재료 및 방법
Mice.
Charles River Laboratories(Wilmington,MA)에서 야생형 C57BL/6 마우스를 얻었다. Pde8a KO 마우스는 처음에 Deltagen,Inc.에 의해 생산되었습니다. (산 카를로스,캘리포니아)화이자,Inc 의 계약에 따라. (화이자 글로벌 연구 개발,샌드위치,영국). 그들은 이후 10 세대 동안 워싱턴 대학의 C57BL/6 마우스로 사육되었습니다. 보고 된 실험을 위해,6 주에서 8 주 사이의 연령 일치 마우스를 사용 하였다., 모든 절차를 사용되는 승인 기관의 동물 보호와 사용 위원회(IACUC)의 워싱턴 대학의에 따라,국가기관의 건강에 대한 가이드 관리 및 사용의 실험실 동물입니다.
실시간 PCR.
고환 cDNA 는 SuperScript III 및 Oligo dT(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)를 사용하여 야생형 및 PDE8A-null 마우스 고환으로부터 총 RNA 로부터 제조되었다. 실시간 PCR 은 Power SYBR green master mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)를 사용하여 수행되었습니다., 프라이머(IDT,코럴빌,IA)PDE8A,감독하는 지역의 다운스트림 대상 카세트,다음과 같다:앞으로는 프라이머,GCCACAGAAATGACGAAGC(exon19);reverse 프라이머,ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG(exon20). 하이폭산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제에 대한 프라이머는 다음과 같았다:순방향 프라이머 ATTATGCCGAGGATTTGGAA;역방향 프라이머,CCCATCTCCTTCATGACATCT.
현장 혼성화.
리보프로브 합성을 위한 템플릿은 마우스 PDE8A 서열을 포함하는 플라스미드를 이용하여 PCR 에 의해 얻어졌다., 특히,3’지역의 마우스 PDE8A(exons17-20)증폭 다음을 사용하여 프라이머:앞으로는 프라이머,AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG(밑줄 T3 살균 RNA 발기인 시퀀);reverse 프라이머,TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT(밑줄 T7 살균 RNA 발기인 시퀀스). PCR 생성물을 아가 로스 겔로부터 분리하고 겔 추출 키트(Qiagen,Valencia,CA)로 정제 하였다., 35S-labeled riboprobes 합성에 의해서 체외 전사와 함께 MAXIscript T3/T7 키트(하 여 수행 되었습,Austin,TX)의 사용하여 템플릿으로 PCR 을 포함 하는 제품 T3 및 T7 살균 RNA 발기인은 곳입니다. 생체외에서 녹음방송에서 수행되었 20µl 반응 혼합물을 포함하는 5µl 의 UTP(PerkinElmer,Boston,MA)T3RNA 나 T7RNA 구하는 감각 또는 센스 riboprobe,각각합니다.
고환을 야생형 및 PDE8A KO 마우스로부터 해부하고 드라이 아이스상의 Tissue-Tek O.C.t. 화합물(Sakura,Torrence,CA)에서 급속 동결시켰다., 섹션(20μm)을 cryostat 에서 절단하고 Superfrost plus microslide(VWR Scientific,West Chester,PA)에 장착하고 공기 건조시켰다. 이 섹션들에 고정 4%파라포름알데히드를 위해 15 분에서 실온으로 치료 0.25%초산 무수 화합물 0.1M 트리에탄올아민(pH8.0)10min,탈수 등급에탄올 시리즈(30,60,80,95,및 100%). 섹션은 다음 incubated 교 잡 버퍼에 한 챔버에서 60°C,4h. 세척 후에서 2×SSC(표준 염 시트르산;1×SSC=0.15M 염화나트륨/0.015M 나트륨 시트르산,pH7.,2),절편을 등급 화 된 에탄올 시리즈를 통해 탈수시켰다. 교 잡을 수행하였에 포함된 버퍼 35S-labeled 센스 또는 감각 프로브(40pg/34,000–38,000cpm 당 µl)에서 플라스틱 coverslips 습 실 60°C 에서 하룻밤. Coverslips 를 부드럽게 제거하고,섹션을 60℃에서 두 번 30 분 동안 10mM DTT 를 함유하는 2×SSC 로 세척 한 다음 섹션을 0.5M NaCl 에서 20μg/ml RNaseA 로 37°C 에서 30 분 동안 배양하고,10mM Tris*HCl(pH7.,5)1mM EDTA,세척한 후에서 50%포름 아미드,2×SSC 이 포함된 10mM DTT30 분에서 60°C1×SSC 이 포함된 10mM DTT30 분에서 60°C,과에 더 이상 0.1×SSC 이 포함된 10mM DTT30 분에서 60°C 에 마지막으로,이 섹션들이 탈수에서 에탄올(70,95,및 100%),공기 건조에 노출 BioMax XAR 필름(Eastman Kodak,Rochester,NY) 9h. 시 셀이 분포의 PDE8A mRNA 교 잡,슬라이드이었으로 코팅 autoradiography 하 여 NTB 에멀젼(Eastman Kodak)고 노출 1 주에 4°C, 슬라이드는 hematoxyline 으로 개발,고정 및 카운터 스트라이드되었으며 캐나다 Balsam(Sigma-Aldrich)에 장착되었습니다.
