Madame Lelica

Det er fire familier av intracellulære proteolytiske komplekser allestedsnærværende i eubacteria: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP og FtsH. I tillegg til disse fem, HtrA (DegP) er en periplasmic/utskilt proteolytiske komplekse, mens prokaryotic proteasome er funnet bare i actinomycetes. Struktur, funksjon og rolle i patogenesen av hver protease har vært vurdert tidligere.,13, 17 Flere av disse kompleksene har blitt undersøkt som potensielle antibakterielle mål, inkludert Lon,18 ClpXP,19 HtrA20 og proteasome.21 Av disse, ClpXP har vært mest omfattende undersøkt, og er den eneste kompleks som naturlig produkt-hemmere har blitt funnet så langt.

clp-proteolytiske komplekse

ClpPs er godt bevart i de fleste bakteriearter og har en viktig rolle i protein omsetning., I tillegg til protein homeostase og nedbrytning av misfolded proteiner, ClpP er også involvert i en rekke regulatoriske prosesser ved å målrette transcriptional regulatorer og ombygging av proteome.22, 23, 24, 25 Ja, ClpP har blitt funnet å ha en sentral rolle i regulering av prosesser som celledeling, stresstoleranse, virulence, morfologiske differensiering og antibiotika resistens.22, 23, 24 ClpP rolle i disse prosessene er avhengig av sin strenge utvalg av protein underlag, som det oppnår ved å begrense tilgangen til sin katalytisk nettsteder., Hver ClpP komplekset er dannet ved å stable to heptameric ringer for å opprette en tetradecamer (Figur 2).26 Den kanalen som er dannet hus 14 serin protease katalytisk nettsteder som ikke kan nås uten passasje gjennom aksial åpninger. Videre, apo-ClpP vedtar en inaktiv, komprimert konformasjon som i sin katalytisk triaden er forskjøvet.27 Kontrollere conformational aktivering og tilgang til aksial åpninger er Hsp100 proteiner av AAA+ superfamily av ATPases: ClpA eller ClpX i Gram-negative bakterier og ClpC eller ClpX i Gram-positive., Disse tilbehør ATPases form hexameric ringer som binder tetradecamer er aksial ansikter ved å bruke tripeptide (L/I)GF motiver som passer inn hydrofobe lommer.28 Bindende i denne hydrofobe lomme regulerer ClpP aktivitet på to måter: for det første, ved å stabilisere komplekse i en aktiv, utvidet overensstemmelse med den katalytisk triade justert, og for det andre, gjennom protein substrat utfolder seg., AAA+ ATPases samhandle med protein mål, enten direkte eller gjennom et samarbeid adapter protein, og bruker energien som leveres av ATP til å utfolde seg underlaget og mate den inn i sentrale pore hvor det er hydrolysert i en energi-uavhengige måte. Så kastet proteiner er ellers for stor til å angi kanalen, disse AAA+ partnere tett som regulerer protein underlag er målrettet for degredation.28

de Fleste bakterielle arter, blant annet E. coli, Bacillus subtilis og Staphylococcus aureus, har en clpP genet som, sammen med de tilknyttede AAA+ ATPases, er uviktige for celleviabilitet.25, 29, 30, 31, 32 Likevel, det har blitt observert at clpP sletting i disse artene øker deres følsomhet for antibiotika som linezolid og rifampicin, og reduserer virulence i patogener som Listeria monocytogenes og S. aureus.,23, 33 Tap av virulence i ClpXP-mangelfull stammer som har vært knyttet til de store forstyrrelsene i global virulence transcriptional faktor nivåer, som sar – /agr regulatoriske nettverk i S. aureus.23 det er Interessant at effekten av ClpP inaktivering på flere av disse virulence myndigheter ser ut til å være belastning avhengige, og dessuten noen S. aureus stammer mangelfull i ClpXP funksjon synes å ha redusert følsomhet for vankomycin, daptomycin og β-lactam antibiotika.,34, 35, 36

I motsetning til de fleste bakterier, to eller flere kopier av clpP er funnet i actinobacteria og cyanobacteria og minst en funksjonell kopi er avgjørende for levedyktighet.37, 38 I Mycobacterium tuberculosis, clpP1 og clpP2 danne en operon og både gener er viktig. Disse isoforms arbeide sammen for å skape en funksjonell protease ved stabling ClpP1 og ClpP2 homoheptamers inn i en heterotetradecamer.37, 39 Av de fire AAA+ ATPases i M. tuberculosis, ClpX og ClpC1 er avgjørende for levedyktighet.,40, 41

Gitt sin rolle i celleviabilitet og virulence, den ClpP system er en lovende mål for romanen antibakterielle midler med tre mulige mekanismer for dereguleringen (Figur 2): hemming av ClpP protolyse, aktivering av ClpP protolyse eller uro av partner AAA+ ATPases.

