La struttura di ACLY con CoA rivela conformazioni CoA produttive e improduttive
Abbiamo prodotto ACLY ricombinante a tutta lunghezza in Escherichia coli per tutte le nostre analisi biochimiche e strutturali (Dati estesi Fig. 1 bis, lettera b)., La fluorimetria a scansione differenziale dell’enzima con diversi cofattori ha confermato il legame e i potenziali cambiamenti strutturali associati ai ligandi aggiunti da soli o in combinazione (Dati estesi Fig. 1c). Abbiamo utilizzato questi dati per guidare la determinazione della struttura di ACLY con i suoi co-substrati o co-prodotti.
Abbiamo preparato la proteina ricombinante e inizialmente eseguito l’analisi a singola particella negativa della proteina in assenza di metaboliti (ACLY-apo)., Le medie di classe bidimensionale (2D)da 3.000 particelle hanno confermato che la proteina ha formato un tetramero (Dati estesi Fig. 2 bis, lettera b). Per ottenere maggiori dettagli strutturali, abbiamo eseguito uno studio crio-EM sul complesso ACLY-citrato-CoA. Dopo più cicli di ottimizzazione dei campioni di crio-EM, abbiamo determinato la struttura crio-EM simmetrica D2 della struttura ACLY–citrato-CoA ad una risoluzione media complessiva di 3.0 Å. (Dati estesi Figg. 2c, d, 3 e 4 e Tabella 1).,
Il ACLY–citrate-CoA struttura costituisce un homotetramer con una centrale tetramerica CSH modulo e due CENERE domini opposti della CSH modulo (protomers 1 & 2 e 3 & 4) (Fig. 1 bis, lettera b). Il dominio ASH (residui 1-806) adotta una struttura molto simile all’architettura α/β precedentemente riportata del dominio N-terminale isolato legato a citrato e ADP24., Il dominio CSH (residui 859-1101) è composto esclusivamente da eliche e anelli corti, con omologia strutturale a un dimero di dimeri di citrato sintasi che si incrociano a ~90° angoli (dati estesi Fig. 5 bis). I domini ASH e CSH di ciascuna catena polipeptidica sono collegati da una regione della bobina in gran parte estesa ~50 residui, ad eccezione di una breve α-elica tra i residui 824 e 829. La regione elicoidale all’interno di questo linker è l’unico punto di contatto significativo (dall’interazione di van der Waals) tra i due domini di CENERE su un lato della molecola., Il linker esteso consente al CSH di una subunità di interagire con il dominio ASH di un’altra subunità sul lato opposto del modulo CSH. In contrasto con le interazioni relativamente sparse tra i protomeri della CENERE, i domini CSH formano una vasta rete di interazioni prevalentemente van der Waals che suggerirebbero che i domini CSH funzionano come un modulo tetramerico rigido, mentre i quattro domini ASH sono più flessibili. Ciò è coerente con la stima della risoluzione locale EM osservata sulla mappa EM che è la più alta nel dominio CSH (2.8 Å, Dati estesi Fig., 4c) e le nostre precedenti osservazioni che il dominio CSH ha una temperatura di fusione più elevata rispetto alla CENERE di ~75 °C rispetto a ~55 °C, rispettivamente21.
Il CoA si lega all’interfaccia tra i domini CSH e ASH di subunità separate e sembra “pinzare” insieme i super domini. La base di adenina e l’anello di ribosio interagiscono con il dominio CSH di un monomero e il braccio pantotenico e il gruppo β-mercapto che si attaccano al sito attivo del dominio di CENERE di un’altra subunità (Fig. 1c (a sinistra) e Fig. 1d (a sinistra))., La modellazione del CoA si basa sull’osservazione che il gruppo ADP fosforilato è ben risolto nella densità crio-EM. Tuttavia, il gruppo mercapto non è stato ben risolto, suggerendo la flessibilità di questa regione. Sebbene diversi residui dai domini CSH e ASH facciano interazioni di van der Waals con il CoA, i legami idrogeno da S574, R576 e S577 dal dominio ASH e K964 dal dominio CSH agli ossigeni di ribosio fosfato sembrano svolgere un ruolo particolarmente importante nella pinzatura del CoA all’interfaccia ASH–CSH., È interessante notare che E599 si trova all’interno della distanza di legame dell’idrogeno all’atomo di zolfo modellato del CoA, implicando che potrebbe svolgere un importante ruolo catalitico. L’importanza delle interazioni proteina-CoA dal dominio ASH e CSH è supportata dalla sensibilità mutazionale dei residui R576 e K964 e il potenziale ruolo catalitico di E599 è supportato dalla sua sensibilità mutazionale ad A o Q ma non a D (Fig. 1f). Sebbene il citrato sia stato incluso nel campione per la ricostruzione crio-EM, non è stato possibile risolverlo con sicurezza nella mappa crio-EM.,
