DNA 시퀀싱을위한 대체 전략은 여러 범주로 그룹화 할 수 있습니다(이전에 ref. 4). 을 포함한(i)microelectrophoretic methods9(자 1),(ii)시퀀싱여 hybridization10(2),(iii)실시간 관찰 단일 molecules11,12(3),(iv)주기적인 배열 시퀀싱(J.S.et al.13 및 심판. 14)., 여기에서,우리가 사용하는’두 번째 세대에서 참조하는 다양한 구현에서의 주기적인 배열 순서 최근에는 상업적인 제품(예를들면,454 시퀀싱(에서 사용 454 게놈 시퀀서,로슈에 적용학전공,바젤),Solexa 기술(에서 사용 Illumina(샌디에이고)게놈 분석기),단단한 플랫폼(Applied Biosystems;Foster City,CA,미국),이 Polonator(도버/하버드)및 HeliScope 하나의 분자 시퀀 기술(Helicos;Cambridge,MA, 국)., 의 개념을 주기적인 배열 시퀀싱으로 요약할 수 있습니다 시퀀싱의 치밀한 배열의 DNA 기능에 의해 반복적인 사이클의 효소 조작 및 이미징 기반의 데이터 collection15(Shendure 및 colleagues16). 2005 년의 두 보고서는 기존의 시퀀싱(J.S.et al.13 및 심판. 14),그리고 다른 그룹은 빠르게 따라 갔다.17,18.,
지만 이러한 플랫폼은 매우 다양에서는 시퀀싱 생화학뿐만 아니라 어떻게 배열 생성되는,자신의 작업 흐름은 비슷한 개념(Fig. 1b). 라이브러리 준비는 DNA 의 무작위 단편화에 의해 이루어지며,이어서 일반적인 어댑터 서열의 시험 관내 결찰이 이루어진다. 대체 프로토콜은 제어 가능한 거리 분배를 가진 메이트 쌍 태그의 점프 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있습니다 13,19., 시퀀싱 피쳐 역할을하는 clonally clustered amplicons 의 생성은 in situ polonies15,emulsion PCR20 또는 bridge PCR21,22(Fig. 2). 어떤 것은 일반적인 이러한 방법은 PCR amplicons 의 에서 파생 주어진 단 하나 라이브러리 분자가 결국 공간적으로 클러스터 중 하나,단 하나 위치에서 평면 기판(현장에서 polonies,다 PCR),또는 표면의 미크론규모 비즈 될 수 있는 복구와 배열(에멀젼 PCR)., 시퀀스 프로세스 자체로 구성되어 있의 교류 사이클의 효소 기반 생화학과 영상-기반 데이터 수집니다(그림. 3). 는 플랫폼는 여기에 설명되어 있습니다 모두에 의존 시퀀싱에 의해 합성은,일련의 연장 끝났다 템플릿지만,효소의 운전을 합성할 수도 있습니다 polymerase16,23 나 ligase13,24. 데이터 획득에 의해 영상의 전체 배열에서 각각의 사이클(예를 들어,의 놓여있는지 표시된 뉴클레오티드에 의해 통합되는 효소).
