Madame Lelica

의 구조 ACLY 업을 보여준 생산적이고 비생산적인 CoA conformations

우리는 생산하는 재조합,전체 길이 ACLY 에서 대장균에 대한 우리의 모든 생화학적 및 구조적 분석(확장된 데이터 Fig. 1a,b)., Differential scanning fluorimetry 의 효소 다른 공동 인자가 확인한 바인딩 및 잠재적인 구조 변화와 관련된 ligands 추가 단독으로 또는 조합(확장된 데이터 Fig. 1 기음). 우리는 이러한 데이터를 안내하는 구조 결정의 ACLY 와 공동 기판 또는 공동 제품입니다.

우리는 우리를 준비하는 재조합 단백질을 처음에 수행한 부정적인 얼룩 싱글-입자 분석 단백질의 부재에서의 대사물(ACLY-apo)., 3,000 개의 입자로부터의 2 차원(2D)클래스 평균은 단백질이 사량체를 형성했음을 확인했다(확장 된 데이터도 1). 2a,비). 보다 구조적 세부 사항을 얻기 위해,우리는 ACLY-citrate–CoA 복합체에 대한 cryo-EM 연구를 수행했다. Cryo-EM 샘플을 여러 차례 최적화 한 후,우리는 ACLY-citrate–CoA 구조의 D2 대칭 cryo-EM 구조를 3.0Å 의 평균 전체 해상도로 결정했습니다. (확장 데이터 무화과. 2c,d,3 및 4 및 표 1).,

ACLY–citrate-CoA 구조 형성 homotetramer 중앙 tetrameric CSH 모듈과 두 개의 화산재에서 도메인의 반대쪽 끝 CSH 모듈(protomers1&2 3&4)(Fig. 1a,b). ASH 도메인(잔기 1-806)은 구연산염 및 ADP24 에 결합 된 분리 된 N-말단 도메인의 이전에보고 된 α/β 아키텍처와 매우 유사한 구조를 채택한다., CSH 도메인(잔류물 859-1101)으로 구성되어 있으로 포함하고 짧은 루프로,구조적 homology 이합체의 시트르산 synthase 이합체는 십자가에서~90°각도(확장된 데이터 Fig. 5a). 각 폴리펩티드 사슬의 ASH 및 CSH 도메인은 잔기 824 및 829 사이의 짧은 α-나선을 제외하고 크게 확장 된~50-잔기 코일 영역에 의해 연결된다. 나선형 영역 내에서 이 linker 만점의 중요한 연락처(van der Waals 상호 작용이)사이에 두 개의 재 도메인에 하나의 측면 분자입니다., 확장 링커는 한 서브 유닛의 CSH 가 CSH 모듈의 반대편에 걸쳐 다른 서브 유닛의 ASH 도메인과 상호 작용할 수있게합니다. 반면에 상대적으로 스파 간의 상호 작용을 재 protomers,CSH 도메인 형태의 광범위한 네트워크는 주로 van der Waals 상호 작용하는 것이 좋 CSH 도메인으로 기능 강 tetrameric 모듈 동안 네 ASH 도메인은 좀 더 유연합니다. 이는 EM 맵에서 관찰 된 EM 로컬 분해능 추정이 CSH 도메인에서 가장 높은 것과 일치합니다(2.8Å,확장 데이터 그림 2)., 4C)및 CSH 도메인이~75°c 대~55°c 의 재에 비해 더 높은 용융 온도를 갖는 우리의 이전 관찰,respectively21.

CoA 는 별도의 서브 유닛의 CSH 와 ASH 도메인 사이의 계면에서 결합하고 수퍼 도메인을 함께’스테이플 링’하는 것으로 보인다. 아데닌 기초과 리보스 반지와 상호 작용 CSH 도메인의 하나의 단량체 및 판토텐 팔 β-머캅 그룹은 고집으로 현재 사이트의 재 도메인의 또 다른 소 단위(Fig. 1c(왼쪽)및도. 1d(왼쪽))., CoA 의 모델링은 인산화 된 ADP 그룹이 cryo-EM 밀도에서 잘 해결된다는 관찰에 기초한다. 그러나 메르 캅토 그룹은 잘 해결되지 않았으며이 지역의 유연성을 시사했다. 지만 여러 가지 잔류물에서 CSH 및 재 도메인을 van der Waals 와의 상호 작용 CoA,수소 채권 S574,R576 및 S577 에서 ASH 도메인 K964 에서 CSH 도메인을 리보스 인산염 oxygens 나타날은 특히 중요한 역할을에서는 스테이플링 CoA 에서 재 CSH 인터페이스입니다., 흥미롭게도 E599 는 coa 의 모델링 된 황 원자까지의 수소 결합 거리 내에 있으며 중요한 촉매 역할을 할 수 있음을 암시합니다. 의 중요성 단백질–CoA 상호작용에서 재고 CSH 도메인에 의해 지원됩 mutational 감도의 잔류물 R576 및 K964,그리고 잠재적인 촉매의 역할을 E599 로 지원되고 mutational 감도하거나 Q 지만 D(Fig. 1 층). 구연산염이 cryo-EM 재구성을 위해 샘플에 포함되었지만 cryo-EM 지도에서 자신있게 해결할 수는 없었습니다.,