ClpP hemmere

Kanskje den mest åpenbare tilnærming til målrettet ClpP systemet er å utvikle en aktiv nettstedet inhibitor av ClpP. Bevis på prinsippet om denne modusen for handling har blitt vist i S. aureus, Streptococcus pneumoniae og L., monocytogenes, hvor clpP knockouts er i stand til å forårsake hud infeksjon abscesser, lunge infeksjoner eller in vivo macrophage parasitism, henholdsvis.22, 42, 43 Dette tap av virulence har vært forbundet med redusert aktivitet av ekstracellulære proteases, lipases, DNases og α-hemolysin i S. aureus, og α-listerolysin og listerial fosfolipase i L. monocytogenes.

Den banebrytende innsats av Böttcher og Sieber44 å målrette ClpP førte til utviklingen av en serie av β-lakton-hemmere., Inspirert av reaktivitet av β-lactones som finnes i naturen, de syntetiserte et bibliotek av alkyn-merket derivater (for eksempel Lakton D3; Figur 3a), som ble vist mot flere bakterielle proteomes. Klikk kjemi på alkyn tag ble brukt til å feste en separeres fluoroforen og mulighet for identifisering av reaktiv enzymer. På denne måten, ClpP ble identifisert som en svært spesifikke målet som danner en covalent addukt mellom sin aktive nettstedet Ser98 og β-lakton, og dermed irreversibelt hemme proteolytiske aktivitet (Figur 3b).,44 Påfølgende karakterisering demonstrert evne til β-lactones å redusere virulence faktor aktivitet, inkludert α-hemolysin og listerolysin, i S. aureus og L. Monocytogenes, henholdsvis.45, 46 Denne reduksjonen i virulence faktorer som er korrelert med evne til optimalisert β-lakton stillaser (U1; Figur 3a) for å redusere S. aureus infeksjon etter subkutan administrasjon i en svulst hud modell og L. monocytogenes vekst i makrofager.46, 47 Videre, β-lakton derivater (sammensatt 7; Figur 3a) ble funnet å være blant de privilegerte gruppen av forbindelser i stand til å angi M., tuberkulose for å effektivt hemme vekst med en MIC på 28 µg ml−1.48 Slutt, men lave plasma stabilitet på grunn av rask hydrolyse av syklisk ester er til hinder for videre klinisk utvikling.

Mer nylig, Sieber og colleagues49 har oppdaget en ny klasse av potente ClpP-hemmere, den fenyl estere (AV170; Figur 3a). Oppdaget ved hjelp av en upartisk skjermen på 137 000 syntetiske forbindelser i en fluorogenic analysen for ClpP aktivitet, fenyl estere handling av samme covalent endring av Ser98 som β-lactones., Det er interessant at noen enantiomers er også i stand til å utløse deoligomerization av ClpP tetradecamer inn heptamers, en gunstig modusen for handling gitt at conformational kontroll av serin katalytisk triade gir det inaktiv i ClpP er heptameric form. Til tross for den fenyl estere’ bedre potens av protease hemming over β-lactones, deres anti-virulence aktivitet er redusert, så de er bare i stand til å redusere og ikke avskaffe α-hemolysin produksjon (Figur 3c). Tiltak for å øke styrken åpenbart en trade-off mellom stabilitet og reaktivitet.,49

Selv om ClpP hemming viser løftet som en mekanisme for tiltak, videre utvikling og oppdagelse av nye rammeverk er klart nødvendig. Videre, gitt nyere dokumentasjon av resistens i visse clpP knockout stammer,34, 36 noen forsiktig ned denne banen kan være grunnlag for.

ClpP aktivatorene

Aktivering av ClpP protease-systemet er en spesielt spennende terapeutisk alternativ. Et kjennetegn på intracellulære proteases er streng regulering av aktivitet for å unngå av målet protein nedbrytning. I eukaryotes, dette er ofte utført av compartmentalization i organeller., I motsetning til bakterier har utviklet stramt regulatorisk protein komplekser til å styre protease aktivitet. Ved å aktivere proteolytiske aktivitet for å ukritisk bryter ned proteiner, et stoff som ville være i stand til å forårsake celledød ikke bare i de artene der ClpP er viktig, men også de hvor ClpP er unnværlig. Mutasjoner avskaffe ClpP er aktivitet, mens det teoretisk sett hen motstand, ville være dødelig i cellene hvor ClpP er viktig, og svekke virulence i cellene hvor ClpP er unnværlig., Til slutt, den enestående modusen for handling av aktivering snarere enn hemming av målet kan tillate at slikt medikament for å være effektiv mot sovende persister celler.

