Ci sono quattro famiglie di complessi proteolitici intracellulari onnipresenti negli eubatteri: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP e FtsH. Oltre a questi cinque, HtrA (DegP) è un complesso proteolitico periplasmico/secreto, mentre il proteasoma procariotico si trova solo negli actinomiceti. La struttura, la funzione e il ruolo nella patogenesi di ciascuna proteasi sono stati esaminati in precedenza.,13, 17 Molti di questi complessi sono stati studiati come potenziali bersagli antibatterici, tra cui Lon, 18 ClpXP, 19 HtrA20 e il proteasoma.21 Di questi, ClpXP è stato studiato più ampiamente ed è l’unico complesso per il quale sono stati finora trovati inibitori del prodotto naturale.
Il complesso proteolitico clp
I CLPP sono ben conservati nella maggior parte delle specie batteriche e hanno un ruolo importante nel turnover proteico., Oltre all’omeostasi proteica e alla degradazione delle proteine misfolded, il ClpP inoltre è coinvolto in numerosi processi regolatori miranti ai regolatori trascrizionali ed al rimodellamento del proteoma.22, 23, 24, 25 Infatti, ClpP è stato trovato per avere un ruolo chiave nella regolazione di processi come la divisione cellulare, tolleranza allo stress, virulenza, differenziazione morfologica e resistenza agli antibiotici.22, 23, 24 Il ruolo di ClpP in questi processi si basa sulla sua rigorosa selezione di substrati proteici, che raggiunge limitando l’accesso ai suoi siti catalitici., Ogni complesso ClpP è formato impilando due anelli eptamericani per creare un tetradecamer (Figura 2).26 Il canale che si forma ospita 14 siti catalitici della serina proteasi a cui non è possibile accedere senza passare attraverso le aperture assiali. Inoltre, apo-ClpP adotta una conformazione inattiva e compressa in cui la sua triade catalitica è disallineata.27 Controllare l’attivazione conformazionale e l’accesso alle aperture assiali sono le proteine Hsp100 della superfamiglia AAA+ delle ATPasi: ClpA o ClpX nei batteri Gram-negativi e ClpC o ClpX nei Gram-positivi., Questi ATPasi accessori formano anelli esamerici che legano le facce assiali del tetradecamer utilizzando motivi tripeptide (L/I)GF che si adattano alle tasche idrofobiche.Il legame 28 in questa tasca idrofobica regola l’attività del ClpP in due modi: in primo luogo, stabilizzando il complesso in una conformazione attiva e estesa con la triade catalitica allineata e, in secondo luogo, attraverso lo sviluppo del substrato proteico., Le ATPASI AAA + interagiscono con bersagli proteici, direttamente o attraverso una proteina adattatore cooperante, e utilizzano l’energia fornita dall’ATP per aprire il substrato e alimentarlo nel poro centrale dove viene idrolizzato in modo indipendente dall’energia. Poiché le proteine piegate sono altrimenti troppo grandi per entrare nel canale, questi partner AAA+ regolano strettamente quali substrati proteici sono mirati alla degredazione.28
Meccanismi di perturbazione del sistema proteolitico ClpP., (a) I tetradecamers di ClpP (indicati in rosso) che alloggiano i siti proteolitici della serina (indicati in verde) sono regolati strettamente dagli esameri dell’ATPasi Hsp100 (indicati in blu). (b-d) I farmaci (mostrati in giallo) possono causare perturbazioni in uno dei tre modi, portando alla morte cellulare o alla riduzione della virulenza. I farmaci che attivano l’attività ATPasi di ClpC1 in M. tuberculosis (d) sono pensati per disaccoppiarlo da ClpP, inibendo la proteolisi o portare ad un aumento della degradazione proteica. Una versione a colori di questa figura è disponibile presso Il Journal of Antibiotics journal online.,
