Madame Lelica

CoAを有するACLYの構造は、生産的及び非生産的CoA立体配座を明らかにする

我々は、すべての生化学的及び構造解析のために大腸菌における組換え、全長ACLYを生産した(拡張データFig. 1a、b）。, 異なる補因子を有する酵素の示差走査蛍光法により、単独または組み合わせて添加されたリガンドに関連する結合および潜在的な構造変化を確認 第1回）を開催した。 これらのデータを用いて，ＡＣＬＹの共substratesまたは共生成物との構造決定を導いた。

我々は、組換えタンパク質を調製し、最初に任意の代謝産物（ACLY-apo）の非存在下でタンパク質の陰性染色単粒子分析を行った。, 二次元（2D）クラスの平均は3,000粒子からタンパク質が四量体を形成することを確認した（拡張データ図。 2a、b）。 より多くの構造の詳細を得るために、我々はＡＣＬＹ-クエン酸–Ｃｏａ複合体のクライオ-ＥＭ研究を行った。 Cryo-EMサンプルの最適化の複数のラウンドの後、我々はD2対称cryo-EM構造ACLY–クエン酸CoA構造3.0Åの平均全体の解像度に決定しました。 （拡張データ図。 2c、d、3および4および表1）。,

ACLY–クエン酸CoA構造は、中心四量体CSHモジュールとCSHモジュールの反対側の端に二つの灰ドメイン（プロトマー1&2および3&4)(fig. 1a、b）。 ASHドメイン（残基1-806）は、クエン酸塩およびADP24に結合した単離されたN末端ドメインの以前に報告されたα/βアーキテクチャと非常に類似した構造, CSHドメイン（残基859-1101）は、ヘリックスと短いループのみで構成され、-90°の角度で交差するクエン酸合成酵素ダイマーの二量体と構造的相同性を有する（拡張デー 5a）。 各ポリペプチド鎖のASHおよびCSHドメインは、残基50と残基824と829の間の短いα-ヘリックスを除いて、大部分が拡張された-残基コイル領域によって接続されている。 このリンカー内のヘリカル領域は、分子の片側の二つの灰分域間の重要な接触（ファンデルワールス相互作用による）の唯一の点である。, 拡張されたリンカーは、あるサブユニットのCSHがCSHモジュールの反対側を横切って別のサブユニットのASHドメインと相互作用することを可能にする。 ＡＳＨプロトマー間の比較的疎な相互作用とは対照的に，ＣＳＨドメインは主にｖａｎｄｅｒｗａａｌｓ相互作用の広範なネットワークを形成し，ＣＳＨドメインは剛体四量体モジュールとして機能することを示唆した。 これは、CSHドメインで最も高いEMマップ上の観測されたEM局所分解能推定と一致している（2.8Å、拡張データ図。, 4c)およびCSHドメインが灰に対して~75°c対~55°C、それぞれ21のより高い溶融温度を有することを我々の以前の観察。

CoAは、別々のサブユニットのCSHドメインとASHドメイン間の界面で結合し、スーパードメインを一緒に”ステープル”するように見えます。 アデニン塩基とリボース環は、あるモノマーのCSHドメインと相互作用し、別のサブユニットのASHドメインの活性部位に付着するパントテンアームとβ-メルカプト基 図1c（左）および図。 1d（左））。, Ｃｏａのモデリングは，りん酸化ＡＤＰ基がクライオ-ＥＭ密度でよく分解されるという観察に基づいている。 しかし、メルカプト群はよく解決されず、この領域の柔軟性を示唆していた。 CSHとASHドメインからのいくつかの残基は、CoAとファンデルワールス相互作用を作るが、S574、R576とS577ASHドメインからとK964CSHドメインからリボースリン酸酸素酸素灰–CSHインターフェイスでCoAをステープリングにおいて特に重要な役割を果たしているように見えるから水素結合。, 興味深いことに、E599はCoAのモデル化された硫黄原子と水素結合距離内にあり、重要な触媒的役割を果たすかもしれないことを暗示している。 ASHおよびCSHドメインからのタンパク質–CoA相互作用の重要性は、残基R576およびK964の変異感度によって支持され、E599の潜在的な触媒的役割は、AまたはQに対する変異感度によって支持されるが、Dに対しては支持されない（Fig. 1階）。 クエン酸塩はcryo-EM再構成のためのサンプルに含まれていたが、cryo-EMマップでは自信を持って解決することができなかった。,

