Madame Lelica

真正細菌には、lon、HslUV（ClpQY）、ClpXPおよびFtsHの四つのファミリーがあります。 これらの五つに加えて、HtrA（DegP）はペリプラズム/分泌タンパク質分解複合体であるが、原核生物プロテアソームは放線菌にのみ見出される。 各プロテアーゼの病因における構造，機能および役割は以前にレビューされている。,13、17これらの複合体のいくつかは、Lon、18ClpXP、19HtrA20およびプロテアソームを含む潜在的な抗菌標的として検討されている。これらの21、ClpXPは最も広く調査され、天然産物の抑制剤がこれまでに見つけられた唯一の複合体です。

clpタンパク質分解複合体

ClpPsは、ほとんどの細菌種でよく保存されており、タンパク質のターンオーバーに重要な役割を果たしています。, タンパク質の恒常性とミスフォールドタンパク質の分解に加えて、ClpPはまた、転写レギュレータを標的とし、プロテオームのリモデリングによって多数の調22、23、24、25確かに、ClpPは、細胞分裂、ストレス耐性、病原性、形態学的分化および抗生物質耐性などのプロセスを調節する上で重要な役割を有することが見出されている。これらのプロセスにおける22、23、24ClpPの役割は、触媒部位へのアクセスを制限することによって達成するタンパク質基質の厳密な選択に依存する。, それぞれのClpP錯体は、二つのヘプタメリック環を積み重ねてテトラデカマーを作ることによって形成される（図2）。26形成されたチャネルには、軸方向の開口部を通過せずにアクセスできない14のセリンプロテアーゼ触媒部位が収容されている。 さらに、apo-ClpPは、その触媒トライアドがずれている不活性、圧縮配座を採用しています。27コンフォメーション活性化と軸方向の開口部へのアクセスを制御することは、AtpaseのAAA+スーパーファミリーのHsp100タンパク質である：グラム陰性細菌のClpAまたはClpXおよびグラム陽性のClpCまたはClpX。, これらのアクセサリーatpaseは、疎水性ポケットに収まるトリペプチド（L/I）GFモチーフを使用してテトラデカマーの軸面を結合する六量体リングを形成する。28この疎水性ポケット内の結合は、二つの方法でClpP活性を調節する：まず、タンパク質基質を介して、第二に、整列した触媒トライアドとアクティブな、拡張されたコンフォメーションで複合体を安定化することによって。, AAA+Atpアーゼは、直接または協力アダプタータンパク質を介してタンパク質標的と相互作用し、ATPによって提供されるエネルギーを使用して基質を展開し、エネルギーに依存しない方法で加水分解される中央細孔に供給される。 として折り返しタンパク質そのもの入力チャンネルにこれらのAAA+パートナーを密に調節するタンパク質の基板ターゲットされており、これらはdegredation.28

大腸菌、枯草菌および黄色ブドウ球菌を含むほとんどの細菌種は、それらの関連するAAA+Atpアーゼとともに、細胞生存能力にとって必須ではないclpP遺伝子25、29、30、31、32それにもかかわらず、これらの種におけるclpP欠失は、リネゾリドおよびリファンピシンなどの抗生物質に対する感受性を増加させ、Listeria monocytogenesおよびs.aureusなどの病原体における病原性を低下させることが観察されている。,23、ClpXP欠損株における病原性の33損失は、黄色ブドウ球菌におけるsar/agr規制ネットワークなどのグローバルな病原性転写因子レベルの主要な摂動にリン23興味深いことに、これらの病原性調節因子のいくつかに対するClpP不活性化の効果は、株依存性であるように見え、さらに、ClpXP機能を欠損したいくつか,34、35、36

ほとんどの細菌とは対照的に、clpPの二つ以上のコピーは、放線菌およびシアノバクテリアに見出され、少なくとも一つの機能コピーは、生存率のため37,38結核菌では、clpP1およびclpP2がオペロンを形成し、両方の遺伝子が不可欠である。 これらのアイソフォームは、ClpP1とClpP2ホモヘプタマーをヘテロテトラデカマーに積み重ねることによって機能的なプロテアーゼを作成するために協力37、39M.tuberculosisにおける四つのAAA+Atpaseのうち、ClpXおよびClpC1は生存率に不可欠である。,40,41