부여 해결되지 않은 밀도에 대한 머캅 그룹의 CoA,우리는 실시한 또 다른 재건의 ACLY–citrate-CoA 구조를 부과 하지 않고 D2 대칭을 결정하는 경우 CoA 을 채택할 수 있습 다른 conformations 에서 다른 protomers. 우리는 3.5Å 의 공칭 해상도로 대칭(c1,비대칭 폐쇄)을 부과하지 않고 재구성을 준비 할 수있었습니다. 이 ACLY–citrate-CoA-C1 비대칭 구조,해결책을위 ASH 도메인보다 더 가난한에서 D2 구조이지만,로컬 해변 CSH 도메인이 남아 있는 상대적으로 고부터 2.8 3.2Å., 의 분석이 ACLY–citrate-CoA-C1 비대칭 폐쇄 구조를 공개하는 각각의 재 도메인을 네 가지의 세 가지 CSH 도메인 CoA 분자를 채택은 동일한 구성으로 D2 구조입니다. 그러나,하나의 CoA 분자를 채택하는 다른 형태에서는 phosphorylated ADP moiety shifted~8Å 으로 CSH 모듈과 판토텐 팔이 구부러진과 상호 작용하는 CSH(Fig. 1b,c(오른쪽)및 Fig. 1e). 이 대체 CoA 구성에 해당하는 cryo-EM 밀도는 매우 명확합니다(그림 1). 1c(오른쪽))., 놀랍게도,cryo-EM 밀도 또한 관찰에 대해 잘된 물 분자,나타나는 다리의 수소 결합 간의 상호 작용을 터미널 황 원자의 CoA 측면 체인의 잔류물 H900,D1026 및 R1065 추가 van der Waals 상호작용에서 L969,I973,H975 및 R976(Fig. 1 차원(오른쪽)). 수 반하는 이 대체 CoA 형태,반복 내 CSH 도메인(잔류물 965-986)과 측면을 포함 변화를 수용하는 대체의 위치를 CoA 아데닌 base(Fig. 1e)., 의 돌연변이 H975,R976,D1026 및 R1065 알라닌 모든 표시된 활동,제안하는 바인딩 CoA 을 CSH 도메인은 어떻게든에 관여하는 효소 활동(Fig. 1 층). 는 CoA 해 반응에 구연산 ASH 도메인을 참조하 CoA conformations 로 cysteamine 의 판토텐 팔는 점으로 재 및 CSH 으로’생산’과’비생산적인’CoA conformations,각각밖에 없 ACLY.,

의 구조 ACLY–citrate-CoA subpopulation 보여 비대칭 ASH 방향

이외에 중요한 ACLY–citrate-CoA 입자는 인구의 57%를 나타내는 클래스 3 입자,subpopulation ACLY–citrate-CoA 복잡한 입자를 나타내는 23%의 서브 클래스의 입자(10%overall)도 캡처에 있는 3 차원 재구성 없이 당당한 대칭의 해상도 4.3Å(확장된 데이터 Fig. 3)., 이 subpopulation 입자는 전체적인 구조는 유사한 주요 ACLY–citrate-CoA 인구 제외하고는 하나의 재 도메인 회전~50°으로 가장 가까운 재 소 단위를 채택하는 더 많은’열린’구조,그래서 우리는 참으로 그것’ACLY–citrate-CoA-C1asymm 열린’. 이 구조에서 밀도만 볼 수 있 phosphorylated ADP moiety 의 두 CoA 분자밖에 두 개의 대칭 ASH 도메인(Fig. 2a,비). 대칭 및 비대칭 애쉬 서브 유닛 중 하나는 CoA 결합에 대한 증거를 보여주지 않습니다., 주목할 만하게,비대칭 ASH 도메인은 생산적인 CoA 결합과 양립 할 수없는 것으로 보인다(그림 1). 2 기음). 우리가 제안이 ACLY–citrate-CoA-C1asymm 열린 구조를 나타내는 중간 상태의 ACLY,두 active 사이트는 프라이머를 위한 촉매이며,두 사람은 없습니다. 이 구조의 관찰은 또한 4 개의 ACLY 활성 부위가 독립적으로 기능 할 수 있음을 시사한다.

