Madame Lelica

SSF概念

酵素的加水分解と発酵を同時に行うという考えはGaussらによって提唱された。 1976年の特許で。, 著者らは、従来の別々の酵素加水分解（真菌Trichoderma reeseiによって産生される酵素を用いた）におけるグルコース収率は、おそらくグルコースとセロビオースによる加水分解の最終生成物阻害によるものであると述べた。 しかし、著者らは、SSFを使用すると、より高い全体的なエタノール収率を得ることを示すことができ、これは発酵によるグルコースとセロビオースの除去とその結果としての最終生成物阻害の放出に起因する。, SSFという用語は、当時の著者によって使用されていなかったが、元の発明からわずか数年でこのプロセスの一般的な表記法となった。 最終生成物阻害の回避は、おそらくSSFを使用するための最も重要な理由であるが、いくつかの追加の潜在的な利点がある。 Ｇａｕｓｓおよび共同研究者は、例えば、グルコースが別個の酵素加水分解ステップの後にリグニン画分から分離される必要がなく、それによって糖の潜在的な損失を回避するという利点に言及した。, なお、加水分解および発酵の組合せは必要とされる容器およびそれにより投資費用の数を減らす。 設備投資の減少は20％を超えると推定されている。 資本コストはリグノセルロースからのエタノール生産における原料費に匹敵することが期待できるので、これは非常に重要である。 ペントースおよびヘキソース糖の共消費、および解毒に関する他の利点は、このレビューの後半で議論されるように、より最近になって明らかになっている。,必然的に、分離加水分解および発酵（ＳＨＦ）プロセスと比較してＳＳＦの欠点もある。 酵素加水分解のための最適温度は、典型的には、発酵の温度よりも高く、少なくとも酵母を発酵生物として使用する場合である。 ＳＨＦプロセスでは、酵素加水分解のための温度は発酵温度とは独立して最適化することができるが、ＳＳＦプロセスでは妥協が見出されなければならない。 さらに、発酵後にリグニンから酵母を分離する問題があるため、酵母をSSFプロセスで再利用することはできません。, したがって、酵母がプロセス内の炭水化物から製造されている場合（図1参照）、または外部供給されている場合はランニングコストであれば、SSFプロセスにおける収量損失を必然的に表すことになる。 この酵素は、ＳＨＦプロセスにおいても同様に再利用することが困難である。 酵素は、プロセス内で生産される（図1参照）–それによって基質の損失を表す–または外部から供給され、それによって化学コストに追加されます。, 酵素の再循環は、酵素が基質に結合するので、同様に困難であるが、界面活性剤の添加後に部分的な脱着が得られ得る。

リグノセルロース原料原料の利用可能性は、地理的位置によって異なります（例えば, Kim and Dale）、およびリグノセルロース原料原料は、構造および化学組成の両方に関してかなり不均一である（表1参照）。 この不均一性はプロセス設計に強い影響を与え、実質的にすべてのプロセスステップ、すなわち材料の機械的取り扱い、前処理条件、酵素および酵母株の選択、ならびに残りのリグニンの分離および特性に影響を及ぼす。 これは以下の議論で明らかになるでしょう。,

前処理

前処理の目的は、リグノセルロース構造を変化させ、主にセルロースの酵素加水分解速度 これは、発酵微生物を阻害する化合物の最小形成で行われるべきである。 アクセス可能な表面積は，酵素的セルロース分解の有効性に影響を与える最も重要な要因の一つと考えられている。, 天然木では細胞壁の毛管のごく一部分だけ酵素にとって入手しやすいです。 しかし，前処理はいくつかの方法で利用可能な面積を増加させ，ｉ）断片および亀裂が形成され，面積が増加する，ｉｉ）ヘミセルロース画分が加水分解され，遮蔽効果が低下する，ｉｉｉ）リグニンも構造変化を受け，木材は前処理技術に応じて様々な程度に脱リグニン化する。 したがって、リグニンによって引き起こされるミクロフィブリルの遮蔽および細孔の閉塞を除去することができる。, ＳＳＦ中の消化率に影響を及ぼすと考えられる他の因子は、基質結晶化度および重合度（ＤＰ）である。前処理方法は、物理的方法および化学的方法に分けることができ、これら二つの組み合わせが一般的に使用される（例えば、Mosier et al. ). 原料の種類は前処理方法の選択に強く影響する。 ヘミセルロースは、例えば、キシランに富む材料で高度にアセチル化される。, 酢酸は加水分解中に遊離されるので、これらの材料の前処理はある程度autocatalyticであり、より少ない添加酸およびより穏やかなプロセス条件を必要とする。 但し、解放されたアセテートはhemicelluloseの加水分解物の毒性に加えます。