細胞生存率と病原性におけるその役割を考えると、ClpPシステムは、規制緩和のための三つの可能なメカニズムを持つ新規抗菌のための有望なターゲットである（図2）：ClpPタンパク質分解の阻害、ClpPタンパク質分解の活性化またはパートナーAA+Atpアーゼの摂動。

ClpP阻害剤

おそらく、ClpP系を標的とするための最も明白なアプローチは、ClpPの活性部位阻害剤を開発することである。 この作用様式の原理の証明は、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌およびLにおいて実証されている。, clppノックアウトが皮膚感染膿瘍、肺感染またはin vivoマクロファージ寄生をそれぞれ引き起こすことができないmonocytogenes。22,42,43この病原性の喪失は、黄色ブドウ球菌における細胞外プロテアーゼ、リパーゼ、Dnaseおよびα-溶血素の活性低下、およびL.monocytogenesにおけるα-リステロリシンおよびリステリアルホスホリパーゼの活性低下と関連している。

ClpPを標的とするböttcherとSieber44の先駆的な努力は、一連のβ-ラクトン阻害剤の開発につながった。, 自然界に見られるβ-ラクトンの反応性に触発され、彼らはいくつかの細菌プロテオームに対してスクリーニングされたアルキンタグ誘導体（例えば、ラクトンD3;図3a）のライブラリを合成した。 アルキンタグ上のClick chemistryを使用して、蛍光色素を付着させ、反応性酵素の同定を可能にした。 このようにして、ClpPは、その活性部位Ser98とβ-ラクトンとの間に共有結合付加体を形成し、それによって不可逆的にタンパク質分解活性を阻害する極めて特異的な標的として同定された（図3b）。,44その後のキャラクタリゼーションは、それぞれ、黄色ブドウ球菌およびL.Monocytogenesにおけるα-溶血素およびリステロリジンを含む病原性因子活性を低下させるβ-ラクトンの能力を示した。45,46病原性因子のこの減少は、最適化されたβ-ラクトン足場（U1;図3a）の能力と相関して、皮膚膿瘍モデルにおける皮下投与後の黄色ブドウ球菌の感染およびマクロファージにおけるL.monocytogenesの成長を有意に減少させる。46、47さらに、β-ラクトン誘導体（化合物7；図3a）は、Mに入ることができる化合物の特権群の一つであることが判明した。, 結核は効果的に28μg ml−1.48のMICとの成長を最終的に禁じるために、しかし、それ以上の臨床開発を妨げる環状エステルの急速な加水分解による低い血

最近では、Sieberとcolleagues49は、強力なClpP阻害剤の新しいクラス、フェニルエステル（AV170;図3a）を発見しました。 Clppの活動のためのfluorogenic試金の137 000の総合的な混合物の公平なスクリーンを使用して発見されて、フェニルエステルはβラクトンとSer98の同じ共有結合, 興味深いことに、いくつかのエナンチオマーはまた、ClpPテトラデカマーの脱オリゴマー化を七量体に引き起こすことができ、セリン触媒トライアドの立体配座制御がClpPの七量体の形で不活性であることを考えると、有利な作用様式である。 フェニルエステルはβ-ラクトンに対するプロテアーゼ阻害の効力を改善したにもかかわらず、それらの抗毒性活性は、α-溶血素産生を減少させ、廃止することができないため、減少する（図3c）。 効力を高めるための努力は、安定性と反応性の間のトレードオフを明らかにした。,49

ClpP阻害は作用機序として約束を示しているが、新規足場のさらなる開発と発見が明らかに必要とされています。 さらに、特定のclpPノックアウト株における薬剤耐性の最近の証拠を考えると、34、36この経路を下るいくつかの注意が保証されるかもしれない。