CoAのメルカプトグループのための未解決の密度を考えると、我々はCoAが異なるプロトマーで異なる立体配座を採用するかもしれないかどうかを決定するためにD2対称性を課すことなく、ACLY–クエン酸塩-CoA構造の別の再構成を行った。 対称性（C1、非対称閉鎖）を3.5Åの公称分解能に課すことなく再構成を準備することができました。 このACLY–クエン酸塩-CoA-C1非対称閉鎖構造では、灰ドメインの周りの分解能はD2構造よりも劣るが、CSHドメインの周りの局所分解能は2.8から3.2Åの比較的高いままである。, このACLY–クエン酸塩-CoA-C1非対称閉鎖構造の分析は、灰ドメインのそれぞれ、および四つのCSHドメインとCoA分子の三つは、D2構造と同じ配置を採用していることを明らかにした。 しかし、CoA分子の一つは、リン酸化されたADP部分がCSHモジュールに向かって-8Åシフトし、パントテンアームが曲がってCSHと相互作用する代替配座を採用 図1b、c（右）および図。 1e）である。 この代替Ｃｏａ立体配座に対応するｃｒｙｏ-ＥＭ密度は非常に明らかである（Fig. 1c（右））。, 注目すべきことに、cryo-EM密度はまた、H900、D1026およびR1065の側鎖残基とCoAの末端硫黄原子間の水素結合相互作用を、L969、I973、H975およびR976からの追加のファンデルワールス相互作用を橋渡しするように見えるよく秩序化した水分子についても観察される（Fig。 1d（右））。 この代替CoA立体配座に伴い、CSHドメイン内のループ（残基965-986）および隣接するヘリックスは、CoAアデニン塩基の代替位置に対応するようにシフトする（Fig. 1e）である。, アラニンに対するH975、R976、D1026およびR1065の変異はすべて損なわれた活性を示し、CSHドメインへのCoAの結合が何らかの形で酵素活性に関与しているこ 1階）。 ＣｏａはＡＳＨドメイン中のくえん酸塩と反応しなければならないことを考えると，ＡＳＨとＣＳＨを指すパントテンアームのシステアミンとのＣｏａ立体配座をそれぞれＡＣＬＹに結合した”生産的”および”非生産的”Ｃｏａ立体配座として参照した。,

ACLY–citrate-CoAサブポピュレーションの構造は、非対称灰の向きを明らかにする

クラス57粒子の3％を表す主要なACLY–citrate-CoA粒子集団に加えて、粒子のサブクラス23％（全体10％）を表すACLY–citrate-CoA複合粒子のサブポピュレーションも、3次元再構成で4.3Åの分解能に対称性を課すことなく捕獲された。 3)., この粒子のサブポピュレーションは、四つの灰ドメインのいずれかが最も近い灰サブユニットに向かって50°回転してより”開いた”立体配座を採用することを除いて、主要なACLY–citrate-CoA–C1asymm open”と呼ばれることを除いて、主要なACLY-citrate-CoAポピュレーションに似ている全体的な構造を持っている。 この構造では、密度は、二つの対称灰ドメインの二つに結合した二つのＣｏａ分子のリン酸化ＡＤＰ部分に対してのみ目に見える（図。 2a、b）。 対称および非対称の灰サブユニットの一つはＣｏａ結合の証拠を示さなかった。, 特に、非対称ASHドメインは、生産的なCoA結合と互換性がないように見える（Fig. 2）。 我々は、このACLY–クエン酸塩-CoA-C1asymmオープン構造は、二つの活性部位が触媒作用のためにプライミングされ、二つはないACLYの中間状態を表すことを提案する。 この構造の観察から，四つの活性部位が独立して機能することが示唆された。

ACLY-apo状態の構造はCoA結合のために好ましくない

CSHとASHドメイン間の限られた相互作用を考えると、我々はバインドされたリガ これを行うために、我々は4.3Åの分解能に解決することができたapo形でACLYのクライオEM構造を決定した（拡張データ図。 4aおよび表1)。, ACLY-apoとACLY–citrate-CoA構造を比較すると、apo状態では、四量体の両端の灰対のそれぞれが互いに向かって-10°回転して、より開いたACLY四量体を形成し、灰ドメインを生産的なCoA結合を妨げるように見える位置に配置することが明らかになった。 3). 具体的には、（隣接するCSHドメインからの）F533、S574およびK1018を中心とするASHループは、ACLY–クエン酸塩-CoA構造に結合しているCoAと衝突するであろう（図。 3）。, さらに、灰ドメインからCoAまでの水素結合距離内にある二つの残基、R576およびE599は、ACLY-apo構造において水素結合距離から外に移動する（図。 3c）。 一方、CSHモジュールは、二つの構造の間でほとんど変化しないままです。 ＡＣＬＹ-ａｐｏ構造とＡＣＬＹ–クエン酸-Ｃｏａ構造の比較から，ＡＣＬＹ-ａｐｏ構造はＣｏａ基質を収容するために再配列しなければならないことが明らかになった。