La maggior parte delle specie batteriche, tra cui E. coli, Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus, hanno un gene clpP che, insieme alle loro ATPasi AAA+ associate, non sono essenziali per la vitalità cellulare.25, 29, 30, 31, 32 Tuttavia, è stato osservato che la delezione clpP in queste specie aumenta la loro suscettibilità agli antibiotici come linezolid e rifampicina e diminuisce la virulenza in agenti patogeni come Listeria monocytogenes e S. aureus.,23, 33 La perdita di virulenza nei ceppi carenti di ClpXP è stata collegata a importanti perturbazioni nei livelli di fattore trascrizionale di virulenza globale come la rete regolatoria sar/agr in S. aureus.23 È interessante notare che l’effetto dell’inattivazione ClpP su molti di questi regolatori di virulenza sembra essere dipendente dal ceppo e, inoltre, alcuni ceppi di S. aureus carenti nella funzione ClpXP sembrano avere una ridotta suscettibilità alla vancomicina, alla daptomicina e agli antibiotici β-lattamici.,34, 35, 36
In contrasto con la maggior parte dei batteri, due o più copie di clpP si trovano in actinobacteria e cianobatteri e almeno una copia funzionale è essenziale per la vitalità.37, 38 In Mycobacterium tuberculosis, clpP1 e clpP2 formano un operone ed entrambi i geni sono essenziali. Queste isoforme lavorano insieme per creare una proteasi funzionale impilando gli omoeptameri ClpP1 e ClpP2 in un eterotetradecamer.37, 39 Delle quattro ATPasi AAA + in M. tuberculosis, ClpX e ClpC1 sono essenziali per la vitalità.,40, 41
Dato il suo ruolo nella vitalità cellulare e nella virulenza, il sistema ClpP è un obiettivo promettente per nuovi antibatterici con tre possibili meccanismi di deregolamentazione (Figura 2): inibizione della proteolisi ClpP, attivazione della proteolisi ClpP o perturbazione delle ATPasi AAA+ partner.
Inibitori di ClpP
Forse l’approccio più ovvio al targeting del sistema ClpP è quello di sviluppare un inibitore del sito attivo di ClpP. La prova di principio di questa modalità di azione è stata dimostrata in S. aureus, Streptococcus pneumoniae e L., monocytogenes, dove i knockout di clpP non sono in grado di causare ascessi di infezione della pelle, infezioni polmonari o parassitismo in vivo dei macrofagi, rispettivamente.22, 42, 43 Questa perdita di virulenza è stata associata a una diminuzione dell’attività di proteasi extracellulari, lipasi, DNasi e α-emolisina in S. aureus e α-listerolisina e fosfolipasi listeriosa in L. monocytogenes.
Gli sforzi pionieristici di Böttcher e Sieber44 per colpire il ClpP hanno portato allo sviluppo di una serie di inibitori del β-lattone., Ispirati dalla reattività dei β-lattoni trovati in natura, hanno sintetizzato una libreria di derivati etichettati con alchini (ad esempio, Lattone D3; Figura 3a), che sono stati sottoposti a screening contro diversi proteomi batterici. Fare clic su chimica sul tag alkyne è stato utilizzato per collegare un fluoroforo e consentire l’identificazione di enzimi reattivi. In questo modo, ClpP è stato identificato come un bersaglio altamente specifico che forma un addotto covalente tra il suo sito attivo Ser98 e il β-lattone, inibendo così irreversibilmente l’attività proteolitica (Figura 3b).,44 La caratterizzazione successiva ha dimostrato la capacità dei β-lattoni di ridurre l’attività del fattore di virulenza, tra cui α-emolisina e listerolisina, rispettivamente in S. aureus e L. Monocytogenes.45, 46 Questa riduzione dei fattori di virulenza è correlata con la capacità degli scaffold β-lattonici ottimizzati (U1; Figura 3a) di ridurre significativamente l’infezione da S. aureus dopo somministrazione sottocutanea in un modello di ascesso cutaneo e la crescita di L. monocytogenes nei macrofagi.46, 47 Inoltre, i derivati β-lattonici (composto 7; Figura 3a) sono risultati essere tra il gruppo privilegiato di composti in grado di entrare in M., tubercolosi per inibire efficacemente la crescita con un MIC di 28 µg ml-1.48 In definitiva, tuttavia, bassa stabilità plasmatica dovuta alla rapida idrolisi dell’estere ciclico che preclude un ulteriore sviluppo clinico.