ClpP活性化剤

ClpPプロテアーゼ系の活性化は、特に興味深い治療選択肢である。 細胞内のプロテアーゼの認刻極印はターゲット蛋白質の低下を離れて避ける活動の厳密な規則です。 真核生物では、これはしばしば細胞小器官における区画化によって達成される。, 一方、細菌を開発してい密制御タンパク質複合体の制御プロテアーゼ活動です。 タンパク質分解活性を活性化してタンパク質を無差別に分解することにより、ClpPが必須である種だけでなく、ClpPが不要である種でも細胞死を引き起こすことができる。 理論的には抵抗性を付与しながら、ClpPの活性を廃止する突然変異は、ClpPが必須である細胞では致命的であり、ClpPが不要である細胞では病原性を損なう。, 最後に、その標的の阻害よりもむしろ活性化による前例のない作用様式は、そのような薬物が休眠持続細胞に対して有効であることを可能にし得る。

このユニークな作用機序の原理の偶然の証明は、アシルデプシペプチド（ADEPs;図4a）の発見によって報告された。 ADEPsは1985年に特許で”A54556複合体”として初めて記載され、Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50ClpPによって産生された八つの密接に関連する化合物のグループが2005年にBrötz-OesterheltらによってADEPの分子標的として同定された。,51adep耐性大腸菌株に逆ゲノミクスを適用して、耐性決定因子をclppの突然変異として同定し、それを不活性にした。 ＡｄｅｐｓはＣｌｐｐを活性化し，不適切な蛋白質分解を引き起こすことを示唆した。 確かに、蛍光ペプチドの切断とin vivoプロテオーム分析を測定するin vitro研究では、ADEP活性化B.subtilis ClpPはAAA+規制またはATP加水分解の独立したタンパク質を分解することができたことを確認した。,51

この調節の喪失に関する洞察は、大腸菌、枯草菌、結核菌および髄膜炎菌からのADEP活性化ClpPの結晶構造によって提供されている（図4b）。52、53、54、55ADEP分子は、AAA+Atpアーゼによって使用される同じ疎水性ポケット内のClpPテトラデカマー中の各モノマーに結合し、それによってそれらの相互作用を阻害する（図4d）。,52、55、56バインディングは、セリン触媒トライアドのアライメントとClpPモノマーの剛体回転を誘導し、大腸菌で10-12Åから20Åの軸孔を広げ、ClpPのATPaseのコンフォメーションコントロールを模倣する。27、52、55ゲーティング機構はまた、ADEP結合上の下方配座または閉鎖配座から上方配座または開いた配座に移動するN末端ドメインによっても提供される。,52、55ADEPの活性化は、安定に折り畳まれたタンパク質を分解することはできませんが、ClpPの軸方向の内腔に入るにはまだ大きすぎるため、不安定なタンパク質やリボソームから出てくる新生鎖を分解することはできません。57細胞死は、この無差別な分解および正常なClpP機能の阻害の結果であると考えられている。

ADEPsは、臨床的に関連するメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（MRSA）、バンコマイシン耐性腸球菌およびペニシリン耐性菌を含むグラム陽性細菌の範囲に対, pneumoniae、ならびにグラム陰性病原体N.meningitidisおよびNeisseria gonorrheae。51、54半合成ADEP誘導体は、リネゾリド、51よりも優れた活性を有するマウスおよびラットモデルにおける腸球菌faecalis、s.aureusおよびs.pneumoniaeに対して有効であり、マウス周縁炎モデルにおけるMRSAに対する活性はバンコマイシンよりも優れている。58特に、ADEPsに対する耐性は、これらの細菌種において、非必須であるClpPの機能を低下させる突然変異によって10-6という高い頻度で発症する。, それにもかかわらず、利点としてclpP変異体の減少したフィットネスを使用して、ADEPとリファンピシンの併用療法は、in vitroでバンコマイシン耐性MRSA集団を完全に根絶することが示されている。59

さらに有望なのは、adepsがpersister細胞を排除する能力である。59コンロン他59は、ADEPがシプロフロキサシン治療後に残った固定相s.aureusとpersister s.aureusの両方を効果的に殺したときに最初にこの特性を説明しました。 この知見は、薬物耐性結核菌の持続によって引き起こされる潜伏性結核感染症に対するADEPsの使用に意味を持つ。, 今日まで、結核菌に対する活性は記載されていないが、ADEPsは、二つの流出ポンプ阻害剤、レセルピンおよびベラパミルと組み合わせると結核菌の成長を遅らせることが示されている。39