ACLY-アセチル–CoA–OAA複合体は、COA-クエン酸リアーゼ反応が灰ドメインで起こることを明らかにする

示差走査蛍光データは、アセチル-CoAおよびOAA生成物の両方がACLYタンパク質を安定化させることを明らかにした（拡張データ図。 第1回）を開催した。, このことから，ＡＣＬＹ–ＯＡＡ–アセチル-Ｃｏａ生成物錯体を捕捉でき，反応機構をよりよく理解できることが示された。 この目的のために、我々は3.1Åの分解能にD2対称性を用いて分解した複合体のクライオEM構造を決定した（拡張データ図。 4). ACLY-共同生成物錯体の全体的な構造は、対称ACLY–co-基質（ACLY–クエン酸塩-CoA-D2）錯体に最も類似しており、Ca原子に対して0.407Åの全体的な二乗平均偏差（r.m.s.d.） 4a）。, 我々は、アセチルCoAがCoAと同じ結合部位を占め、同じ塩基性残基、R576およびK964によっても安定化されていることを見出した（Fig. 4b）。 さらに、各ACLYサブユニットに結合した二つのOAA分子を明確にモデル化することができました（Fig. 4b、c）。 一つのOAA分子（OAA1）は、ASHドメイン内のクエン酸結合ポケットとアセチルCoAのアセチル基に近位に重なっています。 OAA1は、N346およびT348への水素結合およびF547とのファンデルワールス相互作用を含む、タンパク質と比較的緩やかな相互作用を行う。, 他のOAA分子（OAA2）はCSHドメインに結合しており、OAA1よりもACLYとより広範な相互作用を行う。 OAA2は、H900、D1026、R1065およびR1085への水素結合を介して、ならびにあるサブユニットからF935およびF1061へのファンデルワールス相互作用を介して、ならびに別のサブユニットからR1065への水素結合を介してCSHモジュールに接触する（Fig. 4c）。 OAA2は、ブタ心臓クエン酸シンターゼ25における結合OAAとよく重なっている（拡張データFig. 5b）。

我々はまた、対称性の制約なしにACLY-OAA–アセチルCoA構造のクライオEMマップを洗練し、D2対称性と同一の構造を得た。他の三つのプロトマーと同様に、ｃｓｈドメインの方が他のものと同様である（拡張データ図。 6a）。, しかし，ＡＣＬＹ–くえん酸-Ｃｏａ構造に見られるＣｏａの代替配座とは異なり，りん酸化ＡＤＰ基の位置はこれら二つの配座で変化しなかった。 アセチルCoAの潜在的な代替配座は、酵素ターンオーバーまたは酵素の自己阻害状態における可能な基質放出経路を示唆することができる（以下で論じる）。

ASHドメインにおけるOAA1およびアセチル-CoA生成物の観察は、この化学がCSHドメイン22、23で行われているという以前の提案とは対照的に、リアーゼ化学がそこで行われていることを強く示唆した。, 我々は、OAA2は、ashドメインとの協力のためのCSHドメインを整理し、および/またはcshドメイン全体に座ってアセチルCoA（またはCoAのシステアミン）のパントテン腕を隔離することができる第二のOAA生成物自己阻害部位として機能するのを助けるために機能する可能性があると推測している（拡張データ図）。 6a）。, 興味深いことに、ASHドメインに向かってシステアミンを指す生産的な拡張CoA配向は、有意な立体衝突なしにACLY-apoにモデル化することはできません（Fig. 図2b)に示すように、システアミンがCSHドメインに向かって向いている方向を反転することができる（拡張データ図。 6b）である。 これは、CoAがクエン酸塩および/またはATPの非存在下でACLYに結合することができるという我々の知見と一致している（データは示されていない）が、我々はACLY–クエン酸塩-CoA-C1プロトマーのいずれかで観察されるように、曲がった立体配座を提案する（図。 図1c（右）および図。, 1d(右))およびCSHドメイン22の単離された構造も含む。