Serendipitous bevis på prinsippet om denne unike virkningsmekanisme ble rapportert med oppdagelsen av acyldepsipeptides (ADEPs; Figur 4a). ADEPs ble først beskrevet i et patent i 1985 som «A54556 komplekse,» en gruppe av åtte nært beslektede forbindelser produsert av Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP ble identifisert som ADEP er molekylære mål i 2005, da Brötz-Oesterhelt et al.,51 brukt omvendt genomics til en ADEP-resistente e.coli stamme til å identifisere motstand determinanten som en mutasjon i ClpP som gjør det inaktive. Dette funnet antyder at ADEPs aktivere ClpP, forårsaker upassende protein nedbrytning. Faktisk, in vitro studier som måler spalting av fluorogenic peptider og in vivo proteomic analyser bekreftet at ADEP-aktivert B. subtilis ClpP var i stand til å bryte ned proteiner uavhengig av AAA+ eller forskrift ATP hydrolyse.,51

Innblikk i denne tap av forskriften har vært gitt av krystallstrukturer av ADEP-aktivert ClpP fra E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis og Neisseria meningitidis (Figur 4b).52, 53, 54, 55 En ADEP molekyl som binder seg til hver monomer i ClpP tetradecamer i samme hydrofobe lomme som er brukt av AAA+ ATPases, og dermed hemmer deres interaksjon (Figur 4d).,52, 55, 56 Bindende etterligner ATPase er conformational kontroll av ClpP, inducing justering av serin katalytisk triaden og en stiv kropp rotasjon av ClpP monomere, fører utvide den aksiale pore fra 10-12 å 20 Å i E. coli.27, 52, 55 En avgrensning mekanismen er også gitt av N-terminal domener, som å flytte fra en ned, eller lukket konformasjon og opp, eller åpne konformasjon på ADEP bindende.,52, 55 ADEP aktivering tillater ikke stabilt kastet proteiner for å bli degradert, så de er fortsatt for stor til å gå inn ClpP er aksial lumen, men gjør det mulig ustabile proteiner og begynnende kjeder dukker opp fra ribosomet å bli degradert, spesielt hvis de kaste seg sakte.57 celledød er antatt å være et resultat av denne ukritiske nedbrytning, samt hemming av normal ClpP funksjon.

ADEPs er aktivt mot en rekke av Gram-positive bakterier, inkludert klinisk relevant meticillin-resistent S. aureus (MRSA), vancomycin-resistente enterokokker og penicillin-resistent S., pneumoniae, så vel som den Gram-negative bakterier N. meningitidis og Neisseria gonorrheae.51, 54 Semisynthetic ADEP derivater er effektiv mot Enterococcus faecalis, S. aureus og S. pneumoniae i mus og rotte modeller med aktivitet overlegen linezolid,51 og aktivitet mot MRSA i en murin periotinitis modellen er overlegen til vancomycin.58 Betydelig motstand mot ADEPs utvikle seg til en frekvens som er så høyt som 10-6 i disse bakteriearter ved mutasjoner avtagende funksjon av ClpP, som er ikke-essensielle., Likevel, ved hjelp av clpP mutanter’ redusert kondisjon som en fordel, kombinasjon terapi av ADEP og rifampicin har vist seg å fullstendig utrydde en vancomycin-resistente MRSA befolkningen in vitro.59

Enda mer lovende er evnen ADEPs å eliminere persister celler.59 Conlon et al.59 først beskrevet denne eiendommen når en ADEP effektivt drept både stasjonær fase S. aureus og persister S. aureus venstre etter ciprofloxacin behandling. Dette funnet har betydning for bruk av ADEPs mot latent tuberkulose, infeksjoner forårsaket av medikament-tolerant M. tuberculosis persisters., Til dags dato, aktivitet mot M. tuberculosis persisters ikke har blitt beskrevet, men ADEPs har vist seg å bremse veksten av M. tuberculosis, når kombinert med to efflux pumpe hemmere, reserpin og verapamil.39