Data la densità irrisolta per il gruppo mercapto di CoA, abbiamo effettuato un’altra ricostruzione della struttura ACLY–citrato-CoA senza imporre la simmetria D2 per determinare se il CoA potrebbe adottare conformazioni diverse in protomeri diversi. Siamo stati in grado di preparare una ricostruzione senza imporre simmetria (C1, chiuso asimmetrico) ad una risoluzione nominale di 3,5 Å. In questa struttura chiusa asimmetrica ACLY–citrate-CoA-C1, la risoluzione attorno al dominio ASH è più scarsa rispetto alla struttura D2, ma la risoluzione locale attorno al dominio CSH rimane relativamente alta, da 2,8 a 3,2 Å., L’analisi di questa struttura chiusa asimmetrica ACLY–citrato-CoA-C1 ha rivelato che ciascuno dei domini ASH, e tre dei quattro domini CSH e molecole di CoA, ha adottato la stessa configurazione della struttura D2. Tuttavia, una delle molecole di CoA adotta una conformazione alternativa in cui la porzione ADP fosforilata viene spostata ~8 Å verso il modulo CSH e il braccio pantotenico viene piegato per interagire con il CSH (Fig. 1b, c (a destra) e Fig. 1e). La densità crioem corrispondente a questa conformazione CoA alternativa è molto chiara (Fig. 1c (a destra))., Sorprendentemente, la densità di crio-EM è anche osservata per una molecola d’acqua ben ordinata, che sembra colmare le interazioni di legame idrogeno tra l’atomo di zolfo terminale di CoA con i residui della catena laterale di H900, D1026 e R1065 con ulteriori interazioni di van der Waals da L969, I973, H975 e R976 (Fig. 1d (a destra)). In concomitanza con questa conformazione CoA alternativa, un ciclo all’interno del dominio CSH (residui 965-986) e le eliche di fiancheggiamento si spostano per ospitare la posizione alternativa della base di adenina CoA (Fig. 1e)., Mutazioni di H975, R976, D1026 e R1065 all’alanina mostrano tutte attività compromesse, suggerendo che il legame del CoA al dominio CSH è in qualche modo coinvolto nell’attività enzimatica (Fig. 1f). Dato che il CoA deve reagire con il citrato nel dominio della CENERE, ci riferiamo alle conformazioni del CoA con la cisteamina del braccio pantotenico che punta verso la CENERE e il CSH come conformazioni CoA “produttive” e “improduttive”, rispettivamente, legate all’ACLY.,
Struttura del ACLY–citrate-CoA sottopopolazione rivela asimmetrica CENERE orientamenti
In aggiunta alle principali ACLY–citrate-CoA particella popolazione, che rappresentano il 57% della classe 3 particelle, una sottopopolazione di ACLY–citrate-CoA complesso di particelle che rappresentano il 23% della sottoclasse delle particelle (10% complessivo) è stato catturato in una ricostruzione in 3D senza imporre la simmetria per una risoluzione di 4.3 Å (Extended Data Fig. 3)., Questa sottopopolazione di particelle ha una struttura complessiva simile alla popolazione principale di ACLY-citrato-CoA, tranne che uno dei quattro domini di CENERE è ruotato di ~50° verso la sua subunità di CENERE più vicina per adottare una conformazione più “aperta”, quindi ci riferiamo ad esso come “ACLY–citrato-CoA-C1 asymm open”. In questa struttura, la densità è visibile solo per la porzione ADP fosforilata di due molecole di CoA legate a due dei domini di CENERE simmetrici (Fig. 2 bis, lettera b). Una delle subunità di CENERE simmetrica e asimmetrica non mostra alcuna prova per il legame CoA., In particolare, il dominio ASH asimmetrico sembra incompatibile con il legame CoA produttivo (Fig. 2 quater). Proponiamo che questa struttura aperta asymm ACLY-citrate-CoA-C1 rappresenti uno stato intermedio di ACLY, in cui due siti attivi sono innescati per la catalisi e due non lo sono. L’osservazione di questa struttura suggerisce anche che i quattro siti ACLY attivi possono funzionare in modo indipendente.