Inibitori ClpP. a) Strutture chimiche dei β-lattoni e degli esteri fenilici altamente attivi. il β-lattone D3 è stato originariamente utilizzato come sonda per l’inibizione del ClpP mediante chimica a scatto e la successiva ottimizzazione ha prodotto β-lattone U1. β-Lattone 7 è stato ottimizzato per M., inibizione della crescita della tubercolosi. (b) Meccanismo di inibizione proteolitica del sito attivo dei β-lattoni mediante modificazione covalente di Ser98. L’idrolisi del complesso acil-enzima è descritta dalla sua emivita. (c) Confronto tra β-lattone e fenil estere stabilità, potenza e attività. La riduzione dell’emolisi si riferisce a quella quantificata eliminando le piastre di agar del sangue causate dalle colture di S. aureus. (ND, non determinato). Una versione a colori di questa figura è disponibile presso Il Journal of Antibiotics journal online.,
Più recentemente, Sieber e colleghe49 ha scoperto una nuova classe di potenti inibitori del ClpP, gli esteri fenilici (AV170; Figura 3a). Scoperto utilizzando uno schermo imparziale di 137 000 composti sintetici in un test fluorogenico per l’attività ClpP, esteri fenilici agiscono dalla stessa modificazione covalente di Ser98 come β-lattoni., È interessante notare che alcuni enantiomeri sono anche in grado di innescare la deoligomerizzazione del tetradecamer ClpP in eptameri, un modo favorevole di azione dato che il controllo conformazionale della triade catalitica serina lo rende inattivo nella forma eptamericana di ClpP. Nonostante la maggiore potenza degli esteri fenilici nell’inibizione della proteasi rispetto ai β-lattoni, la loro attività anti-virulenza è ridotta, in quanto sono solo in grado di diminuire e non abolire la produzione di α-emolisina (Figura 3c). Gli sforzi per aumentare la potenza hanno rivelato un compromesso tra stabilità e reattività.,49
Sebbene l’inibizione del ClpP sia promettente come meccanismo d’azione, è chiaramente necessario un ulteriore sviluppo e la scoperta di nuovi scaffold. Inoltre, data la recente evidenza di resistenza ai farmaci in alcuni ceppi knockout clpP, 34, 36 una certa cautela su questo percorso può essere giustificata.
Attivatori ClpP
L’attivazione del sistema di proteasi ClpP è un’opzione terapeutica particolarmente intrigante. Un segno distintivo delle proteasi intracellulari è una rigorosa regolazione dell’attività per evitare la degradazione delle proteine bersaglio. Negli eucarioti, questo è spesso realizzato dalla compartimentazione negli organelli., Al contrario, i batteri hanno sviluppato complessi proteici regolatori stretti per controllare l’attività della proteasi. Attivando l’attività proteolitica per degradare indiscriminatamente le proteine, un farmaco sarebbe in grado di causare la morte cellulare non solo in quelle specie in cui ClpP è essenziale, ma anche quelle in cui ClpP è dispensabile. Le mutazioni che aboliscono l’attività di ClpP, mentre teoricamente conferiscono resistenza, sarebbero fatali nelle cellule in cui ClpP è essenziale e compromettono la virulenza nelle cellule in cui ClpP è dispensabile., Infine, la modalità di azione senza precedenti mediante attivazione piuttosto che inibizione del suo bersaglio può consentire a tale farmaco di essere efficace contro le cellule dormienti.