(a)454,the Polonator 및 솔리드 플랫폼에 의존 에멀젼 PCR20 증폭 클론 시퀀싱 기능입니다. 에 대한 간략한,시험관에서–건설 어댑터 형벌 산탄총 라이브러리(로 표시된 금고 청록색 어댑터 독특한 측면에 삽입)는 PCR 증폭(즉,multi-템플릿 PCR,지 않은 multiplex PCR 으로,단지 하나의 프라이머 쌍을 사용하여,해당하는 금색과 청록색 어댑터)의 컨텍스트에서 물에서 기름 유화액입니다., PCR 프라이머 중 하나는 반응에도 포함 된 미크론 스케일 비드의 표면(5’부착)에 닿아 있습니다. 템플릿 농도가 낮 으면 대부분의 비드-함유 구획이 제로 또는 하나의 템플릿 분자 중 하나가 존재하게됩니다. 생산적인 에멀젼 구획(비드 및 템플릿 분자가 모두 존재하는 곳)에서,pcr 앰플리콘은 비드의 표면에 포획된다. 에멀젼을 끊은 후에,증폭 제품을 품는 구슬은 선택적으로 농축될 수 있습니다., 각 clonally 증폭 비드는 템플릿 라이브러리에서 단일 분자의 증폭에 해당하는 표면 PCR 제품에 부담합니다. (b)Solexa 기술은 클론 시퀀싱 기능을 증폭시키기 위해 브리지 PCR21,22(일명’클러스터 PCR’)에 의존합니다. 에 대한 간략한,시험관에서–건설 어댑터 형벌 산탄총 라이브러리 PCR 증폭,하지만 모두 프라이머는 인구 밀도가 코트의 표면은 고체 기판에 부착되어 자신의 5’끝에 의해 유연한 linker., 결과적으로 증폭 제품에서 발생하는 모든 주어진 구성원의 템플릿 라이브러리에서 남아 있는 로컬에 닿는 지점 근처의 기원합니다. PCR 의 결론에서,각 클론 클러스터는 템플릿 라이브러리의 단일 멤버의∼1,000 사본을 포함한다. 템플릿 라이브러리의 농도를 정확하게 측정하는 것은 과밀을 동시에 피하면서 클러스터 밀도를 최대화하는 데 중요합니다.
(a)로 454 플랫폼,clonally 증폭 28-μm 구슬을 생성하여 에멀젼 PCR 으로 봉사 시퀀싱 기능 및 무작위 증착 하 여 편의 picoliter 규모다. 와 pyrosequencing,각각의 사이클로 구성되어 있는 소개의 단일 염기 종에 의해 다음,이외의 기판(놀랐던 아데노신 5′-phosphosulphate)드라이브 가벼운 생산에 우물은 효소 기반의 설립된 뉴클레오티드이 일어났다., 이어서,결합되지 않은 뉴클레오타이드를 제거하기 위해 아피라제 세척이 뒤 따른다. Margulies 등의 이미지. (2005)14. (b)Solexa 기술을 사용하면 브리지 PCR(일명 클러스터 PCR)에 의해 표면에 직접 clonally amplified sequencing features 의 조밀 한 배열이 생성됩니다. 각 시퀀싱 사이클을 포함한 동시한 혼합물의 네 개의 수정 deoxynucleotide 종,각 베어링의 중 네 형광 레이블 및 역을 종료 moiety3’hydroxyl 위치입니다. 변형 된 DNA 중합 효소는 프라이밍 된 시퀀싱 기능의 동기 확장을 유도합니다., 이어서 4 개의 채널에서의 이미징 및 형광 라벨 및 종단 모이어 티 모두의 분열이 뒤 따른다. (c)고체 및 Polonator 플랫폼을 사용하여 clonally 증폭 된 1-μm 비드를 사용하여 무질서하고 밀도가 높은 시퀀싱 기능 배열을 생성합니다 13. 시퀀싱은 중합체가 아닌 리가 아제로 수행됩니다 13,24,26,27,28. 