Materiali e metodi
Topi.
I topi C57BL / 6 Wild-type sono stati ottenuti da Charles River Laboratories (Wilmington, MA). I topi PDE8A KO sono stati inizialmente prodotti da Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) sotto contratto con Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Regno Unito). Successivamente sono stati allevati a topi C57BL/6 presso l’Università di Washington per 10 generazioni. Per gli esperimenti riportati, sono stati utilizzati topi di età compresa tra 6 e 8 settimane di età., Tutte le procedure utilizzate sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (IACUC) dell’Università di Washington, in conformità con la Guida del National Institutes of Health per la cura e l’uso degli animali da laboratorio.
PCR in tempo reale.
Testis cDNA è stato preparato da RNA totale da testicoli di topo wild-type e PDE8A-null utilizzando APICE III e Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). La PCR in tempo reale è stata eseguita utilizzando Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., I primer (IDT, Coralville, IA) per PDE8A, diretti verso l’area a valle della cassetta di targeting, erano i seguenti: primer forward, GCCACAGAAATGACGAAGC (esone 19); primer reverse, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (esone 20). I primer per ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi erano i seguenti: primer avanti ATTATGCCGAGGATTTGGAA; primer inverso, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
Ibridazione in situ.
Il modello per la sintesi di riboprobe è stato ottenuto mediante PCR utilizzando un plasmide contenente la sequenza PDE8A del mouse., In particolare, la regione 3 ‘ del mouse PDE8A (esoni 17-20) è stata amplificata utilizzando i seguenti primer: forward primer, AATTAACCCTCACTAAAGGGGCGTATTTCCTTTCCAG (sequenza del promotore della polimerasi del fago RNA T3 sottolineata); reverse primer, TAATACGACTCACTATAGGGGACACGTCGGCACACTTAAT (sequenza del promotore della polimerasi del fago RNA T7 sottolineata). I prodotti PCR sono stati isolati da gel di agarosio e purificati con un kit di estrazione del gel (Qiagen, Valencia, CA)., I riboprobi marcati 35S sono stati sintetizzati mediante trascrizione in vitro con un kit MAXIscript T3 / T7 (Ambion, Austin, TX) utilizzando come modello il prodotto PCR contenente siti promotori di RNA polimerasi fago T3 e T7. La trascrizione in vitro è stata effettuata in una miscela di reazione 20-µl contenente 5 µl di UTP (PerkinElmer, Boston, MA) e la T3 RNA polimerasi o la T7 RNA polimerasi per ottenere rispettivamente il senso o la riboproba antisenso.
I testicoli sono stati sezionati da topi wild-type e PDE8A KO e sono stati rapidamente congelati nel tessuto-Tek O. C. T. composto (Sakura, Torrence, CA) su ghiaccio secco., Le sezioni (20 µm) sono state tagliate in un criostato, montato su un microslide Superfrost plus (VWR Scientific, West Chester, PA) e asciugate all’aria. Le sezioni sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 15 min a temperatura ambiente, trattate con anidride acetica allo 0,25% in trietanolammina 0,1 M (pH 8,0) per 10 min e disidratate attraverso una serie di etanolo graduato (30, 60, 80, 95 e 100%). Le sezioni sono state quindi incubate con tampone di ibridazione in una camera umida a 60°C per 4 h. Dopo il risciacquo in 2× SSC (citrato salino standard; 1× SSC = 0,15 M cloruro di sodio / 0,015 M citrato di sodio, pH 7.,2), le sezioni sono state disidratate attraverso una serie di etanolo graduato. L’ibridazione è stata eseguita in buffer contenente sonda antisenso o sense marcata con 35S (40 pg/34.000–38.000 cpm per µl) sotto coprioggetti in plastica in una camera umida a 60°C durante la notte. I coprioggetti sono stati delicatamente rimossi e le sezioni sono state lavate con 2× SSC contenente 10 mm DTT per 30 min due volte a 60°C. Le sezioni sono state quindi incubate per 30 min a 37°C con 20 µg / ml RNaseA in 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5), e 1 mM EDTA, poi lavata 50% formammide, 2× SSC contenente 10 mM DTT per 30 min a 60°C, 1× SSC contenente 10 mM DTT per 30 min a 60°C, e di un ulteriore 0,1× SSC contenente 10 mM DTT per 30 min a 60°C. Infine, le sezioni sono state disidratate in etanolo (70, 95 e 100%), l’aria secca, ed esposti su BioMax XAR film (Eastman Kodak, Rochester, NY) per 9 h. Per vedere la distribuzione delle cellule di PDE8A mRNA di ibridazione, i vetrini sono stati rivestiti con Autoradiografia NTB emulsione (Eastman Kodak) e sono esposti per 1 settimana a 4°C., Le diapositive sono stati sviluppati, fisso, e counterstained con ematossilina e montato in Canada Balsam (Sigma-Aldrich).