La prova fortuita del principio di questo meccanismo d’azione unico è stata riportata con la scoperta di acildepsipeptidi (ADEPS; Figura 4a). ADEPs è stato descritto per la prima volta in un brevetto nel 1985 come “complesso A54556”, un gruppo di otto composti strettamente correlati prodotti da Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP è stato identificato come bersaglio molecolare di ADEP nel 2005 quando Brötz-Oesterhelt et al.,51 genomica inversa applicata a un ceppo di E. coli resistente ADEP per identificare il determinante di resistenza come mutazione in ClpP che lo rende inattivo. Questo risultato ha suggerito che ADEPS attivare ClpP, causando degradazione delle proteine inadeguato. Infatti, studi in vitro che misuravano la scissione di peptidi fluorogenici e analisi proteomiche in vivo hanno confermato che B. subtilis ClpP attivato da ADEP era in grado di degradare le proteine indipendentemente dalla regolazione AAA+ o dall’idrolisi di ATP.,51
Attivatori ClpP. (a) Strutture chimiche di attivatori ClpP prodotto naturale ADEP1 e sclerotiamide, e l’attivatore sintetico ottimizzato ClpP ACP1b. (b)Struttura cristallina di E. coli CLPP tetradecamer in complesso con ADEP (PDB 3MT6) 55 impilamento heptamers sono mostrati in colori chiari/scuri, monomeri ClpP sono mostrati in alternanza rosso e blu, e molecole ADEP sono mostrati in verde., (c) Strutture rappresentative della SAR di ADEP che culminano in diversi sforzi di chimica medicinale. I microfoni contro S. aureus sono elencati.54 (d) Sito di aggancio ADEP all’interfaccia di due monomeri ClpP, mostrato in rosa chiaro/blu. I nitrogeni sono contrassegnati in blu scuro mentre gli ossigeni sono contrassegnati in rosso. Due legami transannulari H riportati sono mostrati da linee tratteggiate gialle. Una versione a colori di questa figura è disponibile presso Il Journal of Antibiotics journal online.,
Informazioni su questa perdita di regolazione sono state fornite dalle strutture cristalline di ClpP attivato da ADEP da E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis e Neisseria meningitidis (Figura 4b).52, 53, 54, 55 Una molecola ADEP si lega a ciascun monomero nel tetradecamer ClpP nella stessa tasca idrofobica utilizzata dalle ATPasi AAA+, inibendo così la loro interazione (Figura 4d).,52, 55, 56 Binding imita il controllo conformazionale dell’ATPasi di ClpP, inducendo l’allineamento della triade catalitica serina e una rotazione rigida del corpo dei monomeri ClpP, allargando il poro assiale da 10-12 Å a 20 Å in E. coli.27, 52, 55 Un meccanismo di gating è fornito anche dai domini N-terminale, che si muovono da una conformazione verso il basso, o chiuso ad un up, o aperto conformazione su ADEP vincolante.,52, 55 L’attivazione di ADEP non consente di degradare le proteine stabilmente piegate, poiché sono ancora troppo grandi per entrare nel lume assiale di ClpP, ma consente di degradare le proteine instabili e le catene nascenti che emergono dal ribosoma, specialmente se si piegano lentamente.Si pensa che la morte cellulare 57 sia il risultato di questa degradazione indiscriminata e dell’inibizione della normale funzione ClpP.