ADEPsは、薬物候補のための有望なリードであるが、彼らは貧しい水溶性、迅速な全身クリアランスおよび化学的不安定性を含む好ましくない薬理学的性51,60ADEPsの作用機序の発見に続いて、より安定で強力なadep誘導体を開発するために、Bayer AGによって医薬化学SARプログラムが開始されました。, この取り組みにより、adep4は非常に強力なADEP1誘導体であり、PheはClpPとH結合を形成すると考えられる3,5-ジフルオロフェニルアラニンに置き換えられ、アシルポリエンはα、β-不飽和ヘキセノイルテールに置き換えられ、安定性を改善し、N-ミアラはADEPの剛性を高めるピペコラートに置き換えられた。60Adep4の活性はCarneyらによってさらに改善された。61SerをAllo-Thrに、Pipを4-MePipに置き換えることにより、ADEPをさらに剛性にする。, 1H NMRを用いて水素-重水素為替レートを定量化することにより、ADEP分子の剛性化は、それによってClpPへの結合のエントロピーコストを削減し、経アンニュラH結合を強化することが示された。 カーニーのADEP誘導体は、グラム陽性病原体に対して600-1200倍のADEP1よりも大きな効力を有する。61

これらのADEP誘導体の効力の増加にもかかわらず、それらはまだグラム陰性細菌に対する活性が限られており、特に結核菌において活性流出によ,39、62他の多くの合成化学の努力は、これらの制限を克服するためにモチーフを探求してきたが、ほとんどが減少した活性をもたらした（図4c）。54, 63, 64, 65, 66, 67 その疎水性ポケット内のADEPの親密な結合を考えると、この結果はおそらく予測可能であり、ADEP足場の修飾が行き詰まりに達している可能性があることを示唆している。

新しいClpP活性化剤を同定するために、二つのハイスループットスクリーンが搭載されている。65、68ともにeの小分子活性化剤を同定した。, ｃｌｐｐのモデル基質であるフルオレセインイソチオシアネート–カゼインの開裂による蛍光の増加を測定するｉｎｖｉｔｒｏアッセイを用いて，ｃｏｌｉ Ｃｌｐｐを測定した。 最初に、Leung et al.65スクリーニング60 000薬物様合成化学物質、ACP1-5と呼ばれる五つの化合物を同定する図4a。 これらの化合物の最も活性は10-20倍ClpPを活性化する際にADEP1よりも少ない強力であり、透過剤の存在下でも適度な抗菌活性しか表示されなかった。 ラヴィー他,68代わりに、>20 450の真菌および細菌抽出物または代謝産物をスクリーニングし、単一のClpP活性化剤であるsclerotiamideを同定した（図4a）。 このパラヘルクアミド関連インドリノン73倍EcClpPの活性化でADEP1よりも少ない強力だったし、流出欠乏大腸菌または緑膿菌の成長を阻害することができませんでした。

ACPsおよびsclerotiamideの限られたefficaciesにもかかわらず、これらの研究は誘導体化のための新規足場を提供し、ClpP活性化剤を識別するために、将来の研究への扉を開, 例えば、Ｃｌｐｐ上の代替活性化結合部位を同定することを想像することができる。 Ｃｌｐｐの調節は，ＡＡＡ＋Ａｔｐアーゼ会合時の細孔の広がりによる基質進入の制御だけでなく，テトラデカメータへのオリゴマー化によるセリン触媒部位の形成も含む。69おそらく、ClpPをヘプタマーとして維持しながら活性部位形成を誘導する小分子は、無差別基質によってこの活性部位への容易なアクセスを可能に,

AAA+ATPase uncouplers as therapeutics

ClpPはAAA+Atpaseに依存してタンパク質基質を選択して展開するため、これらのパートナーの摂動もClpPタンパク質分解系を規制緩和することができます。 特に、これは、ClpC1およびClpX Atpアーゼが細胞生存能力に不可欠である結核菌においても当てはまる。40、41確かに、これまでに特徴付けられたClpC1を標的とする三つの化合物のそれぞれは、抗結核菌活性のための天然産物の抽出物をスクリーニングす, これらの発見の最初のものは、海洋細菌Streptomyces spによって産生される環状ヘプタペプチドであるcyclomarin A（cymA）である。 CNB-982図5a。70それは癌細胞に対して細胞毒性の有効な炎症抑制のエージェントとして1999年に記述されていたが、M.tuberculosisに対する活動が天然産物の全細胞スクリーンの間に発見されたこと2011年までなかった。71cymAの分子標的を同定するための最初の試みでは、逆ゲノミクスのアプローチが取られた。 しかしながら、自発的な抵抗性Mの後には。, 結核変異体が回復し、アフィニティクロマトグラフィーした代わりに用いることを示cymA目標ClpC1高い特異性が挙げられる。 ClpC1のN末端ドメインとcymAのその後の共結晶化は、結合のための重要な残基を同定し、自発的な耐性変異体を生成することができないにもかかわらず、cymAに対する耐性を付与するClpC1変異体の作成を可能にした。72