PDE8A Immunoprecipitazione e dosaggio.
Gli spermatozoi di topo sono stati isolati dall’epididimo cauda con un metodo swim-out (38) e omogeneizzati in PBS contenenti 1% di Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mm EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-ammino benzamidina e miscela inibitrice della proteasi Sigma (Sigma-Aldrich)., L’omogenato è stato centrifugato per 5 minuti a 16.000 × g in un microcentrifugo e 200 µl aliquote del surnatante, equivalenti a 106 spermatozoi, sono state incubate durante la notte con 20 µl di una sospensione 1:1 di perle di proteina G-agarosio (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) in presenza o assenza di anticorpi PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Il giorno successivo, l’immunoprecipitato è stato lavato tre volte con PBS e quindi analizzato per l’attività PDE in presenza di substrato cAMP 10 nM, Mop 40 mM (pH 7,5), 15 mm Mg-acetato, 2 mm EGTA e 0,2 mg/ml BSA come in ref. 39.,
Immunoistotochimica.
I testicoli di topo appena congelati sono stati incorporati nel composto Tissue-Tek O. C. T. e poi sezionati su un criostato a 20 µm per fetta. Sezioni di tessuto o cellule di Leydig isolate sono state essiccate e fissate in 4% (wt/vol) paraformaldeide/PBS (pH 7.4) a temperatura ambiente per 10 min e lavate tre volte con PBS. I vetrini sono stati preincubati con tampone bloccante (5% siero d’asino, 1 mg/ml BSA e 0.,1% Triton X-100 in PBS) per 1 h a temperatura ambiente, incubate con un anti-PDE8A anticorpo (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) in PBS contenente 1% di asino siero, 1 mg/ml di BSA, e per lo 0,1% Triton X-100 durante la notte a 4°C, lavate in PBS contenente 0,05% di Tween 20 tre volte per 20 min, incubate con donkey anti-capra Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) in PBS contenente 1 mg/ml di BSA e 0,1% Triton X-100 per 2 h a temperatura ambiente e lavato., I vetrini sono stati ulteriormente incubati con tampone bloccante contenente il 5% di siero di capra per 1 ora a temperatura ambiente, incubati con anticorpo CYP11A (side chain clivage enzyme) del citocromo P450 (200 µl, 1: 250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) durante la notte a 4°C, lavato in PBS contenente 0.05% Tween 20 tre volte per 20 min, e incubato con capra anti-coniglio Alexa488 (1: 500; Invitrogen) come sopra. Le sezioni sono state infine verniciate con TO-PRO-3 (1: 1000; Invitrogen) in PBS per 5 min, lavate e montate in reagente antifade oro SlowFade (Invitrogen)., Per testare la specificità dell’anticorpo PDE8A, la soluzione anticorpale è stata preincubata con 2,5 µg/ml di antigene peptide (Santa Cruz Biotechnology) per 2 ore a temperatura ambiente prima della colorazione. Alcune sezioni sono state incubate senza gli anticorpi primari per determinare lo sfondo dovuto agli anticorpi secondari. I segnali immunostenenti sono stati visualizzati con un microscopio confocale (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). l’attività della β-galattosidasi, espressa con un segnale di localizzazione nucleare dal gene LacZ nella cassetta di targeting, è stata valutata mediante colorazione X-gal., Le sezioni sono state prima incubate con anticorpo anti-CYP11A seguito da coniugato di fosfatasi alcalina anti-coniglio (1: 500; Invitrogen) e NBT/BCIP (Roche) per lo sviluppo del colore. La colorazione X-gal è stata quindi eseguita come descritto (40) nella miscela X-gal a 37°C durante la notte. Le sezioni sono state lavate e montate con soluzione salina tamponata con glicerolo/Tris.