gli ADEPs sono attivi contro una gamma di batteri Gram-positivi tra cui S. aureus (MRSA) resistente alla meticillina clinicamente rilevante, enterococchi resistenti alla vancomicina e S resistente alla penicillina., pneumoniae, così come i patogeni Gram-negativi N. meningitidis e Neisseria gonorrheae.51, 54 Derivati semisintetici ADEP sono efficaci contro Enterococcus faecalis, S. aureus e S. pneumoniae nei modelli di topo e ratto con attività superiore a linezolid, 51 e l’attività contro MRSA in un modello di periotinite murina è superiore a vancomicina.58 In particolare, la resistenza all’ADEPS si sviluppa ad una frequenza di 10-6 in queste specie batteriche da mutazioni che diminuiscono la funzione di ClpP, che non è essenziale., Tuttavia, utilizzando la ridotta forma fisica dei mutanti clpP come vantaggio, le terapie combinate di ADEP e rifampicina hanno dimostrato di eradicare completamente in vitro una popolazione di MRSA resistente alla vancomicina.59
Ancora più promettente è la capacità degli ADEP di eliminare le cellule persistenti.59 Conlon et al.59 prima descritto questa proprietà quando un ADEP efficacemente ucciso sia fase stazionaria S. aureus e persister S. aureus sinistra dopo il trattamento con ciprofloxacina. Questa scoperta ha implicazioni per l’uso di ADEPs contro le infezioni tubercolari latenti causate da persistenti M. tuberculosis tolleranti ai farmaci., Ad oggi, l’attività contro i persistenti di M. tuberculosis non è stata descritta, ma è stato dimostrato che l’ADEPs rallenta la crescita di M. tuberculosis quando combinato con due inibitori della pompa di efflusso, reserpina e verapamil.39
Sebbene gli ADEPS siano promettenti per i candidati ai farmaci, hanno proprietà farmacologiche sfavorevoli tra cui scarsa solubilità in acqua, rapida clearance sistemica e instabilità chimica.51, 60 In seguito alla scoperta della modalità d’azione dell’ADEPs, Bayer AG ha lanciato un programma di chimica medicinale SAR per sviluppare un derivato più stabile e potente dell’ADEP., Questo sforzo ha portato allo sviluppo di ADEP4, un derivato ADEP1 molto potente con tre importanti modifiche: Phe è sostituito da 3,5-difluorofenilalanina, che si pensa formi legami H con ClpP, il poliene acilico è sostituito da una coda di esenoil α,β-insaturo per migliorare la stabilità e N-MeAla è sostituito da pipecolato, che aumenta la rigidità di ADEP.60 L’attività di ADEP4 è stata ulteriormente migliorata da Carney et al.61 sostituendo Ser con Allo-Thr e Pip con 4-MePip per rigidificare ulteriormente ADEP., Quantificando i tassi di cambio idrogeno-deuterio utilizzando 1H NMR, la rigidificazione della molecola ADEP ha dimostrato di rafforzare i legami transannulari H, riducendo così i costi entropici del legame con ClpP. Il derivato ADEP di Carney ha una potenza maggiore di 600-1200 volte rispetto ad ADEP1 contro i patogeni Gram-positivi.61
Nonostante l’aumento della potenza di questi derivati ADEP, hanno ancora solo un’attività limitata contro i batteri Gram-negativi e vengono efficacemente rimossi dalla cellula mediante efflusso attivo, specialmente in M. tuberculosis.,39, 62 Numerosi altri sforzi di chimica sintetica hanno esplorato motivi per superare queste limitazioni, ma la maggior parte ha portato a una diminuzione dell’attività (Figura 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 Dato il legame intimo di ADEP nella sua tasca idrofobica, questo risultato è forse prevedibile e suggerisce che la modifica sull’impalcatura di ADEP potrebbe aver raggiunto un’impasse.
Sono stati montati due schermi ad alto throughput per identificare nuovi attivatori ClpP.65, 68 Entrambi hanno identificato attivatori di piccole molecole di E., coli ClpP utilizzando un test in vitro che misura gli aumenti di fluorescenza causati dalla scissione della fluoresceina isotiocianato-caseina, un substrato modello per ClpP. Nel primo, Leung et al.65 hanno esaminato 60 000 sostanze chimiche sintetiche simili a farmaci, identificando cinque composti denominati ACP1–5 (Figura 4a). Il più attivo di questi composti era 10-20 volte meno potente dell’ADEP1 all’attivazione del ClpP e mostrava solo una modesta attività antibatterica anche in presenza di agenti permeabilizzanti. Lavey et al.,68 invece ha esaminato>20 450 estratti o metaboliti fungini e batterici e ha identificato un singolo attivatore ClpP, sclerotiamide (Figura 4a). Questo indolinone paraherquamide-correlato era 73 volte meno potente di ADEP1 ad attivare EcClpP e non è riuscito a inibire la crescita di efflusso carente di E. coli o Pseudomonas aeruginosa.