2014年、Nonomuraea spからの大環状トリデカペプチドであるecumicin。, MJM5123、73およびラソマイシン、Lentzea kentuckyensis spからの16員の投げ縄ペプチド。、74はいずれも粗放線菌抽出物をスクリーニングすることにより単離した（図5a）。 ClpC1のN末端ドメインは、自発的な耐性変異体の逆ゲノミクスによってこれらの化合物の分子標的として同定された。 CymA、ecumicinとlassomycinは共通の標的を共有しているにもかかわらず、構造的特性評価と各化合物に対する抵抗性を付与する突然変異の位置は、それぞれがClpC1のN末端ドメイン上でわずかに異なる位置に結合することを示唆している（図5b）。, 例えば、cymAおよびecumicinとは対照的に、lassomycinは非常に塩基性であり、いくつかのArg残基を含み、ClpC1.74

CymA、ecumicinおよびlassomycinは、他の抗酸菌種の範囲、および多剤耐性結核菌の複 重要なのは、それらは非複製性結核菌に対しても活性であることである。 ＡＡＡ＋Ａｔｐアーゼの必須性の欠如と一致して，それぞれがｓ．ａｕｒｅｕｓおよびｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのような他のグラム陽性およびグラム陰性種に対する活性を欠いている。, 彼らはまた、ヒト微生物叢の共生的なメンバーに対する活性を欠いているので、この特異性は、利点を有する。

結核菌の細胞死を引き起こすために、エクマイシンとラソマイシンはＡｔｐアーゼ活性を刺激するが、タンパク質分解からそれを切断するように見える。73、74このようにして、天然基質の分解が阻害され、結核菌におけるClpP阻害剤および活性化剤の両方の作用と同様に、それらの蓄積および毒性をもたらす。, エクミシンとラソマイシンとは対照的に、cymAはcymAとのインキュベーションでClpC1を標的とLeuAspAspトリペプチドタグ付き緑色蛍光タンパク質蛍光の減少によって示されるように、タンパク質分解を増加させることが示唆されている。71しかし、この蛍光の減少は、clpc1ではなく、分解によって展開する緑色蛍光タンパク質の結果である可能性があり、cymAは、したがって、エクミシンとラソマイシンと同じアンカップリングメカニズムを持っている可能性があります。, これらの薬物の作用機序については、タンパク質の展開に及ぼす影響、例えばClpP1P2との相互作用を阻害することによってATPase活性がどのように刺激され、タンパク質分解が阻害されるかなど、いくつかの疑問が未解決のままである。 さらに、最近発見されたさらに別のClpC1阻害剤、ルフォマイシンアナログRUF-I.75

結核菌に対するcymA、エクマイシンおよびラソマイシンの比較的高い効力にもかかわらず、薬理学的特性の最適化が必要である。, 例えば、cymAはマウスの肝臓の整理そして短い半減期を表わし、ecumicinに容解性および悪い腸の吸収が限られています。13,73最近の総合成と発酵の最適化は、これらの開発に役立つかもしれません。76、77、78

ClpC1を標的とする薬物は、抗結核菌治療薬の興味深い可能性であるが、一般的に放線菌以外の種に対する殺菌活性を有していない。, Ｃｌｐｐおよび関連するＡＡＡ＋Ａｔｐアーゼが不要であるこれらの種では、これらのＡｔｐアーゼを標的とすることは、Ｃｌｐｐ阻害剤で観察されたものと同様の抗毒性効果を有 しかしながら、そのような化合物は、Ｃｌｐｐに対する直接的な作用と同様に広範な効果を有するために、複数のＡｔｐアーゼパートナーを標的とすることができる必 これらの潜在的な抗毒素効果は、cymA、ラソマイシンまたはエキュマイシンについて調査されていない。,

