannelse . Så langt er vellykket pretreatments med alkali, AFEX og flytende varmt vann har vært begrenset til landbruket rester og urteaktige avlinger , mens syre catalysed steam pretreatments har generert høye sukker rentene fra disse materialer, så vel som fra bartre feedstocks .

En enkel kvantifisering av grovheten av en damp forbehandling prosessen er den såkalte Alvorlighetsgraden Faktor, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., For syre catalyzed pretreatments den Kombinerte Alvorlighetsgraden Faktor, log(CS), er brukt en gang. Dette tar også pH-inn på konto, logg(CS) = log(R0) – pH, og typiske verdier for syre catalyzed steam eksplosjon forbehandling av bartre er i området 2 til 4 .

Optimal forbehandling forhold i en SSF prosessen ikke nødvendigvis skiller mye fra de over en SHF prosesser utnytte lignocellulosic biomasse. Imidlertid flere forbindelser til stede i forbehandling hydrolyzates, som hemmer enzymatisk hydrolyse er konvertert av gjæring organismer., Dette er en sannsynlig forklaring bak den høyere rapportert etanol gir i SSF i forhold til SHF . Hemmer dannelsen fra forbehandling kan derfor tolereres til en høyere grad i en SSF prosessen. Hemmende forbindelser kan bli satt inn i tre hovedgrupper; furaldehydes, svake syrer, og phenolics. De to mest vanlige furaldehydes, HMF (5-hydroxymethyl-2-furaldehyde) og furfural (2-furaldehyde), er dannet ved alvorlige forhold fra hexoses og pentoses, henholdsvis ., Svake syrer fra lignocellulosic materialer, som for eksempel eddik, formic og levulinic syre, er hovedsakelig dannet av de-acetylation av hemicellulose eller HMF sammenbrudd . Fenoliske forbindelser dannes hovedsakelig i løpet av lignin sammenbrudd, og finnes i mange varianter, avhengig av lignin . For en mer dyptgående diskusjon om hemming se for eksempel omtale av Almeida et al .

Enzymatisk hydrolyse

En vellykket forbehandling har til en stor grad fjernet hemicellulose, forlater cellulose tilgjengelig for hydrolyse., Siden de mest brukte mikroorganismer for etanol produksjon utelukkende benytte sukker monomere, fører det cellulose behov for å være hydrolysert, som i en SSF skjer samtidig med gjæring. Historisk, industriell cellulose fordøyelsen har blitt gjort med syre hydrolyse og optimalisering av syre hydrolyse av ulike lignocellulosic materialer som har vært gjennomført for å produsere etanol formål ., Syre hydrolyse, men produserer hydrolyzates som er relativt giftig for gjæring mikroorganismer, og den maksimale glukose kapasitet er begrenset til ca 60% i en batch prosess for kinetisk grunner . Enzymatisk nedbrytning av cellulose fraksjonen, på den annen side, har potensial til noe som gir relativt ikke-giftig hydrolyzates med høyere sukker gir.

Enzymer som er spesialisert i å bryte opp β-1-4-glycosidic obligasjoner glukan er samlet kalt cellulases. I 1950, Reese et al presentert en modell av enzymatisk cellulose hydrolyse basert på flere enzymer (C1 og CX)., C1 enzym ble antatt å produsere kortere polyanhydro-glukose kjettinger, mens solubilization ble tilskrevet CX-enzymet. I utgangspunktet det samme bildet gjelder i dag, men det har vært en enorm fremgang i kunnskap om alle de ulike spesifikke enzym komponenter som er involvert. Den cellulases er delt inn i tre sub-kategorier, som representerer tre typer aktiviteter: endoglucanases, exoglucanases (cellobiohydrolases) og β-glucosidases., Endoglucanases redusere graden av polymerisering av substrat med tilfeldig angripe indre deler, hovedsakelig i den amorfe områder av cellulose. Exoglucanases (eller cellobiohydrolases), på den annen side, trinnvis forkorte glukan molekyler ved binding til glukan ender og slippe hovedsakelig cellobiose enheter. Til slutt, β-glucosidases dele disaccharide cellobiose inn i to enheter av glukose.,

Flere typer mikroorganismer som kan produsere cellulase systemer, inkludert aerobic trådformede sopp, aerobic actinomycetes, anaerob hyperthermophilic og anaerobe bakterier sopp (se for eksempel omtale av Lynd et al. ). Intensiv forskning på aerobic trådformede sopp T. reesei i løpet av de siste tiårene har resultert i en effektiv cellulase å produsere organisme, som for tiden dominerer den industrielle cellulase produksjon .