Selv om ADEPs er lovende fører til narkotika-kandidater, for de har ugunstige farmakologiske egenskaper, inkludert dårlig vannløselighet, rask systemisk clearance og kjemisk ustabilitet.51, 60, Etter oppdagelsen av ADEPs’ modusen for handling, en forskningskarriere SAR-programmet ble lansert av Bayer AG for å utvikle en mer stabil og potent derivat av ADEP., Dette arbeidet resulterte i utvikling av ADEP4, en svært potent ADEP1 derivat med tre viktige endringer: Phe er erstattet av 3,5-difluorophenylalanine, som er tenkt å danne H obligasjoner med ClpP, den acyl polyene er erstattet av en α -, β-umettede hexenoyl halen for å forbedre stabilitet og N-MeAla er erstattet av pipecolate, noe som øker ADEP er stivhet.60 Aktivitet av ADEP4 ble ytterligere forbedret ved Carney et al.61 ved skifte Ser med Allo-Thr-og Pip med 4-MePip til ytterligere rigidify ADEP., Ved kvantifisering hydrogen-deuterium exchange priser ved hjelp av 1H NMR, rigidification av ADEP molekylet ble vist å styrke transannular H obligasjoner, og dermed redusere entropisk kostnadene ved binding til ClpP. Carney er ADEP avledede har 600-1200-brett større potens enn ADEP1 mot Gram-positive bakterier.61

til Tross for den økte styrken av disse ADEP derivater, har de fortsatt bare har begrenset aktivitet mot Gram-negative bakterier og er effektivt fjernet fra cellen ved aktiv efflux, spesielt i M. tuberculosis.,39, 62 Mange andre syntetisk kjemi innsats har utforsket motiver for å overvinne disse begrensningene, men de fleste har resultert i redusert aktivitet (Figur 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 Gitt den intime binding av ADEP i sin hydrofobe lomme, dette resultatet er kanskje forutsigbar og antyder at det å gjøre endringer på ADEP stillaset kan ha nådd et uføre.

To høy-ytelses-skjermer har blitt montert for å identifisere roman ClpP utløsere.65, 68, Både identifisert liten-molekylet utløsere av E., coli ClpP ved hjelp av en in vitro-analysen måler økning i fluorescens forårsaket av spalting av fluorescein–kasein, en modell substrat for ClpP. I den første, Leung et al.65 vist 60 000 narkotika-lignende syntetiske kjemikalier, identifisere fem forbindelser kalles ACP1–5 (Figur 4a). De mest aktive av disse forbindelsene var 10-20 ganger mindre potent enn ADEP1 ved aktivering ClpP og vises bare beskjedne antibakteriell aktivitet selv i nærvær av permeabilizing agenter. Lavey et al.,68 i stedet vist >20 450 sopp og bakteriell ekstrakter eller metabolitter og identifisert en enkelt ClpP aktivator, sclerotiamide (Figur 4a). Dette paraherquamide-relaterte indolinone var 73 ganger mindre potent enn ADEP1 ved aktivering EcClpP, og klarte ikke å hemme vekst av efflux mangelfull E. coli eller Pseudomonas aeruginosa.

til Tross for de begrensede efficacies av ACPs og sclerotiamide, disse studiene gir romanen rammeverk for derivatization og åpne døren til fremtidige studier for å identifisere ClpP utløsere., Man kunne forestille seg, for eksempel å identifisere alternative aktivering bindende områder på ClpP. ClpP er regulering innebærer ikke bare kontroll av substrat oppføring av pore utvidelse på AAA+ ATPase-foreningen, men også dannelsen av serin katalytisk nettstedet gjennom oligomerization inn tetradecamers.69 Kanskje et lite molekyl som indusert aktive nettstedet dannelse og samtidig opprettholde ClpP som en heptamer kan tillate for enkel tilgang til denne aktive området av vilkårlig underlag.,