Purificazione delle cellule di Leydig.
Le cellule di Leydig sono state isolate come descritto in ref. 41. In breve, i testicoli di topi adulti sono stati decapsulati e dispersi in un bagno d’acqua tremante a 34°C per 10 min in 10 ml di Mezzo 199 (M-199) con 0.,25 mg/ml collagenasi D, 35 mU / ml Dispasi II e 6 µg/ml DNasi I. Per terminare la dispersione tissutale, sono stati aggiunti 40 ml di 1% di BSA in mezzi M-199 contenenti 15 mm di Hepes, 4 mm di bicarbonato di sodio e 25 µg/ml di inibitore della tripsina di soia per diluire la sospensione originale. I tubi sono stati poi tappati e invertiti più volte. I tubuli seminiferi potevano depositarsi per gravità e il surnatante contenente le cellule interstiziali veniva raccolto. La procedura è stata ripetuta due volte per raccogliere ulteriormente le cellule interstiziali., Le cellule sono state pellettate in provette da 50 ml mediante centrifugazione a 800 × g per 20 min a 4°C e poi frazionate utilizzando un gradiente Percoll continuo (GE Healthcare, Piscataway, NJ) (Percoll 55% in HBSS tamponato con Hepes 15 mm e inibitore della tripsina di soia 25 µg/ml) in un volume totale di 35 ml. I gradienti sono stati formati in situ mediante centrifugazione in un rotore ad angolo fisso JA-20 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) a 23.700 × g per 30 min a 4°C. Un tubo contenente perline di marcatori di densità (GE Healthcare) è stato utilizzato come riferimento per identificare i diversi strati di densità., Le cellule di Leydig sono state recuperate a partire da una densità di 1,07 g/ml fino al fondo del gradiente. Cinque volumi di HBSS sono stati aggiunti per diluire il Percoll e le cellule sono state pellettate a 200 × g per 10 min a 4°C. Il pellet finale ottenuto da due testicoli, arricchito in cellule di Leydig, è stato risospeso in 4 ml di DMEM/F-12 integrato con 1% di BSA e utilizzato immediatamente per gli esperimenti.
Saggio di 3β-idossisteroide deidrogenasi.
Misurazione della produzione di testosterone.
Le cellule di Leydig sono state risospese come sopra e le aliquote di 100 µl sono state erogate in piastre a 96 pozzetti., Le cellule sono state stimolate in volume finale 150-µl con le concentrazioni indicate di LH ricombinante per 3 h in un incubatore di CO2 del 5% a 37°C. LH umano ricombinante è stato ottenuto dall’ormone nazionale & Programma peptidico (AF Parlow, Torrance, CA). Il testosterone rilasciato nei media di campioni di cellule duplicate per ciascuna concentrazione di LH è stato misurato utilizzando un kit di analisi immunoenzimatica di Neogen (Lexington, KY).
Tutti i dati sono espressi come media ± SD., I valori EC50 per l’azione di LH sulla produzione di testosterone sono stati calcolati utilizzando un pacchetto software (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). L’analisi statistica è stata eseguita dal test t dello studente. Le differenze sono state considerate significative a P < 0.05.