a, Struttura complessiva di ACLY–citrate-CoA-C1 contenente la subunità ASH asimmetrica ed evidenziando le due molecole di CoA legate in verde. Viene mostrata una vista ingrandita di uno dei due siti di legame CoA con la corrispondente densità di crioem. b, Sovrapposizione delle strutture ACLY–citrato-CoA simmetriche (D2) e asimmetriche (C1 asymm open)., c, Sovrapposizione di CoA come legato nella struttura simmetrica ACLY-citrato-CoA (D2) sulla subunità ASH asimmetrica della struttura ACLY–citrato-CoA (C1 asymm open), illustrando che la subunità ASH asimmetrica è incompatibile con il legame CoA produttivo. Le superfici neutre, elettropositive ed elettronegative della struttura ACLY sono colorate rispettivamente di bianco, blu e rosso.,
La struttura dello stato ACLY-apo è sfavorevole per il legame CoA
Date le limitate interazioni tra i domini CSH e ASH, abbiamo chiesto informazioni sulla struttura di ACLY in assenza di leganti legati. Per fare ciò, abbiamo determinato la struttura crio-EM di ACLY nella forma apo, che siamo stati in grado di risolvere alla risoluzione 4.3-Å (Dati estesi Fig. 4a e Tabella 1)., Un confronto tra le strutture ACLY-apo e ACLY–citrato-CoA rivela che, nello stato apo, ciascuna delle coppie di CENERI alle estremità opposte del tetramero viene ruotata l’una verso l’altra di ~10° per formare un tetramero ACLY più aperto e posizionare i domini di CENERE in posizioni che sembrano disfavorare il legame produttivo del CoA (Fig. 3). In particolare, i loop ASH centrati su F533, S574 e K1018 (dal dominio CSH adiacente) si scontrerebbero con il CoA come legato nella struttura ACLY–citrato-CoA (Fig. 3 ter)., Inoltre, i due residui che si trovano all’interno della distanza di legame tra idrogeno e CoA dal dominio delle CENERI, R576 e E599, si spostano dalla distanza di legame tra idrogeno nella struttura ACLY – apo (Fig. 3 quater). Nel frattempo, il modulo CSH rimane in gran parte invariato tra le due strutture. Insieme, un confronto tra le strutture ACLY-apo e ACLY–citrato-CoA rivela che la struttura ACLY-apo deve riorganizzarsi per ospitare il substrato di CoA.
a, Sovrapposizione di ACLY-apo (arancione) e ACLY–citrate-CoA (verde). CoA è mostrato in magenta. b, Primo piano del CoA estratto dalla struttura ACLY–citrato-CoA sovrapposta alla struttura ACLY-apo, illustrando scontri significativi di CoA che si verificherebbero con ACLY non legato, in particolare con residui F533 e K1018., c, Vista ingrandita intorno al CoA della sovrapposizione delle strutture ACLY-apo e ACLY–citrato-CoA, evidenziando il movimento di R576 e E599 da ACLY-apo a strutture ACLY–citrato-CoA all’interno della distanza di legame dell’idrogeno del CoA.
Il complesso ACLY–acetil-CoA–OAA rivela che la reazione della liasi del COA si verifica nel dominio delle CENERI
I dati di fluorimetria a scansione differenziale hanno rivelato che sia i prodotti acetil-CoA che OAA hanno stabilizzato la proteina ACLY (Dati estesi Fig. 1c)., Questa scoperta ha indicato che potremmo catturare il complesso di prodotti ACLY–OAA–acetil-CoA e quindi comprendere meglio il meccanismo di reazione. A tal fine, abbiamo determinato la struttura crio-EM del complesso, che abbiamo risolto alla risoluzione 3.1-Å usando la simmetria D2 (Dati estesi Fig. 4). La struttura complessiva del complesso ACLY–co-prodotto era più simile al complesso simmetrico ACLY-co-substrato (ACLY-citrato-CoA-D2), con una deviazione complessiva radice-media-quadrato (r.m.s.d.) di 0,407 Å per gli atomi di Ca (Fig. 4 bis)., Abbiamo scoperto che l’acetil-CoA occupava lo stesso sito di legame del CoA ed era anche stabilizzato dagli stessi residui di base, R576 e K964 (Fig. 4 ter). Inoltre, siamo stati in grado di modellare in modo inequivocabile due molecole OAA legate a ciascuna subunità ACLY (Fig. 4 ter, lettera c). Una molecola OAA (OAA1) si sovrappone con la tasca legante citrato all’interno del dominio CENERE e prossimale al gruppo acetile di acetil-CoA. OAA1 fa interazioni relativamente modeste con la proteina, compresi i legami idrogeno con N346 e T348 e le interazioni di van der Waals con F547., L’altra molecola OAA (OAA2) è legata al dominio CSH e fa interazioni più estese con ACLY rispetto a OAA1. OAA2 contatta il modulo CSH attraverso legami idrogeno con H900, D1026, R1065 e R1085 e attraverso le interazioni di van der Waals con F935 e F1061 da una subunità, nonché attraverso un legame idrogeno con R1065 da un’altra subunità (Fig. 4 quater). OAA2 si sovrappone bene con bound OAA in pig heart citrate synthase25 (Dati estesi Fig. 5 ter).