고체로,각 시퀀싱주기는 형광 표지 된 옥타 머의 부분적으로 퇴화 된 개체군을 도입한다., 인구 구성되는 상표와 상관 관계가 정체성의 중앙 2bp 에 octamer(상관관계와 2bp,1bp,의 기초 두 개의 기본 인코딩)26. 후에 결과 이미지에 네 개의 채널에 표시된 부분의 octamer(즉,’zzz’)은 쪼개지를 통해 변경 사이의 연계를 기초 5 6 를 떠나,자유단에 대한 다른 사이클의 결찰. 이러한 여러 사이클은 균등하게 간격을두고 불일치 한 염기 세트를 반복해서 심문 할 것입니다., 이 시스템은 다시 설정하여(변성 확장 프라이머),및 프로세스가 반복되는 다른 오프셋(예를 들어,프라이머 설정에서 다시 원래의 위치에 의해 하나 또는 여러 가지 기초)같은 다른 설정의 연속 하지 않는 기초가 심문에서의 다음 라운드 직렬 ligations. (d)헬리 스코프 플랫폼을 사용하면 단일 핵산 분자가 직접 시퀀싱되며,즉 클론 증폭 단계가 필요하지 않습니다., 폴리는 꼬리 템플릿을 분자가에 의해 캡처 된 교 잡 표면 닿는 폴리-티 올리고 열매를 산출하기 위하여 무질서의 배열이 끝났다 하나의 분자 시퀀싱 템플릿이 있습니다. 템플릿은 이미징이 시퀀싱 읽기가 예상되는 배열 좌표의 하위 집합을 식별 할 수 있도록 Cy3 로 레이블이 지정됩니다. 각각의 사이클로 구성되어 있는 효소 기반의 설립 단일 종의 놓여있는지 표시된 뉴클레오티드의 하위 집합 템플릿에 의해 다음,형광 영상의 전체 배열 및 화학 분열의 레이블이 있습니다. Braslavsky 등의 이미지. (2003)30.,
글로벌 장점의 두 번째 세대 또는 주기적인 배열 전략에 상대적인 생어 시퀀싱는 다음이 포함되어 있습니다:(i)생체외의 건설을 시퀀싱 라이브러리에 의해 다음,체외 클론 확대를 생성하는 시퀀싱 기능을 우회 여러 가지 병목 현상을 제한하는 병렬화는 기존의 시퀀싱(즉,변환기의 대장균 및 식민지 따). (ii)어레이 기반 시퀀싱은 기존의 모세관 기반 시퀀싱보다 훨씬 높은 수준의 병렬 처리를 가능하게합니다., 으로 효과적인 크기의 시퀀싱 기능을 할 수 있습의 순서에 1µm,의 수백만의 수백을 시퀀싱 읽을 수 있는 잠재적으로 얻어진 병렬로 rastered 이미징의 합리적인 크기의 표면적이 있습니다. (iii)어레이 피쳐는 평면 표면에 고정되어 있기 때문에 단일 시약 부피에 의해 효소 적으로 조작 될 수 있습니다. 지만 마이크로리터 규모의약에 사용되는 볼륨이에서 실제로 이러한 본질적으로 상각을 통해 전체 시퀀싱 기능을 배열에 반납 효과적인 시약 양당 기능을의 규모 picoliters 또는 femtoliters., 총체적으로,이러한 차이는 DNA 서열 생산을위한 극적으로 낮은 비용으로 번역됩니다.
2 세대 DNA 시퀀싱의 장점은 현재 몇 가지 단점으로 상쇄됩니다. 가장 눈에 띄는 이들을 포함 읽 길이(을 위해 모든 신규 플랫폼을 읽고,길이는 현재보다 훨씬 짧은 기존 시퀀싱)및 원료 정확도(평균 기본화에 의해 생성된 새로운 플랫폼은 적어도 배나 더 적은 정확한 보다는 기본 호출에 의해 생성된 생어 시퀀싱)., 하지만 이러한 제한을 만들 중요한 알고리즘 문제에 대한 즉각적인 미래,우리는이 있다는 것을 명심해야한다 이러한 기술이 계속 개선하는 대하여 이러한 매개 변수는,많은 기존 시퀀싱을 진행하고 점진적으로 세 가지 수십 년에 도달하는 그것의 현재 수준의 기술적 성능이다.