의 구조 ACLY-apo 상태에 대해 불리한 CoA 바인딩

주어진 제한 사이의 상호 작용 CSH 및 재 도메인,우리가 물어의 구조에 대해 ACLY 의 부재에서 바 ligands. 이를 위해 우리는 apo 형태로 ACLY 의 cryo-EM 구조를 결정했으며,우리는 4.3-Å 분해능으로 해결할 수있었습니다(확장 데이터 그림 1). 4a 및 표 1)., 의 비교를 ACLY-apo 및 ACLY–citrate-CoA 구조를 보여준,에 apo 상태의 각 재 쌍의 종 tetramer 있으로 회전하여 서~10°를 더 열 ACLY tetramer 및을 재 도메인에서 위치를 나타나는 눈에 생산적인 CoA 바인딩(Fig. 3). 특히,재 루프 중심으로 F533,S574 및 K1018(에 인접한 CSH 도메인)는 충돌로 CoA 으로 바인딩에서 ACLY–citrate-CoA 구조(그림. 3b)., 또한,두 가지 잔류물을 내에 있는 수소 결합 거리 CoA 에서 ASH 도메인 R576 및 E599 밖으로 이동,수소 결합한 거리에 ACLY-apo 구조(그림. 3 기음). 한편,CSH 모듈은 두 구조 사이에서 크게 변하지 않습니다. 함께,ACLY-apo 와 ACLY–citrate-CoA 구조의 비교는 ACLY-apo 구조가 CoA 기판을 수용하기 위해 재 배열되어야 함을 보여준다.

ACLY–acetyl-CoA–OAA 복잡한 보 CoA–구연산 분 반응에서 발생하는 재 domain

Differential scanning fluorimetry 데이터 공개는 모두 acetyl-CoA and OAA 제품을 안정 ACLY 단백질(확장된 데이터 Fig. 1 기음)., 이 발견은 우리가 ACLY–OAA–아세틸-CoA 생성물 복합체를 포획 할 수 있으므로 반응 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있음을 나타냈다. 이를 위해 우리는 d2 대칭을 사용하여 3.1-Å 해상도로 해결 한 복합체의 cryo-EM 구조를 결정했습니다(확장 데이터 그림 1). 4). 의 전체적인 구조를 ACLY–co-제품의 복잡한과 가장 유사한 대칭 ACLY–co-기판(ACLY–citrate-CoA-D2)복잡한,전반적인 root-mean-square 편차(r.m 입니다.s.d.) 의 0.407Å 캘리포니아 원자(Fig. 4a)., 우리가 발견 acetyl-CoA 점령하고는 동일한 바인딩 사이트 CoA 한 안정에 의해 동일한 기본적인 잔류물,R576 및 K964(Fig. 4b). 또한,우리는 각 ACLY 서브 유닛에 결합 된 두 개의 OAA 분자를 모호하지 않게 모델링 할 수 있었다(도 1). 4b,기음). 하나의 OAA 분자(OAA1)는 ASH 도메인 내의 구연산염 결합 포켓과 중첩되며 아세틸-CoA 의 아세틸 기에 근위에있다. OAA1 은 n346 및 T348 에 대한 수소 결합 및 F547 과의 반 데르 발스 상호 작용을 포함하여 단백질과 비교적 완만 한 상호 작용을 만든다., 다른 OAA 분자(OAA2)는 CSH 도메인에 결합되어 OAA1 보다 ACLY 와의 더 광범위한 상호 작용을 만든다. OAA2 연락처 CSH 모듈을 통한 수소 결합하 H900,D1026,R1065 및 R1085 을 통해 van der Waals 상호 작용을 F935 및 F1061 에서 하나 소 단위,뿐만 아니라 통한 수소 결합하 R1065 에서 다른 소 단위(Fig. 4 기음). OAA2 는 돼지 심장 구연산염 synthase25 에서 결합 된 OAA 와 잘 중첩됩니다(확장 된 데이터 그림 2). 5b).