AAA+ ATPase uncouplers som therapeutics

Som ClpP er avhengig av AAA+ ATPases å velge og utfolde protein underlag, uro av disse partnerne kan også deregulere det ClpP proteolytiske system. Spesielt, dette er sann i M. tuberculosis der ClpC1 og ClpX ATPases er avgjørende for celleviabilitet.40, 41 Faktisk, hver av de tre forbindelser målretting ClpC1 preget til dato ble oppdaget ved screening naturlig produkt ekstrakter for anti-M. tuberculosis-aktivitet., Den første av disse for å bli oppdaget er cyclomarin En (cymA), en syklisk heptapeptide produsert av marine bakterien Streptomyces sp. CNB-982 (Figur 5a).70 Selv om det var beskrevet i 1999 som en potent anti-inflammatorisk agent med cytotoksisitet mot kreft celler, det var ikke før i 2011 at det aktivitet mot M. tuberculosis ble oppdaget under et naturlig produkt hel-celle-skjermen.71 I et første forsøk på å identifisere cymA er molekylære mål, en omvendt genomics tilnærming ble tatt. Imidlertid, etter at det ikke spontan resistente M., tuberkulose mutanter kunne utvinnes, affinitet kromatografi ble i stedet brukt til å vise at cymA mål ClpC1 med høy spesifisitet. Påfølgende co-crystalization av cymA med ClpC1 ‘ s N-terminal domene identifisert rester viktig for binding og, til tross for den manglende evne til å generere spontan resistente mutanter, tillatt for etablering av ClpC1 mutanter overdragelse motstand mot cymA.72

I 2014, ecumicin, en macrocyclic tridecapeptide fra Nonomuraea sp., MJM5123,73 og lassomycin, en 16-husket lasso-peptid fra Lentzea kentuckyensis sp.,74 ble isolert både ved screening av råolje actinomycete ekstrakter (Figur 5a). N-terminal domene av ClpC1 ble identifisert som den molekylære mål for disse forbindelsene ved omvendt genomics på spontan resistente mutanter. Til tross for cymA, ecumicin og lassomycin deler et felles mål, strukturelle karakterisering og plasseringen av mutasjoner som gir resistens mot hver sammensatte foreslå at hvert bind i en litt annen posisjon på N-terminal domene av ClpC1 (Figur 5b)., For eksempel, i motsetning til cymA og ecumicin, lassomycin er svært grunnleggende, som inneholder flere Arg rester, og havna i en svært sure regionen ClpC1.74

CymA, ecumicin og lassomycin er alle bakteriedrepende mot å kopiere M. tuberculosis, en rekke andre mykobakterielle arter, og multidrug-resistant M. tuberculosis. Viktigere, de er også aktiv mot nonreplicating M. tuberculosis. I samsvar med mangel på essensielle av AAA+ ATPases, hver mangler aktivitet mot andre Gram-positive og Gram-negative arter som S. aureus og P. aeruginosa., Denne spesifisiteten har fordeler, som de også mangel aktivitet mot commensal medlemmer av den menneskelige microbiota.

for å forårsake celledød i M. tuberculosis, ecumicin og lassomycin synes å stimulere ATPase aktivitet, men koble det fra protein nedbrytning.73, 74 På denne måten, nedbrytning av naturlige underlag er hemmet og fører til deres oppbygging og toksisitet, tilsvarende handlinger av både ClpP-hemmere og utløsere i M. tuberculosis., I motsetning til ecumicin og lassomycin, cymA har blitt foreslått å øke protein nedbrytning, som demonstrert ved en nedgang i LeuAspAsp tripeptide-merket grønt fluorescerende protein fluorescens målrettet for å ClpC1 på inkubasjon med cymA.71 det er Imidlertid mulig at denne nedgangen i fluorescens er resultatet av grønt fluorescerende protein folder seg ut av ClpC1 snarere enn nedbrytning og cymA kan derfor ha samme uncoupling mekanisme som ecumicin og lassomycin., Flere spørsmål forbli ubesvart om virkningsmekanismen for disse stoffene, inklusive deres effekt på protein utfolder seg og hvordan ATPase-aktivitet er stimulert og protolyse hemmet, for eksempel ved å hemme samhandling med ClpP1P2. Videre karakterisering er fortsatt i gang for enda en ClpC1 inhibitor nylig oppdaget, rufomycin analog RUF-I. 75

til Tross for den relativt høye styrken av cymA, ecumicin og lassomycin mot M. tuberculosis, optimalisering av farmakologiske egenskaper er nødvendig., For eksempel, cymA utstillinger hepatisk clearance og en kort halveringstid i mus, og ecumicin har begrenset oppløselighet og dårlig intestinal absorpsjon.13, 73 Siste total synteser og gjæring optimalisering kan hjelpe i denne utviklingen.76, 77, 78

Selv om rusmidler målretting ClpC1 er en spennende mulighet for anti-M. tuberculosis therapeutics, de vanligvis ikke har bakteriedrepende aktivitet mot andre arter enn actinobacteria., I disse artene der ClpP og tilhørende AAA+ ATPases er unnværlig, det er mulig at målretting disse ATPases ville ha antivirulence effekter som ligner på de som er observert med ClpP-hemmere. Imidlertid, slike sammensatte ville sannsynligvis ha behov for å være i stand til å målrette flere ATPase-partnere for å ha så utbredt en effekt som direkte aksjon på ClpP. Disse potensielle antivirulence virkninger har ikke vært undersøkt for cymA, lassomycin eller ecumicin.,