アンモニア繊維/凍結爆発（AFEX）前処理は、高度に消化性セルロースを得る農業残渣の前処理のための魅力的な方法と考えられています。 AFEXはリグニンを解重合し、ヘミセルロースを除去し、セルロースを脱結晶化する。, 適当な温度およびpHはまた砂糖の低下プロダクトの形成を最小にします。 ただし、このメソッドから高コストのアンモニア、アンモニア回復しました。 この文脈では、水酸化カルシウム（またはナトリウム）に基づく石灰法も言及されるべきである。 アルカリ前処理を低温で長い滞留時間で行い，ＡＦＥＸ法ではバイオマスの脱リグニン化が得られた。

蒸気爆発は集中的に研究された前処理方法である。, バイオマスに対する未触媒水蒸気爆発および液体温水前処理の影響は，主にヘミセルロースの除去に起因する。 酸触媒を添加することにより、加水分解をさらに改善することができる。 H2SO4またはSO2を用いた希酸前処理は、その有効性および安価さのために最も調査された前処理方法である。 これらの方法は、パイロットプラントに適用されており、したがって、商業化に近いです。 酸によって触媒作用を及ぼされる処置はhemicelluloseの取り外しを改善し、セルロースの部分的な加水分解を与え、そしてリグニンの構造を変えます。, 主な欠点は、プロセス機器要件および阻害剤形成に関連する。 これまでのところ、アルカリ、AFEXおよび液体温水による成功した前処理は、農業残渣および草本作物に限定されていたが、酸触媒蒸気前処理は、これらの材料および針葉樹原料から高い糖収量を生成している。

蒸気前処理プロセスの厳しさの簡単な定量化は、いわゆる重大度係数log（R0）である。, This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., 酸触媒による前処理のために結合された重大度の要因、log(CS)は、時々使用されます。 これはまた、pHを考慮に入れ、log(CS)=log(R0)-pH、および針葉樹の酸触媒水蒸気爆発前処理の典型的な値は2-4の範囲である。

SSFプロセスにおける最適前処理条件は、リグノセルロース系バイオマスを利用したSHFプロセスのものと必ずしも大きく異なるわけではない。 しかしながら、酵素的加水分解を阻害する前処理加水分解物中に存在するいくつかの化合物は、発酵生物によって変換される。, これは、SHFと比較してSSFの高い報告されたエタノール収率の背後にある可能性のある説明です。 したがって、前処理からの阻害剤形成は、ＳＳＦプロセスにおいてより高い程度まで許容され得る。 抑制性化合物は、フラルデヒド、弱酸、およびフェノール類の三つの主要なグループに入れることができます。 二つの最も一般的なフラルデヒド、HMF（5-ヒドロキシメチル-2-フルアルデヒド）とフルフラル（2-フルアルデヒド）は、それぞれ、ヘキソースとペントースから厳しい条件, 酢酸、ギ酸、レブリン酸などのリグノセルロース系物質からの弱酸は、主にヘミセルロースまたはHMF分解の脱アセチル化によって形成される。 フェノール化合物は、主にリグニン分解の間に形成され、リグニンの種類に応じて、多数の変異体で見出されるべきである。 阻害に関するより詳細な議論については、例えば、Ａｌｍｅｉｄａらによるレビューを参照してください。

酵素的加水分解

成功した前処理は、加水分解のために利用可能なセルロースを残して、ヘミセルロースを大幅に除去しなければならない。, エタノール製造に最も一般的に使用される微生物は糖モノマーのみを利用するので、セルロースは加水分解される必要があり、SSFでは発酵と同時に起こる。 歴史的に、産業セルロースの消化力は酸の加水分解となされ、さまざまなlignocellulosic材料の酸の加水分解の最適化は目的を作り出すエタノールのために遂行され, しかし、酸加水分解は発酵微生物に対して比較的毒性のある加水分解物を生成し、最大グルコース収率は速度論的理由からバッチプロセスで約60％に制限される。 一方、セルロース画分の酵素的分解は、より高い糖収率を有する比較的無毒な加水分解物を得る可能性を有する。