우리는 또한 세련 cryo-EM 의 지도 ACLY–OAA–acetyl-CoA 구조 없이 대칭 제약 조건과를 얻은 동일한 구조를 가진 D2 대칭 것을 제외하고,하나의 네 acetyl-CoA 분자를 보는 것이 가능 conformations 의 판토텐 arm of acetyl-CoA, 하나 cysteamine 의 CoA 으로 재 도메인에서와 같이,다른 세 protomers,그리고 다른 쪽으로 CSH 도메인(확장된 데이터 Fig. 6a)., 그러나,ACLY-citrate-CoA 구조에서 발견 된 CoA 의 대체 구조와는 달리,인산화 된 ADP 그룹의 위치는이 두 가지 구조에서 변하지 않았다. 잠재적인 대체 형태의 acetyl-CoA 제안 할 수 있는 가능한 기판을 출시 경로에서 효소의 매출 또는 autoinhibitory 상태의 효소(아래에 설명).

의 관찰 OAA1 및 acetyl-CoA 에서 제품을 재 도메인이 강하게 제안하는 리아제 화학은 실행이 대조적으로 이전는 제안이 화학에서 수행된 CSH domain22,23., 우리가 추측 OAA2 수있는 기능을 구성하는 데 도움이 되도록 CSH 도메인과의 협력을 재 도메인 및/또는 행위로 두 번째 OAA 제품 autoinhibitory 사이트할 수 있는 격리 판토텐 arm of acetyl-CoA(또는 cysteamine 의 CoA)맞은편에 앉아있 CSH 도메인 등을 함께 사용할 수 없는 바인딩 CoA 에서 생산적인 형태로 저해서 높은 셀룰러 OAA 농도(확장된 데이터 Fig. 6a)., 흥미롭게도,ASH 도메인을 가리키는 cysteamine 과의 생산적인 확장 된 CoA 배향은 유의 한 steric 충돌없이 ACLY-apo 로 모델링 될 수 없다(도 1). 도 2b),CYSTEAMINE 이 CSH 도메인을 가리키는 방향으로 뒤집힌 배향은 can(확장 된 데이터도 2b)을 가리킨다. 6b). 이것은 우리의 연구 결과는 CoA 결합 할 수있 ACLY 의 부재에서 구연산 및/또는 ATP(데이터시하지 않음),그러나 우리는 제 구부러진 형태로 관찰 중 하나에서 ACLY–citrate-CoA-C1protomers(Fig. 1c(오른쪽)및 그림., 1d(오른쪽))또한 CSH domain22 의 고립 된 구조.

가설과 일치하는 OAA2 로 서 역할을 수 있습니다 ACLY autoinhibitory 사이트의 이전 연구 보여주는 OAA 할 수 있을 억제하는 쥐 간 ACLY 는 방식으로 비경쟁으로 citrate26. ACLY-OAA-아세틸-CoA 구조에서 관찰 된 두 OAA 부위의 기능적 중요성을 검증하기 위해,우리는 정상 상태 형광 담금질 실험을 채택했다., 으로 제어 실험을,우리는 첫 번째 적정 시트르산으로 ACLY 에서 부재 또는 존재는 포화시키고의 농도 CoA 및 수 있었에 맞게 데이터를 하나 구연산염 바인딩 사이트 Kd 값의 3.4±0.5μm1.4±0.3μm 부재에서나 존재의 CoA,좋은 R2 값의 0.92 및 0.84,각각합니다(그림. 4d). 과 일치 하나 구연산염 바인딩 사이트에서 관찰 ACLY ASH 도메인 결정 구조를 바 citrate13 고의 결정 구조를 그대로 ACLY 바 CoA 및 citrate22 것을 보여주는,CoA 안정화 시트르산 바인딩에서 ACLY 재 domain22., 우리는 다음에 적정 OAA 로 ACLY 는 것을 발견하고 데이터에 맞게 크게 더 나은 두 개의 사이트 모델(R2=0.99)보다 한 사이트 모델(R2=0.93)(Fig. 4e). 두 사이트 바인딩을 모형을 이용하는 것이 더 좋습니 나아졌다는 형광 감소된다는 명백한에서 높은 OAA 농도를 초래하는 높은 선호도 OAA 바인딩 사이트(Kd=15±4μm)는 계정을 위한 one-third of the total fluorescence 변화와 낮은 선호도 OAA 바인딩 사이트(Kd=1,300±500μm)는 계정을 위한 나머지 두 분의 총 형광 변경(그림. 4e)., 이러한 데이터는 ACLY–OAA–아세틸-CoA 구조에서 관찰 된 두 OAA 결합 부위의 기능적 관련성과 일치한다.

