材料と方法
マウスによるライディッヒ細胞機能の変調。
野生型C57BL/6マウスは、Charles River Laboratories（Wilmington、MA）から入手した。 PDE8A KOマウスは、最初にDeltagen,Inc.によって製造された。 （サンカルロス、カリフォルニア州）ファイザー株式会社との契約に基づく。 （ファイザーグローバル研究開発、サンドイッチ、英国）。 その後、ワシントン大学でC57BL/6マウスに10世代にわたって飼育された。 報告された実験のために、年齢の6と8週間年齢マッチングマウスを使用しました。, すべての手続きに使用承認された資委員会(験のワシントン大学に従い、米国国立衛生ガイドケア、実験動物を用いた.
リアルタイムPCR。
精巣cDNAは、野生型およびPDE8A-ヌルマウス精巣からの全RNAから、SuperScript IIIおよびOligo dT（Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA）を用いて調製した。 リアルタイムＰＣＲは、Power SYBR green master mix(Applied Biosystems,Foster City,CA)を使用して行った。, 標的化カセットの下流の領域に向けられたPDE8A用のプライマー（IDT、Coralville、IA）は、以下の通りであった：前方プライマー、GCCACAGAAATGACGAAGC（エクソン19）；逆プライマー、ATGTCTTTCCAGACTTCTGTCAGG（エクソン20）。 ヒポキサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼのプライマーはフォワードプライマー ATTATGCCGAGGATTTGAA;リバースプライマー,CCCATCTCCTTCATGACATCTであった。
In Situハイブリダイゼーション。
リボプローブ合成のためのテンプレートは、マウスPDE8A配列を含むプラスミドを用いてPCRによって得られた。, 特に、マウスPDE8A（エクソン17-20）の3’領域は、次のプライマーを用いて増幅された：フォワードプライマー、AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCTTTCCAG（下線T3ファージRNAポリメラーゼプロモーター配列）;逆プライマー、TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT（下線T7ファージRNAポリメラーゼプロモーター配列）。 ＰＣＲ産物をアガロースゲルから単離し、ゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）で精製した。, 35S標識リボプローブは、テンプレートとしてT3とT7ファージRNAポリメラーゼプロモーターサイトを含むPCR産物を使用してMAXIscript T3/T7キット（Ambion、Austin、TX）とin vitro転 In vitro転写は、それぞれ、センスまたはアンチセンスリボプローブを得るために、20μlのutp（PerkinElmer、Boston、MA）とT3RNAポリメラーゼまたはT7RNAポリメラーゼの5μlを含む反応混
精巣を野生型およびPDE8A KOマウスから解剖し、ドライアイス上のTissue-Tek O.C.T.compound（Sakura、Torrence、CA）で急速に凍結した。, セクション（20μm）は、クライオスタットで切断され、スーパーフロストプラスマイクロスライド（VWR Scientific、West Chester、PA）に取り付けられ、空気乾燥された。 セクションを室温で4％パラホルムアルデヒドで15分固定し、0.25％無水酢酸で0.1mトリエタノールアミン（pH8.0）で10分間処理し、傾斜エタノールシリーズ（30、60、80、95、および100％）を通して脱水した。 次いで、切片を湿ったチャンバー内のハイブリダイゼーションバッファーで60℃で4時間インキュベートした。2×SSC（標準生理食塩水クエン酸塩;1×SSC=0.15M塩化ナトリウム/0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7ですすいだ後。,2)の部分が脱水によるエタノールの傾斜シリーズです。 ハイブリダイゼーションは、35s標識アンチセンスまたはセンスプローブ（40pg/34,000-38,000cpm/μl）を含むバッファーで60℃で一晩湿潤室内のプラスチックカバースリップ カバースリップを穏やかに除去し、切片を2×SSC含有10mM DTTで30分間二回60℃で洗浄した後、切片を30分間37℃で20μg/ml RNaseAと0.5m NaCl、10mM Tris·HCl(pH7.,5)、および1mM EDTAを、次いで50%ホルムアミドで洗浄し、2×SSC10MM DTTを含む30分間60°Cで、1×SSC10mM DTTを含む30分間60°Cで、さらに0.1×SSC10mM DTTを含む30分間60°Cで最後に、切片をエタノール(70、95、および100%)で脱水し、空気乾燥し、BioMax XARフィルム(Eastman Kodak,Rochester,NY)上に9時間露光した。PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るために、PDE8A mRNAの細胞分布を見るためハイブリダイゼーショ, スライドはhematoxylineと開発され、固定され、そしてcounterstained、そしてカナダのバルサム（Sigma-Aldrich）で取付けられた。
PDE8A免疫沈降およびアッセイ。
マウス精子は、スイムアウト法（38）によって精巣上体尾から単離され、1％Nonidet（Roche Applied Science、Indianapolis、IN）、1mM EGTA、20mM DTT、0.2mM PMSF、1mMパラアミノベンザミジン、およびシグマプロテアーゼ, ホモジネートをマイクロセントリファージ中で5分間遠心分離し、200-μlのアリコート（106精子に相当）を、20μlの1：1スラリーのプロテインG-アガロースビーズ（Santa Cruz Biotechnology Inc. PDE8A抗体の存在下または非存在下での（1:100、121-AP；Fabgennix、Frisco、TX）。 次の日、免疫沈降物をPBSで三回洗浄し、次いで、文献のように10nM cAMP基質、40mM Mops（pH7.5）、15mM Mg-酢酸、2mM EGTA、および0.2mg/ml BSAの存在下でPDE活性をア 39.,