Pde8a Immunoprecipitation 및 분석실험.
마우스를 정자들로부터 격리 cauda 부고환에 의해 수영웃법(38)및 균질화에 PBS 를 포함하는 1%Nonidet(로슈에 적용 과학,인디애나폴리스,IN),1mM EGTA,20mM DTT,0.2mM PMSF,1mM para-amino benzamidine 및 시그마 프로테아제 억제물이 혼합물(Sigma-Aldrich)., The homogenate 었 원심 분리하여 5 분에서 16,000×g 에 microcentrifuge200µl 부분 표본의 상등액에 해당하는 106 정자,배양되었으로 하룻밤 20µl 의 1:1 슬러리의 단백질 G-agarose 구슬(Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA)PDE8A 항체(1:100,121-ap;Fabgennix,Frisco,TX)의 존재 또는 부재 하에서. 다음날,immunoprecipitate 세척 하였으로 세 번 PBS 다음 분석을 위한 PDE 활동의 존재 하에서 10nM 캠프 기판,40mM Mops(pH7.5),15mM Mg-아세테이트,2mM EGTA,0.2mg/ml BSA 로에서 ref. 39.,
면역 조직 화학.
갓 냉동된 마우스 고환을 Tissue-Tek O.C.t.compound 에 내장한 후 슬라이스 당 20μm 의 cryostat 에 절제 하였다. 조직 섹션 또는 단리 된 Leydig 세포를 건조시키고 실온에서 10 분 동안 4%(wt/vol)파라 포름 알데히드/PBS(pH7.4)로 고정시키고 PBS 로 3 회 세척 하였다. 슬라이드를 블로킹 버퍼(5%donkey serum,1mg/ml BSA 및 0)로 미리 주입 하였다.,1%Triton X100PBS)1 시온에서,incubated anti-PDE8A 항체(200µl,1:100,C-15 일;Santa Cruz Biotechnology)에 PBS 를 포함하는 1%나귀 혈청,1mg/ml BSA,0.1%Triton X-100 에서 하룻밤 4°C,세척 PBS 를 포함하는 0.05%Tween20 세 시간 20 분,incubated donkey anti-goat Alexa546(200µl,1:500;Invitrogen) PBS 에서 포함된 1mg/ml BSA0.1%Triton X100 2h 상온에서 세척한다., 슬라이드이었다 더 배양으로 차단 버퍼 포함하는 5%혈청 염소 1 시온에서,incubated 시토크롬 P450 드 체인 분열 효소(CYP11A)항체(200µl,1:250;Chemicon International Inc.,Temecula,CA)를 4°C 에서 밤새 20 분 동안 0.05%Tween20 을 3 회 함유하는 PBS 로 세척하고,위와 같이 염소 방지 토끼 Alexa488(1:500;Invitrogen)으로 배양 하였다. 단면도는 마지막으로 5 분 동안 PBS 에 있는 TO-PRO-3(1:1000;Invitrogen)로 counterstained,세척되고,SlowFade 금 antifade 시약(Invitrogen)에서 거치되었습니다., PDE8A 항체 특이성을 시험하기 위해,항체 용액을 염색하기 전에 실온에서 2 시간 동안 2.5μg/ml 항원 펩타이드(Santa Cruz Biotechnology)로 미리 주입 하였다. 일부 섹션은 2 차 항체로 인해 배경을 결정하기 위해 1 차 항체없이 배양되었다. 면역 염색 신호는 공 초점 현미경(Leica SL;Leica Microsystems Inc.)으로 시각화되었다.,Bannockburn,IL). 표적화 카세트에서 LacZ 유전자에 의한 핵 국소화 신호로 발현 된 β-갈 락토시다 제 활성은 X-gal 염색에 의해 평가되었다., 상기 섹션은 먼저 항-CYP11A 항체로 배양되었고,이어서 항-토끼 알칼리성 포스파타제 접합체(1:500;Invitrogen)및 색 발달을 위해 NBT/BCIP(Roche)로 배양되었다. 이어서 x-gal 염색을 밤새 37℃에서 x-gal 혼합물에서 설명 된대로 수행 하였다(40). 섹션을 세척하고 글리세롤/트리스 완충 식염수로 장착 하였다.