454pyrosequencing. 454 시스템은 상업용 제품으로 사용할 수있는 최초의 차세대 시퀀싱 플랫폼이었습니다 14. 이 접근법에서,라이브러리는 짧은,어댑터 측면 조각의 혼합물을 야기하는 임의의 방법에 의해 구성 될 수있다., 클론 시퀀싱 특징은 에멀젼 PCR20 에 의해 생성되며,amplicons 는 28-μm 비드의 표면에 포획됩니다(그림 2). 2a). 을 파괴 한 후,에멀젼 비즈 취급으로 변성제 제거하고 생산적인 기능을 제공 가닥,다음 교 잡 기반 농축한 amplicon-비즈베어링(즉,그에 존재하는 에멀젼 구획을 지원하는 생산적 PCR 반응). 는 시퀀싱 프라이머를 복합화를 보편적인 어댑터에서 적절한 위치와 방향,즉,바로 인접해의 시작을 알 수 없다.,
시퀀싱은 pyrosequencing method25(Fig. 3a). 에 대한 간략한,amplicon 베어링 구슬 preincubated 와 균 stearothermophilus(Bst)효소 및 단일 가닥인 단백질 및 다음에 입금을 하 여 편의 picoliter 규모의 우물을(크기와는 단 하나의 구슬 맞는 것입니다에 따라)를 렌더링이 생화학와 호환되는 array 기반 시퀀싱. 더 작은 구슬은 또한 pyrosequencing(ATP sulfurylase 와 luciferase)를 위해 또한 요구된 고정화 효소를 품는 추가됩니다., 는 동안 시퀀싱,하나의 측면을 반 배열 순서를 기능을하는 유동 세포에 대한 소개와 제거 시퀀싱 시약,반면 다른 측면은 접합된 광섬유한 번들 CCD(charge-coupled device)기반 신호를 감지합니다. 수백 사이클의 각각에서,단일 종의 라벨이없는 뉴클레오타이드가 도입된다. 이것이 법인 사건 귀착되는 템플렛에,피로 인산염은 풀어 놓인다., 을 통해 ATP sulfurylase 및 루시페라아제,법인 이벤트는 바로 드라이브의 세대의 버스트는 빛에 의해 감지 CCD 로에 해당하는 배열의 좌표를 특정하였습니다. 과는 대조적으로 다른 플랫폼에 따라서 시퀀싱 합성에 의해 모니터링되어야 합니다’라이브(즉,카메라 움직이지 않는 상대적 배열). 여러주기에 걸쳐(예:A-G-C-T-A-G-C-T…),검출 된 통합 이벤트의 패턴은 개별 비드로 표현 된 템플릿의 순서를 보여준다., 다음과 같은 HeliScope(아래에 설명),시퀀싱은’비동기식’에서는 일부 기능은 얻을 수 있습니다 앞 또는 뒤에는 다른 특징에 따라 자신의 순서 순서를 기준으로 기초의 추가 있습니다.
454 기술의 주요 한계는 호모 폴리머(즉,AAA 또는 GGG 와 같은 동일한베이스의 연속적인 인스턴스)와 관련이 있습니다. 이 없기 때문에 종료 moiety 방지 여러 개의 연속된 바에서 지정된 주기에,길이의 모든 homopolymers 야에서 유추한 신호의 강도입니다., 이는 법인 설립 대 비협조주의의 차별보다 더 큰 오류율이 발생하기 쉽습니다. 결과적으로 454 플랫폼에 대한 지배적 인 오류 유형은 대체가 아닌 삽입-삭제입니다. 다른 차세대 플랫폼에 비해 454 플랫폼의 주요 이점은 읽기 길이입니다. 예를 들어,454FLX 계측기는 200~300bp 의 길이로 계측기 실행 당∼400,000 개의 읽기를 생성합니다. 현재 454 플랫폼으로 시퀀싱하는 기본 당 비용은 다른 플랫폼보다 훨씬 큽니다(예:,,고체 및 Solexa)그러나 긴 판독 길이가 중요한 특정 응용(예:de novo 어셈블리 및 메타 게 노믹스)에 대한 선택 방법 일 수 있습니다.