Som allerede nevnt, en viktig fordel med SSF i forhold til SHF er reduksjon av end-produkt hemming av sukker dannes ved hydrolyse., Gjæring produktet etanol hemmer også hydrolyse, men i mindre grad enn cellobiose eller glukose . En annen fordel er at hemmere fra forbehandling kan bli metabolisert av mikroorganismer . Men også SSF prosessen kan lide av ufullstendig hydrolyse av solid lignocellulosic brøkdel. Med unntak for hemming av end-produkter eller andre komponenter , kan dette være på grunn av enzymet deaktivering, uproduktive enzym adsorpsjon , redusere tilgjengeligheten av kjeden ender , og øke crystallinity med konvertering av pretreated cellulose .,

I en industriell SSF -, enzym-og celle-konsentrasjoner bør være riktig balansert for å minimere kostnadene for gjær og enzym produksjon. Synergier mellom de enzymer, f.eks. endo-exo synergism , exo-exo synergism , og synergism mellom endo – eller exoglucanases og β-glucosidases , bør også være optimalisert ved å justere sammensetningen av enzymet blandinger. Den optimale sammensetningen vil absolutt avhenger av lignocellulosic råstoff.,

Gjæring mikroorganismer

Den generelle krav på en organisme som skal brukes i etanol produksjon er at det skal gi en høy etanol avkastning, høy produktivitet og være i stand til å tåle høye konsentrasjoner av etanol for å holde destillasjon kostnadene lave . I tillegg til disse generelle krav, hemmer toleranse, temperatur toleranse og evne til å utnytte flere sukker som er avgjørende for SSF programmer. Toleranse overfor lav pH-verdier vil minimere risikoen for forurensning., Work-hest i stivelse eller sukrose-basert etanol produksjon er det vanlig Bakers’ gjæren Saccharomyces cerevisiae. Denne organismen produserer etanol ved en høy avkastning (høyere enn 0,45 g g-1 ved optimale forhold) og en høy spesifikk pris (opptil 1,3 g g-1 cellemassen h-1 ). Det har også en veldig høy etanol toleranse, over 100 g L-1 har blitt rapportert for enkelte stammer og media . I tillegg organismen har vist seg å være robust i forhold til andre hemmere, og derfor er det egnet for gjæring av lignocellulosic materialer .,

Hemicellulose fra løvtre og landbruks-rester er vanligvis rik på xylans (jf. Tabell 1) – løvtre som inneholder først og fremst O-acetyl-4-O-methyl-glucuronoxylan, mens gress inneholder arabinoxylan . Bartre hemicellulose, på den annen side, inneholder mer mannans – først og fremst i form på galactoglucomannan – og mindre xylan. Mannose gjæringen er normalt effektiv i S., cerevisiae, mens evnen til å gjære galaktose er belastningen avhengige , og gener for galaktose utnyttelse er videre undertrykt av glukose , noe som fører til en typisk sekvensiell utnyttelse av sukker. Klart, xylose gjæring er en mer betydelig problem for landbruket rester og pent enn for bartre. Xylose er ikke metaboliseres av vill-type S. cerevisiae, bortsett fra en mindre reduksjon for å xylitol. Dette, og for noen deler av temperatur toleranse, har vært den viktigste årsaken bak interesse for å teste også andre mikroorganismer for lignocellulose konvertering i SSF.,