OAA2がACLY自己阻害部位として役立つかもしれないという仮説と一致して、以前の研究では、OAAがクエン酸26と非競争的である方法でラット肝臓をACLY阻害することができることを示した。 ＡＣＬＹ–ＯＡＡ–アセチル-Ｃｏａ構造で観察された二つのＯＡＡサイトの機能的意義を検証するために，定常蛍光消光実験を用いた。, 対照実験として、我々は最初にCoAの飽和濃度の非存在下または存在下でACLYにクエン酸塩を滴定し、CoAの非存在下または存在下で3.4±0.5μmおよび1.4±0.3μmのKd値を有する一つのクエン酸塩結合部位にデータを適合させることができ、それぞれR2値0.92および0.84の良好な値を有する（Fig。 4d）。 これは、coaがACLY灰ドメイン22におけるクエン酸結合を安定化することを示す、クエン酸塩13に結合したACLY灰ドメイン結晶構造およびそのままACLY CoAおよびクエン酸塩22に結合した結晶構造で観察された一つのクエン酸塩結合部位と一致している。, 次に、OAAをACLYに滴定し、データが一部位モデル（R2=0.99）よりも二部位モデル（R2=0.93）に有意に良好に適合することを見出した（Fig. 4e）。 二部位結合モデルは、より高いOAA濃度で明らかになる二相性蛍光減少を収容し、全蛍光変化の三分の一を占める高親和性OAA結合部位（Kd=15±4μm）と、全蛍光変化の残りの三分の二を占める低親和性OAA結合部位（Kd=1,300±500μm）を生じさせる。 4e）。, これらのデータはＡＣＬＹ–ＯＡＡ–アセチル-Ｃｏａ構造で観察された二つのＯＡＡ結合部位の機能的関連性と一致した。

ACLY-E599は重要な触媒残基として機能する位置にあります

ACLY–共同生成物構造は、私たちがACLY分子メカニズムについての長年の質問に対処すること ACLYは、クエン酸基質および/または一般的な酸からプロトンを抽出するために一般的な塩基の助けを借りてシトリルCoA中間体を切断し、oaa脱離基16,27,28を再プロトン化することが提案されている。, これは、-8.5のpKaを有するACLYのpH速度プロファイル分析と一致する（Fig. 5a）。 我々は、進化的に保存されたE599は、一般的な塩基および/または酸として、および/またはホスホ-シトリル-CoA中間体を安定化するために、重要な触媒役割を果たすように位置付けられていると仮定している（次のセクションおよび図を参照してください。 4b）。 埋め込まれたグルタミン酸残基のための比較的高いpKaはpreviously29指摘されています。 E599に対する重要な触媒的役割と一致して、我々は、E599AおよびE599Q変異体が有意に損なわれた活性を有することを見出した（Fig. 1f)、補因子の結合は影響を受けなかったにもかかわらず(Fig. 5b）。, 対照的に、本発明者らは、同様に酸性のE599D変異体がWT ACLYと同様の活性を示すことを見出した（Fig. 1f)、同様のpH速度プロファイルを有する（Fig. 5a）。 このデータをまとめると、ACLYによる触媒作用のためのE599の重要性が主張されています。

ACLY触媒作用は、灰ドメインにおけるホスホ-シトリル-CoA中間体を介して進行します

アセチルCoAおよびOAA生成物へのシトリル-CoA付加物の開裂のための重要な触媒残基としてE599の同定は、ACLY-CoAの反応中間体をトラップする機会を私たちに提供しましたatp、クエン酸塩およびcoa co基質の存在下でのe599q変異体。, したがって、ATP、クエン酸塩およびCoA（ACLY-E599Q-ATP–クエン酸塩-CoA）の飽和濃度とACLY-E599Q変異体を混合し、我々は2.85Åの全体的な解像度に解決することができた 構造はD2対称性を課すことによって決定され、ACLYのASHとCSHドメインは、それぞれ0.584と0.620ÅのCa原子のr.m.s.d値を持つACLY–クエン酸CoA生成物とACLY-OAA–アセチル–CoA構造と同様に配置されていることが明らかになった。, しかし、これらの他の基質および生成物錯体とは対照的に、ACLY-E599Q–ATP-クエン酸-CoA複合体は、ADP（加水分解ATP）およびホスホ-シトリル-CoA中間体としてモデル化することができるASHドメイン活性部位に著しく明確に定義されたcryo-EM密度を明らかにした。 6a、b）。 また、本研究で報告された他のACLY構造のそれぞれとは対照的に、ATPからクエン酸塩へのリン酸移動を仲介することが示されているH760残基を保有するアミノ酸752-767ループは、ACLY–E599Q-ATP-クエン酸塩-CoA構造においてよく秩序付けられている。 6c）。, また、H760を安定化させるためにも提案されているマグネシウムイオンまたは水分子は、E599およびリン酸基に結合していることが観察される（図。 6c）。 この観察は、His760残基、リン酸基およびマグネシウムイオンが灰ドメイン活性部位におけるCoAへの結紮のためのクエン酸塩を安定化するために協 さらに、アセチル-CoAおよびOAA生成物がこの構造で観察されないという事実は、E599が灰ドメイン内のアセチル-CoAおよびOAA生成物へのホスホ-シトリル-CoA中間体の切断において重要な触媒的役割を果たしているという結論をさらに支持している。,