일루미나 게놈 분석기. 일반적으로’the Solexa’이 플랫폼에 그 기원을 가지고 작업하여 Turcatti 및 colleages22,23 및 합병의 네 회사—Solexa(Essex,UK),Lynx 치료제(헤이워드,CA,미국),Manteia 예측의학(Coinsins,스위스)및 Illumina., 라이브러리를 구성할 수 있음을 알 수 있습니다 어떤 방법을 초래하는 혼합물의 접합기-측면 조각을 기초 쌍(bp)길이. 증폭 된 시퀀싱 피쳐는 브리지 PCR21,22 에 의해 생성된다(그림 2). 2b). 이 방식에서는,양방향 및 역방향 PCR 프라이머는 닿는 곳에 단단한 기질에 의해 유연한 링커는,이러한 모든 amplicons 의에서 발생하는 모든 단일 템플릿을 분자 동안 증폭 남아 움직이지 못하고 클러스터링을 하나의 물리적 위치에 배열입니다., Illumina 플랫폼에서,브리지 PCR 은 bst 중합 효소와의 연장 및 포름 아미드와의 변성의 교번 사이클에 의존하는 데 다소 비 전통적이다. 결과적인’클러스터’는 각각∼1,000 클론 앰플리콘으로 구성됩니다. 만 여러 클러스터의 증폭될 수 있습하여 구별한 위치에서 각각의 여덟 독립적인’레인’에 있는 하나의 흐름에 셀(같은 여덟 독립적인 라이브러리할 수 있습 시퀀싱을 병행하는 동안 동일한 기기의 실행)., 후에 클러스터 세대,amplicons 의 단일 가닥(선형화)와 시퀀싱 프라이머를 복합화를 보편적인 시퀀스 측면에 관심이 있을 경우도 있습니다. 각 주기의 순서 심문의 구성은 단일 베이스 확장을 함께 수정 DNA 중합효소 연 혼합물의 네 뉴클레오티드(그림. 3b). 이들 뉴클레오타이드는 두 가지 방법으로 변형된다., 그들은’뒤집을 수 있는 터미네이터’,에서는 화학 분해성 잔 3’hydroxyl 치는 단 하나의 기본 법인에서 발생하는 각 주기에 하나의 네 형광 레이블,또한 화학적으로 분해성,해당 id 를 각각의 nucleotide23. 4 개의 채널에서 단일 염기 확장 및 이미지 획득 후,두 그룹의 화학적 분열이 다음 사이클을 위해 설정됩니다. 36bp 까지의 읽기 길이는 현재 일상적인;더 긴 읽기는 가능하지만 더 높은 오류율이 발생할 수 있습니다.,
읽 길이가 제한되여 여러 일으키는 원인이 되는 요인 신호가 부패하고 dephasing 같은 불완전한 협곡의 형광 레이블 또는 종료 moieties. 지배적인 오류 입력은 대체보다는 삽입 또는 삭제(및 homopolymers 는 확실히 문제보다는 다른 플랫폼과 같은 454). 평균 원시 오류가 요금 주문서에서 1-1.5%지만,더 높은 정확도 기지와 함께 오류가 요금의 0.1%이를 통해 확인할 수 있습니다 품질 측정과 관련된 각 기본 호출합니다., 로 다른 시스템과,수정에는 최근에 활성화되 친구 짝을 읽는다;예를 들어,각 시퀀싱 기능을 산출 2×36bp 독립적인 읽기에서 파생된 각 끝에 지정된 라이브러리 분자 몇 백 명의 기지에 길이 있습니다.