ACLY-E599 에 위치하는 기능으로 중요한 촉매 잔류물

ACLY–co-제품 구조는 우리가 주소는 서에 대한 질문에 대한 ACLY 분자 메커니즘이 있습니다. ACLY 제안 다니엘 citryl-CoA 중간의 도움으로 일반적인 기본을 추출하는 양성자에서 구연산염 기판 및/또는 일반 산 reprotonate 의 OAA 떠나 group16,27,28., 이는~8.5 의 pKa 를 갖는 ACLY 의 pH 속도 프로파일 분석과 일치한다(도 1). 5a). 우리는 진화론적으로 보존 E599 가 위치해 있는 중요한 촉매의 역할로,일반적인 기본 및/또는산 및/또는 안정 phospho-citryl-CoA 중간(다음 섹션 참조하고 그림. 4b). 매장 된 글루타메이트 잔기에 대한 상대적으로 높은 pKa 가 이전에 주목되었다.29. 일관성이 중요한 촉매의 역할 E599,우리가 발견 E599A 및 E599Q 돌연변이 있는 크게 손상된 활동(Fig. 1f),보조 인자 결합이 영향을받지 않았음에도 불구하고(그림 1). 5b)., 대조적으로,우리는 유사하게 산성 E599D 돌연변이 체가 WT ACLY 와 유사한 활성을 나타냄을 발견했다(도 1). 1f),유사한 pH 속도 프로파일(그림. 5a). 함께 찍은 데이터는 ACLY 에 의한 촉매 작용에 대한 E599 의 중요성을 주장합니다.

ACLY 촉매 수익금을 통해 phospho-citryl-CoA 중간에서 재 domain

의 식별 E599 으로 중요한 촉매 잔류물 분열의 citryl-CoA 분석을 acetyl-CoA and OAA 제품을 제공한 사회과 트랩은 반응 중간의 ACLY-E599Q 돌연변이에서 존재의 ATP,구연산 및 CoA co-니다., 따라서 우리는 혼합 ACLY-E599Q 돌연변이와 포화의 농도 ATP,구연산 및 CoA(ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA)및 결정 cryo-EM 구조는 우리가 해결할 수 있는 전반적으로 해상도의 2.85Å. 구조 결정되었을 부과함으로써 D2 대칭과 밝혔재 및 CSH 도메인의 ACLY 배열된 마찬가지로 ACLY–citrate-CoA 상품 및 ACLY–OAA–acetyl-CoA 구조와 r.m 입니다.s.d. 값을 위한 캘리포니아의 원자 0.584 및 0.620Å,각각합니다., 그러나,이러한 다른 기판 및 제품 단지,ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA 복잡한 현저하게 공개론 정의 cryo-EM 밀도에서 재가 도메인 활성 있는 사이트로 모델링할 수 있습 ADP(가수분해 ATP)및 phospho-citryl-CoA 중간(Fig. 6a,b). 또한 대조적으로,각각의 다른 ACLY 구조를보고 이 연구에서는 아미노산 752-767 루프를 품고 H760 잔류는 다음과 같 중재 인산부터 전송 ATP 트르산,은 주문에 ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA 구조(그림. 6 기음)., 또한,마그네슘이온 또는 물 분자,또는 제안하는 안정 H760,관찰하는 바인딩 E599 과 인산염 인산(Fig. 6 기음). 이 관측 제안 His760 잔류물,인산염 인산 마그네슘이온 협력할 수 있습을 안정시키는 구연산을 위한 결찰을 CoA 에서 재가 도메인 활성이다. 또한,사실 acetyl-CoA and OAA 제품은 관찰되지 않는다 이 구조에서 더욱 지원합니다 우리의 결론에는 E599 이 중요한 촉매의 역할에 분열의 인 citryl-CoA 중간 acetyl-CoA and OAA 내에서 제품의 재 도메인입니다.,