Nonostante le limitate efficienze degli ACP e della sclerotiamide, questi studi forniscono nuovi scaffold per la derivatizzazione e aprono la porta a studi futuri per identificare gli attivatori di ClpP., Si potrebbe immaginare, ad esempio, identificare siti di associazione di attivazione alternativi su ClpP. La regolazione di ClpP comporta non solo il controllo dell’ingresso del substrato mediante l’allargamento dei pori sull’associazione AAA+ ATPasi, ma anche la formazione del sito catalitico della serina attraverso l’oligomerizzazione in tetradecameri.69 Forse una piccola molecola che ha indotto la formazione del sito attivo mantenendo ClpP come eptamero potrebbe consentire un facile accesso a questo sito attivo da substrati indiscriminati.,
Disaccoppiatori AAA+ ATPasi come terapie
Poiché ClpP si basa sulle ATPasi AAA+ per selezionare e dispiegare i substrati proteici, la perturbazione di questi partner può anche deregolamentare il sistema proteolitico ClpP. In particolare, questo è vero in M. tuberculosis dove le ATPasi ClpC1 e ClpX sono essenziali per la vitalità cellulare.40, 41 Infatti, ciascuno dei tre composti di targeting ClpC1 caratterizzato fino ad oggi sono stati scoperti mediante screening estratti di prodotti naturali per l’attività anti-M. tuberculosis., Il primo di questi da scoprire è cyclomarin A (cymA), un eptapeptide ciclico prodotto dal batterio marino Streptomyces sp. CNB-982 (Figura 5a).70 Sebbene sia stato descritto nel 1999 come un potente agente antinfiammatorio con citotossicità contro le cellule tumorali, non è stato fino al 2011 che l’attività contro M. tuberculosis è stata scoperta durante uno schermo a cellule intere di prodotto naturale.71 In un primo tentativo di identificare il bersaglio molecolare di cymA, è stato adottato un approccio genomico inverso. Tuttavia, dopo nessun M resistente spontaneo., i mutanti della tubercolosi potrebbero essere recuperati, la cromatografia di affinità è stata invece utilizzata per dimostrare che il cymA si rivolge a ClpC1 con elevata specificità. La successiva co-cristallizzazione del cymA con il dominio N-terminale di ClpC1 ha identificato residui importanti per il legame e, nonostante l’incapacità di generare mutanti resistenti spontanei, ha permesso la creazione di mutanti ClpC1 che conferiscono resistenza al cymA.72
Attivatori ClpC1. a) Strutture chimiche di cymA, ecumicina e lassomicina., Gli amminoacidi basici sono mostrati in rosso e alifatici / aromatici sono mostrati in blu. (b) Struttura cristallina del dominio N-terminale di M. tuberculosis di ClpC1 (PDB 3WDC). I siti di legame distinti di ciascun attivatore sono dimostrati dai residui di posizione coinvolti nel legame dell’attivatore, mostrati in giallo (lassomicina), blu (ciclomarina) e rosso (ecumicina). Una versione a colori di questa figura è disponibile presso Il Journal of Antibiotics journal online.