Ab 고체. 이 플랫폼은 2005 년 J.S. 및 colleagues13 에 의해 기술 된 시스템과 Agencourt Personal Genomics(BEVERLY,MA,USA)의 McKernan 및 colleagues26 의 작업에 기원을두고 있습니다(2006 년 Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)에 인수 됨)., 라이브러리 생성될 수 있는 어떤 방법으로는 상승하는 혼합물의 단,어댑터 형벌 조각,하지만 많은 노력으로 이 시스템에 넣어왔 프로토콜을 위한 친구 짝 태그 라이브러리를 제어할 수 있는 유연성이 높은 거리 distributions13,19. 클론 시퀀싱 특징은 앰플리콘이 1-μm 상자성 비드 20 의 표면에 포획 된 에멀젼 PCR 에 의해 생성된다(그림 2). 2a). 을 파괴 한 후,에멀젼 비즈베어링을 증폭 제품 선택적으로 복구,그리고 다음을 움직이지를 단단한 평판을 생성하는 조밀 한,무서 배열입니다., 합성에 의한 시퀀싱은 중합 효소가 아닌 DNA ligase13,24,26,27,28 에 의해 구동됩니다. 어댑터 서열에 상보적인 범용 프라이머는 앰플리콘-베어링 비드의 어레이에 혼성화된다. 시퀀싱의 각주기는 형광 표지 된 옥타 머의 퇴화 된 집단의 결찰을 포함한다(도 1). 3 기음). 이 octamer 혼합물의 구조에서의 정체는 특정 위치를(s)에 octamer(예를 들어,기본 5)관련의 정체성 형광 레이블이 있습니다., 결찰 후,이미지 획득에서 네 개의 채널을 효과적으로 데이터를 수집에 대한 동일한 기준에 걸쳐 위치를 모든 템플릿 베어링 구슬로 장식합니다. 그런 다음 옥타머를 화학적으로 위치 5 와 6 사이에서 절단하여 형광 라벨을 제거합니다. 옥타머 결찰의 프로그레시브 라운드는 매 5 번째 염기(예:염기 5,10,15,20)의 시퀀싱을 가능하게합니다. 이러한 사이클을 여러 번 완료하면 확장 된 프라이머가 변성되어 시스템을 재설정합니다. 이 프로세스의 후속 반복은 다른 위치 집합(예:,,기초 4,9,14,19)로 하나를 사용하여 프라이머는 다시 설정 하나 이상의 기초에서 어댑터 삽입 junction,사용하거나 다른 혼합물의 octamers 다른 위치를(예를 들면,기초 2)과 상호 연관된 레이블이 있습니다. 추가 기능의 이 플랫폼의 사용을 포함한 두 개의 기본 인코딩는 오류를 교정 계획에 인접한 두 개의 기지를 보다는 오히려,하나의 기초와 상관 label26., 각 기본 위치는 그 쿼리에 두 번(일단으로 첫 번째 기본,한 번 두 번째로 기지에서 설정 2bp 심문에 사이클)는 miscalls 수 있습니다 더 쉽게 식별됩니다.
SOLiD 와 관련된 시스템은 Polonator 이며,또한 J.S. 와 Harvard 의 Church group13 이 개발 한 시스템에 부분적으로 기반을두고 있습니다. 이 플랫폼은 또한 에멀젼 PCR 에 의해 생성 된 시퀀싱 기능과 결찰에 의한 시퀀싱을 사용합니다. 그러나 계측기의 비용은 다른 2 세대 시퀀싱 계측기보다 실질적으로 낮습니다., 또한이 장비는 오픈 소스이며 프로그래밍 가능하여 잠재적으로 사용자 혁신(예:대체 생화학 자 사용)을 가능하게합니다. 그러나 현재 읽기 길이는 크게 제한 될 수 있습니다.
