materiais e métodos
ratinhos.
ratos do tipo selvagem C57BL / 6 foram obtidos do Charles River Laboratories (Wilmington, MA). A pde8a KO mice foi inicialmente produzida pela Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) sob contrato com a Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Reino Unido). Eles foram posteriormente criados para C57BL / 6 ratos na Universidade de Washington por 10 gerações. Para as experiências notificadas, foram utilizados ratinhos com idades compreendidas entre as 6 e as 8 semanas de idade., Todos os procedimentos utilizados foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) da Universidade de Washington, de acordo com o National Institutes of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
PCR em tempo Real.
Testis cDNA was prepared from total RNA from wild-type and PDE8A-null mouse testis by using SuperScript III and Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). A PCR em tempo Real foi realizada usando Power SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Os iniciadores (IDT, Coralville, IA) do PDE8A, direccionados para a área a jusante da cassete de alvo, foram os seguintes: primer dianteiro, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); primer reverso, ATGTCTCAGACTTTCTCAGG (exon 20). Os primários para a hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase foram os seguintes: primer avançado ATTATGCCGAGGATTTGAA; primer reverso, CCCATCTCTTCATGACATCT.hibridização In Situ.
o modelo para a síntese do riboprobe foi obtido pela PCR utilizando um plasmídeo contendo a sequência pde8a do rato., Em particular, a região de 3′ do rato PDE8A (exons 17-20) foi amplificada utilizando os seguintes iniciadores: primer para a frente, AATTAACCTCACTAAAGGGCGTATTTCTTCCAG (sequência sublinhada do promotor de ARN-polimerase do phage T3); primer reverso, TAATACGACTCACTATAGGGACGTCAGGCACTTAAT (sequência sublinhada do promotor de ARN-polimerase do phage T7). Os produtos PCR foram isolados de géis de agarose e purificados com um Kit de extracção de Gel (Qiagen, Valência, CA)., Os riboprobos marcados com 35S foram sintetizados por transcrição in vitro com um kit Maxiscript T3/T7 (Ambion, Austin, TX), utilizando como modelo o produto PCR contendo locais promotores de ARN polimerase T3 e T7 FAG. A transcrição in vitro foi realizada numa mistura de reacção de 20 µl contendo 5 µl de UTP (PerkinElmer, Boston, MA) e da polimerase de ARN T3 ou da polimerase de ARN T7 para obter o sentido ou riboprobe antissenso, respectivamente.
testículos foram dissecados de ratos do tipo selvagem e pde8a KO e foram rapidamente congelados em Tissue-Tek O. C. T. composto (Sakura, Torrence, CA) em gelo seco., Seções (20 µm) foram cortadas em um criostato, montado em um Superfrost mais microslide (VWR Scientific, West Chester, PA), e o ar seco. As secções foram fixadas em 4% de paraformaldeído durante 15 minutos à temperatura ambiente, tratadas com 0, 25% de anidrido acético em 0, 1 M de trietanolamina (pH 8, 0) durante 10 minutos e desidratadas através de uma série de etanol Classificado (30, 60, 80, 95 e 100%). As secções foram então incubadas com tampão de hibridação numa câmara húmida a 60°C durante 4 H. após lavagem em 2× SSC (citrato salino padrão; 1× SSC = 0,15 M de cloreto de sódio/0,015 M de citrato de sódio, pH 7. ,2), as seções foram desidratadas através de uma série de etanol Classificado. A hibridação foi realizada em tampões contendo 35S de antissenso ou sonda sensorial (40 pg / 34,000-38,000 cpm por µl) sob tampas de plástico em uma câmara úmida a 60°C durante a noite. As tampas foram cuidadosamente removidas, e as secções foram lavadas com 2× SSC contendo 10 mM DTT durante 30 minutos duas vezes a 60°C. as secções foram incubadas durante 30 minutos a 37°C com 20 µg/ml de RNaseA em 0,5 m NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,Por fim, as secções foram desidratadas em etanol (70, 95 e 100%), secas ao ar e expostas em película BioMax XAR (Eastman Kodak, Rochester, NY) durante 9 H. para ver a distribuição celular de PDE8A hibridização mRNA, as lâminas foram revestidas com autoradiografia NTB emulsão (Eastman Kodak) e expostas durante 1 semana a 4°C., Os diapositivos foram desenvolvidos, fixos e contrastados com hematoxilina e montados no Canadá Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A Immunoprecipitation and Assay.