å Oppnå spesifisitet

Av bakterielle proteolytiske komplekser, men alle HslUV har en menneskelig ortholog, og mange er faktisk intenst studert som mulige anticancer mål. For eksempel, mitokondrie proteases LONP1, ClpXP og m-AAA (FtsH homolog) har viktige roller i kvalitetskontroll i mitokondriene, spesielt i luftveiene stress.79 Mutasjoner i m-AAA er også innblandet i spastisk paraplegi, en arvelig nevrodegenerativ sykdom.80 Som sådan, er det viktig at antimikrobielle midler være i stand til å målrette sine bakteriell homolog spesielt.,

I tilfelle av proteasehemmere som mål å fungere som selvmord underlag, for å oppnå spesifisitet kan være utfordrende på grunn av bevart katalytisk mekanismer. Faktisk, en manglende spesifisitet har blitt møtt i arbeidet med å utvikle hemmere av både prokaryotic proteasome og bakteriell Lon protease. Den prokaryotic proteasome i M. tuberculosis gjør for en lovende mål for hemming, så det er unnværlig for vekst i vitro, men er avgjørende for overlevelse av nitrogenoksid stress81 og utholdenhet i mus.,62, 82 Mange forsøk har blitt gjort for å utvikle et medikament mot mykobakterielle proteasome, vanligvis som peptidyl epoxyketones, aldehyder eller boronates, men de fleste hemme hos pattedyr proteasome mer potently enn M. tuberculosis.83 Selektivitet er ikke enestående imidlertid, som vist ved oppdagelsen av oxathiazole-2-en-forbindelser GL5 og HT1171 (Figur 6). Disse forbindelsene er bakteriedrepende mot ikke-replikere M., tuberkulose behandles med subinhibitory nivåer av nitric oxide21 og har >1000-brett økt aktivitet mot mykobakterielle over menneskelige proteasomes. Spesifisitet er tenkt å være gitt ved interaksjon av stoffet med rester utenfor det aktive nettstedet ikke bevart i mammalske proteasomes.21

Lon gjør også for en lovende mål, som det har vært innblandet i dannelsen av biofilm, motilitet og stress toleranse, og mutanter har vist seg å ha redusert kolonisering og virulence i Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, kolera Vibrio og P. aeruginosa.84, 85, 86, 87 I den eneste forsøk på å date for å identifisere bakteriell Lon-hemmere, proteasome-hemmere ble vist in vitro og peptidyl boronate MG262 ble identifisert.,18 Men denne forbindelsen er fortsatt 2000 ganger mer potent mot 20-årene proteasome.18 Som med oxathiazole-2-en-forbindelser, og dra fordel av rester avvikende i menneskelig homologs er sannsynlig å være nødvendig for å utvikle en svært spesifikke Lon-hemmer.

Spesifisitet kan også oppnås ved å flytte utenfor katalytisk aktive området til bindende områder som perturb protease-funksjon, men er dårlig bevart mellom menneske og bakterier orthologs. ADEPs treffende demonstrere potensialet i denne tilnærmingen., Selv om de ikke har vært direkte testet på menneskelig ClpP (hClpP), ADEPs er ikke-giftig for humane celler opp til 25 µg ml−1, noe som tyder på at de har dårlig, om noen, affinitet for det menneskelige enzymet.58 Strukturelle sammenligning av E. coli (EcClpP) og hClpP støtter denne oppfatningen. Sin ryggrad struktur er i stor grad bevart, med en root mean squared avvik på 0.,63 Å;88 imidlertid inspeksjon av hydrofobe lomme brukes for ADEP bindende viser at hClpP har flere innbytter redusere sin hydrophobicity (Asn55Pro, His60Tyr og His112Phe) sammen med en kostnad inversjon (Glu56Lys) på den distale delen av docking-sporet. Det er fullt mulig at disse endringene vil hindre ADEP bindende i hClpP. Det bør imidlertid bemerkes at EcClpX, selv om det ikke EcClpA, kan du aktivere hClpP.88 I alle fall, og søk etter narkotika bindende mindre bevart regulatoriske områder kan være nøkkelen til å finne svært spesifikke antibakterielle midler.