454,SOLiD 및 Polonator 에 공통적 인 추가적인 단점은 에멀젼 PCR 이 번거롭고 기술적으로 어려울 수 있다는 것입니다., 다른 한편으로,그것은 시퀀스에서 높은-밀도의 배열을 매우 작은(1μm)구슬(시퀀싱에 의해 결찰,효소는 확장,또는 다른 생화학)을 나타낼 수 있습니다면 가장 간단하는 기회를 달성하는 매우 밀도 높은 데이터,기 때문에 단순히 1-μm 비즈 육체적으로 중 하나를 제외에 다른 간격을 두는 주문서에의 회절한 제한. 또한,고해상도의 순서 1-μm 구슬 배열로,최근에 described29,할 수 있도록 제한 하나의 픽셀당 시퀀싱 기능을 밀접하게 접근했다.피>헬리 스코프., Quake 의 group30 에 의한 작업을 기반으로 한 Helicos sequencer18 은 또한 고밀도 시퀀싱 기능 배열의 순환 심문에 의존합니다. 그러나이 플랫폼의 독특한 측면은 클론 증폭이 필요하지 않다는 것입니다. 대신,매우 민감한 형광 검출 시스템은 합성에 의한 시퀀싱을 통해 단일 DNA 분자를 직접 심문하는 데 사용됩니다., 템플릿 라이브러리,준비하여 임의의 단편화와 많은 찌끼(즉,PCR 증폭)에 의해 캡처 교 잡 표면 닿는 폴리-티 올리고 열매를 산출하기 위하여 무질서의 배열이 끝났다 하나의 분자 시퀀싱 템플릿이 있습니다. 에서 각각 주기,DNA 중합효소 연하고 하나의 종의 놓여있는지 표시된 뉴클레오티드이 추가한 결과,템플릿에 따른 확장자의 표면을 움직일 수는 프라이머 템플릿 duplexes(Fig. 3 차원)., 전체 어레이를 타일링하는 이미지 획득 후,형광 라벨의 화학적 분열 및 방출은 확장 및 이미징의 후속 사이클을 허용한다. 최근 report18 에서 설명한 것처럼 수백 사이클의 단일 기본 확장(즉,A,G,C,T,A,G,C,T…)25bp 이상의 평균 읽기 길이를 산출하십시오. 이 시스템의 주목할만한 측면은 다음과 같습니다. 첫째,다음과 같은 454 플랫폼,시퀀싱은 비동기적으로 몇 가닥에 떨어질 것이다 앞서거나 다른 사람의 뒤에 순서에 의존하는 방법., 기회는 또한 역할을 한,일부로서 템플릿을 수 있습니다 간단을 통합하지 못에 지정된 주기에도 불구하고 적절한 기준에는 다음 위치입니다. 그러나,이들은 단일 분자이기 때문에,탈 파싱은 문제가되지 않으며,그러한 사건들은 그 자체로 오류로 이어지지 않는다.
둘째,표지된 뉴클레오티드 상에 종결 모이어티가 존재하지 않는다. 따라서 454 시스템과 마찬가지로 호모 폴리머 실행은 중요한 문제입니다. 그러나,단일 분자가 서열화되고 있기 때문에,혼입 사건의 비율을 제한함으로써 문제가 완화 될 수있다. 또한,해리스 등.,18 언급 연속 incorporations 의 표시된 뉴클레오티드에서 homopolymers 생산 냉각 상호 작용하는 사용자를 추론 신호의 바(예를 들어,대 AA 대 AAA).
셋째,원시 시퀀싱하는 정확성할 수 있는 실질적으로 개선하여 두 패스 전략에는 배열의 하나의 분자 템플릿(여기 접합기에서 양쪽 끝)의 순서 위에 설명된 대로,다음을 완전히 복사됩니다. 새로 합성 된 스트랜드가 표면 닿는 것처럼 변성하여 원래 템플릿을 제거 할 수 있습니다., 시퀀싱 준비하는 원심에서 어댑터 수익률은 다음 두 번째 순서는 동일한 템플릿에서 얻어지는 반대 방향입니다. 두 읽기 사이에 일치하는 위치는 phred 와 같은 품질 점수가 30 에 접근합니다(refs. 8,18).
그리고 마지막으로,주로 보조하는 법인의 오염,레이블이 없는 또 nonemitting 베이스,지배적인 오류가 형식이 삭제(2-7%오류를 평가 하나 전달;0.2–1%두권). 그러나,치환 오차율은 실질적으로 더 낮다(한 번의 패스로 0.01–1%)., 두 가지가 통과별 기초 원료 교체 오류율(접근 0.001%)할 수 있는 현재의 가장 낮은 모든 두 번째 세대 플랫폼입니다.피>