Mouse espermatozóides foram isoladas a partir da cauda epidídimo por um mergulho método de (38) e homogeneizado em PBS contendo 1% de Nonidet (Roche applied Science, Indianápolis, IN), EGTA 1 mM, 20 mM de DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM de para-amino benzamidine, e Sigma inibidor da protease mistura (Sigma-Aldrich)., O homogeneizado foi centrifugado durante 5 minutos a 16 000 × g num microcentrifugador e 200 µl de alíquotas do sobrenadante, equivalentes a 106 espermatozóides, foram incubados durante a noite com 20 µl de um chorume de 1: 1 de esferas de proteína G-agarose (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) na presença ou ausência de anticorpos PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). No dia seguinte, o immunoprecipitato foi lavado três vezes com PBS e, em seguida, avaliado para a actividade PDE na presença de substrato do campo de 10 nM, esfregões de 40 mM (pH 7, 5), 15 mM Mg-Acetato, 2 mM EGTA e 0,2 mg/ml BSA como na ref. 39.,Imunohistotoquímica.
os testículos de rato recentemente congelados foram incorporados no composto Tissue-Tek O. C. T. e, em seguida, seccionados em um criostato a 20 µm por fatia. As secções tecidulares ou as células Leydig isoladas foram secas e fixadas em 4% (wt/vol) de paraformaldeído/PBS (pH 7.4) à temperatura ambiente durante 10 minutos e lavadas três vezes com PBS. As lâminas foram pré-entubadas com tampão de bloqueio (5% de soro do burro, 1 mg/ml de ASC e 0.,1% Triton X-100 em PBS) por 1 h à temperatura ambiente, incubadas com anti-PDE8A de anticorpos (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) em PBS contendo 1% de burro soro, 1 mg/ml de BSA e de 0,1% Triton X-100 durante a noite a 4°C, lavadas em PBS contendo 0,05% de Tween 20, três vezes por 20 min, incubadas com o burro anti-cabra Alexa546 (200 µl 1:500; Invitrogen) em PBS contendo 1 mg/ml de BSA e 0,1% de Triton X-100 por 2 h na temperatura de quarto e de lavandaria., As lâminas foram ainda incubadas com tampão de bloqueio contendo 5% de soro de cabra durante 1 h à temperatura ambiente, incubadas com anticorpo da enzima de clivagem da cadeia lateral do citocromo P450 (CYP11A) (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) durante a noite, a 4 ° C, lavada em PBS contendo 0,05% de Tween 20 três vezes durante 20 minutos, e incubada com Alexa488 (1:500; Invitrogénio), como acima descrito. As seções foram finalmente contrastadas com TO-PRO-3 (1: 1000; Invitrogen) em PBS por 5 minutos, lavadas, e montadas em reagente antifade de Ouro Lento (Invitrogen)., Para testar a especificidade de anticorpos PDE8A, a solução de anticorpos foi pré-incubada com 2, 5 µg/ml de peptídeo antigénio (biotecnologia de Santa Cruz) durante 2 h à temperatura ambiente antes da coloração. Algumas secções foram incubadas sem os anticorpos primários para determinar o fundo devido aos anticorpos secundários. Os sinais imunodontantes foram visualizados com um microscópio confocal (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). a actividade da β-galactosidase, expressa com um sinal de localização nuclear pelo gene LacZ na cassete de alvos, foi avaliada pela coloração da X-gal., As secções foram incubadas pela primeira vez com anticorpo anti-CYP11A seguido de conjugado fosfatase alcalina anti-coelho (1:500; Invitrogen) e NBT/BCIP (Roche) para o desenvolvimento de cores. A coloração X-gal foi então realizada como descrito (40) na mistura X-gal a 37°C durante a noite. As secções foram lavadas e montadas com glicerol / solução salina tamponada.purificação de células de Leydig.as células de Leydig foram isoladas como descrito na ref. 41. Resumidamente, os testículos de ratinhos adultos foram descapsulados e dispersados num banho de água agitante a 34°C durante 10 minutos em 10 ml de meio 199 (M-199) com 0.,Colagenase D 25 mg/ml, 35 mU/ml Dispase II e 6 µg/ml DNase I. para terminar a dispersão tecidular, foram adicionados 40 ml de 1% BSA em M-199 meios contendo 15 mm de Hepes, 4 mM de bicarbonato de sódio e 25 µg / ml de inibidor da tripsina de soja para diluir a suspensão original. Os tubos foram então tapados e invertidos várias vezes. Foi permitido que os túbulos seminíferos assentassem por gravidade, e o sobrenadante contendo as células intersticiais foi recolhido. O procedimento foi repetido duas vezes para Colher mais células intersticiais., As células foram granuladas em tubos de 50 ml por centrifugação a 800 × g durante 20 minutos a 4°C e depois fraccionadas utilizando um gradiente contínuo de Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) (55% Percoll em HBSS tamponado com 15 mm Hepes e 25 µg/ml de inibidor da tripsina de soja) num volume total de 35 ml. Os gradientes foram formados in situ por centrifugação em um rotor de ângulo fixo JA-20 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) a 23.700 × g por 30 minutos a 4°C. Um tubo contendo contas marcadores de densidade (GE Healthcare) foi usado como referência para identificar as diferentes camadas de densidade., As células de Leydig foram recuperadas com uma densidade de 1, 07 g / ml até ao fundo do gradiente. Cinco volumes de HBSS foram adicionados para diluir o Percoll, e as células foram peletizadas a 200 x g por 10 min a 4°C. O final do pellet obtido a partir de dois testículos enriquecidos em células de Leydig, foi em suspensão em 4 ml de meio DMEM/F-12 suplementado com 1% de BSA e imediatamente utilizados para os experimentos.