레이디그 세포 정제.
leydig 세포를 ref 에 기술 된 바와 같이 분리 하였다. 41. 간략하게,성체 마우스로부터의 고환을 디캡슐 화하고 34℃에서 10 분 동안 10ml 의 배지 199(M-199)에서 0 으로 흔들어 물 욕조에 분산시켰다.,25mg/ml 콜라 D,35mU/ml Dispase II,6µg/ml DNase I. 을 종료한 조직의 분산,40ml of1%BSA M-199 을 포함한 미디어 15mM Hepes,4mM 탄산수소나트륨,25µg/ml 콩 트립신 억제제에 추가 되었을 희석시 원본 서스펜션이다. 튜브는 그 다음 모자를 씌우고 여러 번 뒤집었다. 중력에 의해 세뇨관 침착을 허용하고,간질 세포를 포함하는 상청액을 수집 하였다. 간질 세포를 추가로 수확하기 위해 절차를 두 번 반복했다., 는 세포 산탄에서 50ml 관여 원심분리에 800×g20 분에서 4°C 와 그 분획을 사용하여 지속적인 Percoll(GE Healthcare,Piscataway,NJ)그라데이션(55%Percoll 에 HBSS buffered15mM Hepes25µg/ml 콩 트립신 억제제)총 볼륨의 35ml. 그라디언트가 형성되었에 의해 현장에서 원심분리에 JA-20 고정 각 로터(Beckman Coulter,Fullerton,CA)23,700×g30min4°C. 튜브 포함하는 밀도가 마커즈(GE Healthcare)으로 사용되었을 식별하는 참조 다른 밀도 레이어입니다., Leydig 세포를 1.07g/ml 의 밀도에서 시작하여 구배의 바닥까지 회수 하였다. 다섯 권의 HBSS 추가되었 희석 Percoll 고,세포 산탄에서는 200×g10 분에서 4°C 최종 펠렛에서 얻은 두 개의 테스트,풍부에서 간질 세포되었 resuspended 에서 4ml DMEM/F-12 으로 보충된 1%BSA 고 즉시 사용을 위한 실험.
3β-Hydoxysteroid 탈수소 효소 분석법.
테스토스테론 생산의 측정.
Leydig 세포를 상기와 같이 resuspended 하고 96-웰 플레이트에서 100-μl aliquots 를 분배 하였다., 세포를 자극에는 150µl 최종로 볼륨의 표시농도 재조합 LH3 시간에서 5%의 CO2 배 37°C. 재조합 인 LH 에서 얻은 국 호르몬&펩타이드 프로그램(A.F.Parlow,Torrance,CA). 각 LH 농도에 대한 중복 세포 샘플의 배지로 방출 된 테스토스테론은 Neogen(Lexington,KY)의 immunoenzymatic assay kit 를 사용하여 측정 하였다.
모든 데이터는 평균±SD 로 표현됩니다., EC50 값에 대한 LH 작업에 대한 테스토스테론 생산에 의해 계산된 비선형 피팅의 LH 농도-의존 곡선을 획득한 각 간질 세포 준비를 사용하여 소프트웨어 패키지(GraphPad Prism4.0;GraphPad 소프트웨어,San Diego,CA). 통계 분석은 학생의 t 테스트에 의해 수행되었습니다. 차이는 P<0.05 에서 유의미한 것으로 간주되었다.피>