Naturlig xylose-gjæring gjær, for eksempel Pichia stipitis og Candida shehatae , kan potensielt være en fordel å bruke i SSF av materialer med høy xylan innholdet. Men, deres toleranse for hemmende forbindelser i undetoxified lignocellulose hydrolyzates er ganske lav , og i tillegg en svært lav og godt kontrollert tilførsel av oksygen er nødvendig for effektiv xylose gjæring . Den viktigste «konkurrenter» til gjæren har vært bakterier Zymomonas mobilis og genmodifisert Escherichia coli. Z., mobilis, en obligately anaerob bakterie, som mangler et funksjonelt system for oksidativt phosphorylation, produserer etanol og karbondioksid som rektor gjæring produkter. Interessant, Z. mobilis benytter Entner-Duodoroff vei som gir en lavere ATP produksjon per catabolized glukose . Dette i sin tur gir en lavere biomasse avkastning, og en høyere etanol avkastning på glukose i forhold til S. cerevisiae . Imidlertid, wild-type Z. mobilis mangler evnen til å gjære pentose sukker, og en stor ulempe er videre at det er ikke en veldig robust organismen., Generelt, bakterier ser ut til å være mindre tolerant for å lignocellulose-avledet hemmere , og en avgiftning trinn kan være nødvendig før gjæring. I motsetning til Bakers’ gjær og Z. mobilis, E. coli er i stand til metabolizing et bredt utvalg av underlag (inkludert hexoses, pentoses og laktose), men vill-type organisme har en blandet fermentative vei, og er dermed en dårlig ethanol producer. – I en landemerke-bidrag, tildelt US patent number 5000000 , en stamme av E., coli var genmodifisert til en ethanol producer av overexpression av PDC (koding pyruvate decarboxylase) og adhB (koding alkohol dehydrogenase) fra Z. mobilis . Gode resultater har blitt oppnådd med rekombinant e.coli, f.eks. KO11 belastning, som har vist etanol gir fra 86 til nær 100% av den teoretiske, og siste etanol konsentrasjoner opp til 40 g L-1 på hemicellulose hydrolyzates av bagasse, mais stover, mais og skrog ., Det er imidlertid bare den flytende fraksjonen ble brukt i rapporterte studier, og hydrolyzates ble videre detoxified før bruk av overliming til pH 9 med kaliumhydroksid og deretter justert til pH 6.0–6.5 med HCl. Videre, siden den optimale pH 6.5, E. coli er mindre egnet for SSF prosesser med T. reesei cellulases, som generelt er ansett for å ha en optimal pH rundt 4.8 .

Pentose gjæring ved konstruert S. cerevisiae

på Grunn av den svært attraktive egenskaper S., cerevisiae i industriell fermentations, det har vært en betydelig innsats som er gjort i de siste tiårene til å utforme rekombinant xylose og arabinose gjæring stammer av denne gjær. Xylose gjæring stammer av S. cerevisiae kan i prinsippet bygges enten ved å innføre genene som koder xylose isomerase (XI) fra bakterier og sopp , eller genene som koder xylose reduktase (XR) og xylitol dehydrogenase (XDH) fra sopp . Også den endogene XKS1 genkode xylulokinase (XK) har til å være overexpressed å oppnå betydelige xylose gjæring ., Transport proteiner er nødvendig for opptak av xylose, så vel som av andre sukkerarter i gjær. I S. cerevisiae, xylose har blitt funnet å transporteres med hexose transportører, , men affinitet for xylose er omtrent 200 ganger lavere enn for glukose . Følgelig, xylose opptak er konkurransedyktig hemmet av glukose.

Det er 20 forskjellige genene som koder sukker transport relaterte proteiner, 18 individuelle systemer (Hxt1-17 og Gal2) og to i slekt signal proteiner (Snf3p og Rgt2p)., De transportører har ulike preferanser for sukker, og et uttrykk for deres tilsvarende gener er regulert av sukker konsentrasjoner, dvs. tilgjengeligheten av karbon kilde . Det har tidligere blitt antydet at xylose er tatt opp med både høy – og lav affinitet systemer av glukose transportører (Figur 2), men opptaket er økt i nærvær av lav glukose konsentrasjoner . Studier har indikert at de med høy og middels-affinitet hexose transportører; Hxt4, Hxt5 Hxt7 og Gal2 er faktisk den viktigste transportører for xylose ., Videre har det blitt vist at et lavt (men ikke-null) glukose konsentrasjon er nødvendig i medium for effektiv xylose opptak . Dette har blitt forklart med et behov for glukose for uttrykk av glycolytic enzymer og viderekommende , samt generering av mellomledd metabolitter for de første trinnene av xylose metabolisme og pentose fosfat veien . En annen mulig forklaring, avledet fra både eksperimenter og computer modellering, er at glukose er nødvendig for å uttrykke hexose transportører med gunstig xylose transport egenskaper, f.eks. Hxt4 ., Følgelig, for å oppnå effektiv co-gjæring av xylose og glukose i SSF (noen ganger betegnet SSCF – samtidig saccharification og co-gjæring) med rekombinant S. cerevisiae, det er nødvendig å holde glukose konsentrasjon lav, noe som har vist seg i praksis i de senere SSF studier .