βを分解するのに特化した酵素-1-4-グルカンのグリコシド結合は総称してセルラーゼと呼ばれる。 1950年、Reeseらは複数の酵素（C1およびCX）に基づく酵素セルロース加水分解のモデルを発表した。, 可溶化はCX酵素に起因していたが、C1酵素は、より短いポリアンヒドログルコース鎖を生成すると仮定された。 基本的に同じ画像が今日適用されますが、関与するすべての異なる特定の酵素成分についての知識に大きな進歩がありました。 セルラーゼは三つのサブカテゴリーに分けられ，エンドグルカナーゼ，エキソグルカナーゼ（セロビオヒドロラーゼ）およびβ-グルコシダーゼの三つのタイプの活性を表す。, エンドグルカナーゼは、主にセルロースの非晶質領域において、内部部分をランダムに攻撃することによって、基質の重合度を有意に低下させる。 一方、エキソグルカナーゼ（またはセロビオヒドロラーゼ）は、グルカン末端に結合し、主にセロビオース単位を放出することによって、グルカン分子を徐々に短くする。 最後に，β-グルコシダーゼは二糖セロビオースを二つの単位のグルコースに分割した。,いくつかのタイプの微生物は、好気性糸状菌、好気性放線菌、嫌気性高熱性細菌および嫌気性真菌を含むセルラーゼ系を産生することができる（例えば、Lynd et al. ). 過去数十年間の好気性糸状菌T.reeseiに関する集中的な研究は、現在産業セルラーゼ生産を支配している効率的なセルラーゼ生産生物をもたらした。すでに述べたように、SHFと比較してSSFの重要な利点は、加水分解において形成される糖による最終生成物阻害の減少である。, 発酵生成物エタノールはまた、加水分解を阻害するが、セロビオースまたはグルコースよりも少ない程度である。 別の利点は、前処理からの阻害剤が微生物によって代謝され得ることである。 しかし，ＳＳＦプロセスも固体リグノセルロース画分の不完全な加水分解を受ける可能性がある。 最終生成物または他の成分による阻害を除いて、これは酵素不活性化、非生産的な酵素吸着、鎖末端の可用性の低下、および前処理セルロースの変換による結晶性の増加によるものであり得る。,

工業用SSFでは、酵母および酵素生産のコストを最小限に抑えるために、酵素濃度および細胞濃度を適切にバランスさせる必要があります。 酵素間の相乗作用、例えば、エンド-エキソ相乗作用、エキソ-エキソ相乗作用、およびエンド-またはエキソグルカナーゼとβ-グルコシダーゼとの間の相乗作用もまた、酵素混mixturesの組成を調整することによって最適化されるべきである。 最適な組成は、リグノセルロース原料に最も確実に依存する。,

発酵微生物

エタノール生産に使用される生物に関する一般的な要件は、蒸留コストを低く保つために、高いエタノール収率、高い生産性を与え、高いエタノール濃度に耐えることができるということである。 これらの一般的な要件に加えて、阻害剤耐性、温度耐性および複数の糖を利用する能力は、ＳＳＦ用途に不可欠である。 低いpH価値の方の許容は汚染の危険を最小にする。, デンプンまたはスクロースベースのエタノール生産における作業馬は、一般的なパン酵母、Saccharomyces cerevisiaeです。 この生物は、高収率（最適条件で0.45g g-1よりも高い）および高い比速度（最大1.3g g-1細胞質量h-1）でエタノールを産生する。 それにまた非常に高いエタノールの許容があります、100g L-1上のある緊張および媒体のために報告されました。 さらに、生物は他の阻害剤に対して堅牢であることが証明されており、したがって、それはリグノセルロース系材料の発酵に適している。,広葉樹および農業残留物からのヘミセルロースは、典型的にはキシランが豊富である（cf. 表1）-草はアラビノキシランを含むのに対し、主にO-アセチル-4-O-メチル-グルクロノキシランを含む広葉樹。 一方、針葉樹のヘミセルロースは、主にガラクトグルコマンナンの形でより多くのマンナンを含み、より少ないキシランを含む。 マンノースの発酵はS.で普通有効です。, cerevisiaeは、ガラクトースを発酵させる能力は株依存性であり、ガラクトース利用のための遺伝子はさらに糖の典型的な逐次利用につながる、グルコースによって抑制されているのに対して。 明らかに、キシロース発酵は、針葉樹よりも農業残留物および広葉樹にとってより重要な問題である。 キシロースはキシリトールへのマイナーな減少から離れて野生タイプS.cerevisiaeによって、新陳代謝しません。 これ、およびいくつかの部分については、温度耐性が、ＳＳＦ中のリグノセルロース変換について他の微生物も試験する関心の背後にある主な理由であった。,ｐｉｃｈｉａｓｔｉｐｉｔｉｓやＣａｎｄｉｄａｓｈｅｈａｔａｅのような天然キシロース発酵酵母は，キシラン含量の高い材料のＳＳＦに使用するのに有利である可能性がある。 しかし，非酸化リグノセルロース加水分解物中の阻害化合物に対する耐性はかなり低く，さらに，効率的なキシロース発酵には非常に低くよく制御された酸素供給が必要である。 酵母に対する主な”競争相手”は、細菌Zymomonas mobilisおよび遺伝子操作された大腸菌であった。 Z., 酸化的りん酸化のための機能システムを欠いているモビリスは、主要な発酵産物としてエタノールと二酸化炭素を生成する。 興味深いことに、Z.mobilisは異化グルコースあたりの低いATP生産を与えるEntner-Duodoroff経路を利用しています。 これにより、S.cerevisiaeに比べてバイオマス収量が低く、グルコースに対するエタノール収量が高くなる。 しかし、野生型Z.mobilisはペントース糖を発酵させる能力を欠いており、大きな欠点は、それが非常に堅牢な生物ではないことさらにである。, 一般に、細菌は、リグノセルロース由来の阻害剤に対する耐性が低いように見え、発酵の前に解毒工程が必要とされ得る。 パン酵母やZ.mobilisとは対照的に、大腸菌は多種多様な基質（ヘキソース、ペントース、ラクトースを含む）を代謝することができるが、野生型生物は混合発酵経路を有し、したがって貧しいエタノール生産者である。 画期的な貢献では、米国特許番号5000000、eの株を受賞しました。, ｃｏｌｉはＺ．ｍｏｂｉｌｉｓからのＰＤＣ（ピルビン酸デカルボキシラーゼをコードする）とａｄｈｂ（アルコールデヒドロゲナーゼをコードする）の過剰発現によってエタノール生産者に遺伝子操作された。 優れた結果は、組換え大腸菌、例えばKO11株、86から理論の100％に近いエタノール収率を示している、とバガス、トウモロコシストーバーとトウモロコシの殻のヘミセルロース加水分解物に40グラムL-1までの最終エタノール濃度で達成されている。, しかし、報告された研究では液体画分のみが使用され、加水分解物は使用前に水酸化カルシウムでpH9に重ね合わせて解毒され、次いでHClでpH6.0–6.5に調整された。 さらに、最適pHは6.5であるため、大腸菌はT.reeseiセルラーゼによるSSFプロセスにはあまり適しておらず、一般に4.8前後のpHが最適であると考えられている。