特異性を達成する

細菌のタンパク質分解複合体の、HslUVを除くすべてがヒトオルソログを持っており、多くは実際に激しく潜在的な抗癌標 例えば、ミトコンドリアプロテアーゼLONP1、ClpXPおよびm-AAA（FtsHホモログ）は、特に呼吸ストレス中に、ミトコンドリアの品質管理において重要な役割を果たす。M-AAAの79変異はまた、痙性対麻痺、遺伝性神経変性疾患に関与しています。80したがって、抗菌剤がそれらの細菌相同物を特異的に標的とすることができることが不可欠である。,

自殺基質として作用することを目的とするプロテアーゼ阻害剤の場合、保存された触媒機構のために特異性を達成することは困難であり得る。 実際、特異性の欠如は、原核生物プロテアソームおよび細菌Ｌｏｎプロテアーゼの両方の阻害剤を開発するための努力において遭遇している。 それはin vitroでの成長のために不要であるが、一酸化窒素stress81とマウスの持続性の生存のために不可欠であるとして、結核菌の原核生物プロテアソームは、,62,82通常はペプチジルエポキシケトン、アルデヒドまたはホウ酸塩として、マイコバクテリアプロテアソームに対する薬物を開発するための多くの試みがなされているが、ほとんどはm.tuberculosisのそれよりも哺乳動物プロテアソームをより強力に阻害する。83選択性は、しかし、オキサチアゾール-2-one化合物GL5およびHT1171の発見によって示されるように、前例のないではありません（図6）。 これらの化合物は、非複製Ｍに対して殺bacterである。, 結核は、硝酸oxide21の亜阻害レベルで治療し、持っている>1000倍ヒトプロテアソーム上のマイコバクテリアに対する活性を増加させました。 特異性は、哺乳動物プロテアソームで保存されていない活性部位の外側の残基と薬物との相互作用によって与えられると考えられる。21

Lonはまた、バイオフィルム形成、運動性およびストレス耐性に関与しており、変異体はSalmonella enterica serovar Typhimurium、Actinobacillus pleuropneuoniae、Vibrio choleraおよび緑膿菌におけるコロニー形成および病原性を減少させることが示されているため、有望なターゲットになる。84、85、86、87細菌Lon阻害剤を同定するために、これまでの唯一の努力では、プロテアソーム阻害剤は、in vitroでスクリーニングされ、ペプチジルボロン酸MG262が同定,18しかし、この化合物はまだ2000倍20Sプロテアソームに対してより強力です。18オキサチアゾール-2-one化合物と同様に、ヒト相同体に発散残基を利用することは、非常に特異的なLon阻害剤を開発するために必要とされる可能性が

特異性はまた、プロテアーゼ機能を乱すが、ヒトおよび細菌オルソログの間で不十分に保存されている結合部位に触媒活性部位の外に移動することによって達成することができる。 ADEPsは、このアプローチの可能性を適切に示しています。, それらはヒトClpP（hClpP）で直接試験されていないが、ADEPsは25μg ml-1までのヒト細胞に対して無毒であり、ヒト酵素に対する親和性が低いことを示唆している。58大腸菌（EcClpP）とhClpPの構造比較は、この概念をサポートしています。 それらのバックボーン構造はほとんど保存されており、二乗平均平方根偏差は0です。,63Å;88しかし、ADEP結合に使用される疎水性ポケットの検査は、hClpPがドッキング溝の遠位部における電荷反転（Glu56Lys）とともに、その疎水性（Asn55Pro、His60TyrおよびHis112Phe）を減少させるいくつかの置換を有することを示している。 これらの変更により、HCLPPでのADEPバインディングが妨げられる可能性があります。 しかしながら、Ｅｃｃｌｐｘは、Ｅｃｃｌｐａではないが、ｈｃｌｐｐを活性化することができることに留意すべきである。88いずれにせよ、保存されていない調節部位に結合する薬物を探索することは、非常に特異的な抗菌剤を見つけるための鍵となる可能性がある。