免疫組織化学。
新たに凍結したマウス精巣をTissue-Tek O.C.T.化合物に埋め込み、スライスあたり20μmのクライオスタット上で切断した。 組織切片または単離されたライディッヒ細胞を乾燥させ、室温で4％（wt/vol）パラホルムアルデヒド/PBS（pH7.4）に10分間固定し、PBSで三回洗浄した。 スライドをブロッキングバッファー（5％ロバ血清、1mg/ml BSA、および0で予めインキュベーションした。,1%Triton X-100in PBS)室温で1時間、抗PDE8A抗体(200μl,1:100,C-15;Santa Cruz Biotechnology)1%donkey血清、1mg/ml BSA、および0.1%Triton X-100を含むPBSで一晩4℃でインキュベートし、0.05%Tween20を含むPBSで20分間三回洗浄し、donkey抗ヤギAlexa546(200μl,1:500;Invitrogen)1mg/mlを含むPBSでインキュベートした。bsaおよび0.1%triton x-100を室温で2時間洗浄した。, スライドをさらに室温で5%ヤギ血清を含む遮断緩衝液で1時間インキュベートし、シトクロムP450側鎖切断酵素(CYP11A)抗体でインキュベートした(200μl,1:250;Chemicon International Inc.、Temecula、CA）を4℃で一晩、0.05％Tween20を含むPBSで20分間三回洗浄し、上記のようにヤギ抗ウサギAlexa488（1:500；Invitrogen）とインキュベートした。 最後に、切片をTO-PRO-3(1:1000;Invitrogen)でPBS中で5分間対染色し、洗浄し、SlowFade Gold antifade試薬(Invitrogen)中に取り付けた。, PDE8A抗体特異性を試験するために、抗体溶液を2.5μg/ml抗原ペプチド（Santa Cruz Biotechnology）で室温で2時間前に染色した。 二次抗体による背景を決定するために、いくつかの切片を一次抗体なしでインキュベートした。 免疫染色シグナルを共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＳＬ；Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．、バノックバーン、イリノイ州）。 標的化カセット中のＬａｃｚ遺伝子による核局在シグナルで発現するβ-ガラクトシダーゼ活性をＸ-ｇａｌ染色により評価した。, セクションは、最初の色の開発のための抗ウサギアルカリホスファターゼコンジュゲート（1：500;Invitrogen）とNBT/BCIP（ロシュ）に続いて抗CYP11A抗体でインキュベートしました。 次いで、x-gal染色を、(40)記載のようにして、x-gal混合物中で一晩37℃で行った。 切片を洗浄し、グリセロール／トリス緩衝生理食塩水で取り付けた。
ライディッヒ細胞精製。
leydig細胞を、文献に記載されているように単離した。 41. 簡単に言えば、成体マウスからの精巣を脱カプセル化し、34℃の振盪水浴中で10分間、10mlの培地199（M-199）に0で分散させた。,25mg/mlコラゲナーゼD、35mU/mlディスパーゼII、および6μg/ml DNase I.組織分散液を終了するために、40mlの1%BSAをM-199培地に15mM Hepes、4mM重炭酸ナトリウム、および25μg/mlの大豆トリプシン阻害剤を添加して元の懸濁液を希釈した。 その後、チューブをキャップし、数回反転させた。 精細管を重力によって沈降させ、間質細胞を含む上清を回収した。 この手順を二回繰り返して間質細胞をさらに採取した。, 細胞を50mlチューブ中で800×gで20分間遠心分離することによって4℃でペレット化し、連続パーコール（GE Healthcare、Piscataway、NJ）勾配（55mM Hepesおよび25μg/ml大豆トリプシン阻害剤でバッファリングされたHBSS中のパーコール）を35mlの総容積で用いて分画した。 勾配は、JA-20固定角度ローター（Beckman Coulter、Fullerton、CA）で23,700×gで30分間遠心分離によってその場で形成された4℃で密度マーカービーズ（GEヘルスケア）を含むチューブは、異なる密度層を識別するための参照として使用された。, Leydig細胞を、勾配の底まで1.07g/mlの密度で開始して回収した。 パーコールを希釈するためにHBSSの五ボリュームを加え、細胞を200×gで10分間4℃でペレット化し、ライディッヒ細胞に富んだ二つの精巣から得られた最終ペレットを4mlのDMEM/F-12に1%BSAを補充し、実験に直ちに使用した。
3β-ヒドキシステロイドデヒドロゲナーゼアッセイ。
テストステロン産生の測定。
Leydig細胞を上記のように再懸濁し、100μlのアリコートを96ウェルプレートに分注した。, 細胞を150-μl最終容積で刺激し、3時間の組換えLHの示された濃度を5％CO2インキュベーターで37℃で刺激した。組換えヒトLHは、国立ホルモン&ペプチドプログラム（A.F.Parlow、Torrance、CA）から得られた。 各ＬＨ濃度について重複細胞試料の培地中に放出されたテストステロンを、Ｎｅｏｇｅｎ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）からの免疫酵素アッセイキットを用いて測定した。すべてのデータは平均±SDとして表される。, テストステロン産生に対するLH作用のEC50値は、ソフトウェアパッケージ（GraphPad Prism4.0;GraphPad Software、San Diego、CA）を用いて各Leydig細胞調製物について得られたLH濃度依存性曲線 統計分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によって行った。 違いは、p<0.05で有意とみなされた。