Nel 2014, l’ecumicina, un tridecapeptide macrociclico di Nonomuraea sp., MJM5123, 73 e lassomicina, un lazo-peptide a 16 membri di Lentzea kentuckyensis sp., 74 sono stati isolati entrambi mediante screening di estratti di actinomiceti grezzi (Figura 5a). Il dominio N-terminale di ClpC1 è stato identificato come bersaglio molecolare di questi composti mediante genomica inversa su mutanti resistenti spontanei. Nonostante cymA, ecumicina e lassomicina condividano un obiettivo comune, la caratterizzazione strutturale e la posizione delle mutazioni che conferiscono resistenza a ciascun composto suggeriscono che ciascun legame si leghi in una posizione leggermente diversa sul dominio N-terminale di ClpC1 (Figura 5b)., Ad esempio, a differenza di cymA ed ecumicina, la lassomicina è altamente basica, contenente diversi residui di Arg e si trova in una regione altamente acida di ClpC1.74
CymA, ecumicina e lassomicina sono tutti battericidi contro la replicazione di M. tuberculosis, una serie di altre specie di micobatteri e M. tuberculosis multiresistente. È importante sottolineare che sono anche attivi contro la tubercolosi M. non replicante. Coerentemente con la mancanza di essenzialità delle ATPasi AAA+, ciascuna manca di attività contro altre specie Gram-positive e Gram-negative come S. aureus e P. aeruginosa., Questa specificità ha benefici, in quanto mancano anche di attività contro i membri commensali del microbiota umano.
Al fine di causare la morte cellulare in M. tuberculosis, l’ecumicina e la lassomicina sembrano stimolare l’attività dell’ATPasi, ma disaccoppiarla dalla degradazione delle proteine.73, 74 In questo modo, la degradazione dei substrati naturali viene inibita e porta al loro accumulo e tossicità, simile alle azioni sia degli inibitori del ClpP che degli attivatori in M. tuberculosis., In contrasto con l’ecumicina e la lassomicina, è stato suggerito che il cymA aumenti la degradazione delle proteine, come dimostrato da una diminuzione della fluorescenza della proteina fluorescente verde contrassegnata da LeuAspAsp tripeptide mirata a ClpC1 durante l’incubazione con cymA.71 Tuttavia, è possibile che questa diminuzione della fluorescenza sia il risultato dello sviluppo di proteine fluorescenti verdi da parte di ClpC1 piuttosto che della degradazione e che il cymA possa quindi avere lo stesso meccanismo di disaccoppiamento dell’ecumicina e della lassomicina., Diverse domande rimangono senza risposta sul meccanismo d’azione di questi farmaci, inclusi i loro effetti sullo sviluppo delle proteine e su come l’attività dell’ATPasi viene stimolata e la proteolisi inibita, ad esempio, inibendo l’interazione con ClpP1P2. Inoltre, la caratterizzazione è ancora in corso per un altro inibitore ClpC1 recentemente scoperto, l’analogo RUF-I. 75 RUFOMICINA
Nonostante la potenza relativamente elevata di cymA, ecumicina e lassomicina contro M. tuberculosis, è necessaria l’ottimizzazione delle proprietà farmacologiche., Ad esempio, cymA presenta clearance epatica e una breve emivita nei topi e l’ecumicina ha una solubilità limitata e uno scarso assorbimento intestinale.13, 73 Recenti sintesi totali e ottimizzazione della fermentazione possono aiutare in questi sviluppi.76, 77, 78
Sebbene i farmaci mirati a ClpC1 siano una possibilità intrigante per le terapie anti-M. tuberculosis, generalmente non hanno attività battericida contro specie diverse dagli actinobatteri., In queste specie in cui la ClpP e le ATPasi AAA+ associate sono dispensabili, è possibile che il targeting di queste ATPasi abbia effetti antivirulenza simili a quelli osservati con gli inibitori della ClpP. Tuttavia, un tale composto dovrebbe probabilmente essere in grado di indirizzare più partner ATPase per avere un effetto così diffuso come un’azione diretta su ClpP. Questi potenziali effetti antivirulenti non sono stati studiati per cymA, lassomicina o ecumicina.,
Raggiungendo la specificità