設計されたS.cerevisiaeによるペントース発酵

Sの非常に魅力的な特性のために, cerevisiae産業発酵において、この酵母の組換えキシロースおよびアラビノース発酵株を設計するために過去数十年にわたって重要な努力がなされてきた。 Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのキシロース発酵株は，主に細菌および真菌からキシロースイソメラーゼ（ＸＩ）をコードする遺伝子を導入するか，または真菌からキシロースレダクターゼ（ＸＲ）およびキシリトールデヒドロゲナーゼ（ＸＤＨ）をコードする遺伝子を導入することによって構築できる。 また、キシルロキナーゼ（XK）をコードする内因性XKS1遺伝子は、重要なキシロース発酵を得るために過剰発現する必要があります。, 輸送タンパク質は、酵母中のキシロースおよび他の糖の取り込みに必要である。 S.cerevisiaeでは、キシロースはヘキソーストランスポーターによって輸送されることが判明しているが、キシロースに対する親和性はグルコースよりも約200倍低い。 その結果、キシロースの取り込みが競合的に阻.

糖輸送関連タンパク質をコードする20の異なる遺伝子、18の個々のシステム（Hxt1-17とGal2）と二つの関連シグナルタンパク質（Snf3pとRgt2p）があります。, トランスポーターは糖に対して異なる親和性を示し、それらの対応する遺伝子の発現は糖濃度、すなわち炭素源の利用可能性によって調節される。 これまで、キシロースはグルコース輸送体の高親和性と低親和性の両方によって取り込まれることが示唆されてきました（図2）が、低グルコース濃度の存在下で取り込みが増加することが示唆されてきました。 研究は、高および中間親和性ヘキソーストランスポーターを示している;Hxt4、Hxt5Hxt7とGal2は、実際にはキシロースのための最も重要なトランスポーターです。, さらに、効率的なキシロース取り込みのためには、低い（しかし非ゼロ）グルコース濃度が培地中に必要であることが示されている。 これは解糖酵素および中間体の発現のためのグルコースの必要性、ならびにキシロース代謝およびペントースりん酸経路の初期段階のための中間代謝物の生成によって説明されている。 実験とコンピュータモデリングの両方から推測される別の可能な説明は、グルコースが良好なキシロース輸送特性、例えばHxt4を有するヘキソーストランスポーターの発現に必要であることである。, したがって，組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅとのＳＳＦ中のキシロースとグルコースの効率的な共発酵（ＳＳＣＦ-同時糖化と共発酵）を得るためには，最近のＳＳＦ研究で実際に示されているグルコース濃度を低く保つ必要がある。