Dei complessi proteolitici batterici, tutti tranne HslUV hanno un ortologo umano e molti sono infatti intensamente studiati come potenziali bersagli antitumorali. Ad esempio, le proteasi mitocondriali LONP1, ClpXP e m-AAA (FtsH homolog) hanno ruoli importanti nel controllo della qualità nei mitocondri, specialmente durante lo stress respiratorio.79 Mutazioni in m-AAA sono anche implicate nella paraplegia spastica, una malattia neurodegenerativa ereditaria.80 In quanto tale, è fondamentale che gli agenti antimicrobici siano in grado di indirizzare specificamente il loro omologo batterico.,
Nel caso di inibitori della proteasi che mirano ad agire come substrati suicidi, raggiungere la specificità può essere difficile, a causa di meccanismi catalitici conservati. In effetti, è stata riscontrata una mancanza di specificità negli sforzi per sviluppare inibitori sia del proteasoma procariotico che della proteasi batterica Lon. Il proteasoma procariotico in M. tuberculosis rappresenta un obiettivo promettente per l’inibizione, in quanto è dispensabile per la crescita in vitro ma è essenziale per la sopravvivenza dello stress da ossido nitrico81 e la persistenza nei topi.,62, 82 Molti tentativi sono stati fatti per sviluppare un farmaco contro il proteasoma micobatterico, di solito come peptidil epossicetoni, aldeidi o boronati, ma la maggior parte inibiscono il proteasoma dei mammiferi più potentemente di quello di M. tuberculosis.83 La selettività non è tuttavia senza precedenti, come dimostrato dalla scoperta dei composti oxathiazole-2-one GL5 e HT1171 (Figura 6). Questi composti sono battericidi contro M non replicanti., tubercolosi trattata con livelli subinibitori di ossido nitrico21 e con >1000 volte maggiore attività contro i micobatteri rispetto ai proteasomi umani. Si ritiene che la specificità sia conferita dall’interazione del farmaco con residui al di fuori del sito attivo non conservati nei proteasomi dei mammiferi.21
M. inibitori del proteasoma della tubercolosi della famiglia oxathiazole-2-one.,
Lon è anche un bersaglio promettente, poiché è stato implicato nella formazione di biofilm, nella motilità e nella tolleranza allo stress, e i mutanti hanno dimostrato di avere una ridotta colonizzazione e virulenza in Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, Vibrio cholera e P. aeruginosa.84, 85, 86, 87 Nell’unico tentativo finora compiuto di identificare gli inibitori batterici del Lon, gli inibitori del proteasoma sono stati sottoposti a screening in vitro ed è stato identificato il peptidil boronato MG262.,18 Tuttavia, questo composto è ancora 2000 volte più potente contro il proteasoma 20S.18 Come per i composti oxathiazole-2-one, è probabile che sia necessario sfruttare i residui divergenti negli omologhi umani per sviluppare un inibitore Lon altamente specifico.
La specificità può anche essere raggiunta spostandosi al di fuori del sito attivo catalitico verso siti di legame che perturbano la funzione della proteasi, ma sono scarsamente conservati tra ortologi umani e batteri. ADEPS giustamente dimostrare il potenziale di questo approccio., Sebbene non siano stati testati direttamente su ClpP umano (hClpP), gli ADEP non sono tossici per le cellule umane fino a 25 µg ml-1, suggerendo che hanno scarsa, se presente, affinità per l’enzima umano.58 Confronto strutturale di E. coli (EcClpP) e hClpP supporta questa nozione. La loro struttura della spina dorsale è in gran parte conservata, con una deviazione quadrata media della radice di 0.,63 Å; 88 tuttavia, l’ispezione della tasca idrofobica utilizzata per il legame ADEP mostra che hClpP ha diverse sostituzioni che riducono la sua idrofobicità (Asn55Pro, His60Tyr e His112Phe) insieme a un’inversione di carica (Glu56Lys) nella porzione distale della scanalatura di attracco. È del tutto possibile che questi cambiamenti impediscano il binding ADEP in hClpP. Va notato, tuttavia, che EcClpX, sebbene non EcClpA, può attivare hClpP.88 In ogni caso, la ricerca di farmaci che legano siti normativi meno conservati può essere la chiave per trovare antibatterici altamente specifici.