a, Confronto delle strutture ACLY–citrato-CoA (grigio) e ACLY–OAA–acetil-CoA (aqua). Le molecole legate di acetil-CoA (viola) e OAA 1 e 2 (giallo) sono mostrate nel rendering CPK. b, vista ingrandita della superficie elettrostatica di ACLY intorno ai siti di legame CoA e OAA, evidenziando i leganti legati (bastoni) e la corrispondente densità di crio-EM (mesh). Vengono mostrati i residui chiave che interagiscono con i metaboliti legati., c, Close-up view of hydrogen-bonding and van der Waals interactions with OAA1 (left) and OAA2 (right). d, Diagramma del cambiamento di fluorescenza allo stato stazionario di ACLY in funzione dell’aumento delle concentrazioni di citrato in assenza (blu) o presenza (arancione) di 200 µM di CoA. Le linee continue mostrano la migliore vestibilità per un modello di rilegatura a sito singolo. e, Diagramma del cambiamento di fluorescenza allo stato stazionario di ACLY in funzione dell’aumento delle concentrazioni di OAA. Le linee continue mostrano la migliore adattabilità a un modello di rilegatura a un sito (blu) e a un modello di rilegatura a due siti (arancione)., I dati in d ed e sono tracciati come errore medio ± standard della media generata da n = 4 esperimenti indipendenti e sono disponibili come dati di origine.,
Fonte dati
Abbiamo anche perfezionato il cryo-EM mappa del ACLY–OAA–acetil-CoA, struttura senza vincoli di simmetria e ottenuto un’identica struttura e D2, simmetria, salvo che uno dei quattro acetil-CoA molecole hanno mostrato due possibili conformazioni del pantotenico braccio di acetil-CoA, uno con la cisteammina di CoA verso la CENERE di dominio, come negli altri tre protomers, e l’altra verso il CSH dominio (Extended Data Fig. 6 bis)., Tuttavia, a differenza della conformazione alternativa del CoA trovata nella struttura ACLY–citrato-CoA, la posizione del gruppo ADP fosforilato non è cambiata in queste due conformazioni. La potenziale conformazione alternativa dell’acetil-CoA potrebbe suggerire una possibile via di rilascio del substrato nel turnover enzimatico o uno stato autoinibitorio dell’enzima (discusso di seguito).
L’osservazione dei prodotti OAA1 e acetil-CoA nel dominio delle CENERI ha fortemente suggerito che la chimica della liasi viene effettuata lì, in contrasto con le precedenti proposte che questa chimica viene effettuata nel dominio CSH22,23., Ipotizziamo che OAA2 possa funzionare per aiutare a organizzare il dominio CSH per la cooperazione con il dominio ASH e / o agire come un secondo sito autoinibitorio del prodotto OAA che potrebbe sequestrare il braccio pantotenico dell’acetil-CoA (o la cisteamina del CoA) per sedersi attraverso il dominio CSH, in modo tale che il legame reciprocamente esclusivo del CoA in una conformazione produttiva sia inibito ad alte concentrazioni cellulari di OAA (Dati estesi Fig. 6 bis)., È interessante notare che, mentre l’orientamento CoA esteso produttivo con la cisteamina che punta verso il dominio delle CENERI non può essere modellato in ACLY-apo senza uno scontro sterico significativo (Fig. 2b), l’orientamento capovolto con la cisteamina che punta verso il dominio CSH può (Dati estesi Fig. 6 ter). Ciò è coerente con i nostri risultati che il CoA è in grado di legarsi ad ACLY in assenza di citrato e/o ATP (dati non mostrati), ma proponiamo una conformazione piegata, come osservato in uno dei protomeri ACLY–citrato-CoA-C1 (Fig. 1c (a destra) e Fig., 1d (a destra)) e anche la struttura isolata del domain22 CSH.
Coerentemente con l’ipotesi che OAA2 possa servire come un sito autoinibitorio ACLY, uno studio precedente ha dimostrato che OAA è in grado di inibire ACLY fegato di ratto in modo non competitivo con citrate26. Per convalidare il significato funzionale dei due siti OAA osservati nella struttura ACLY–OAA–acetil-CoA, abbiamo impiegato un esperimento di tempra a fluorescenza allo stato stazionario., Come esperimento di controllo, abbiamo prima titolato il citrato in ACLY in assenza o presenza di una concentrazione saturante di CoA e siamo stati in grado di adattare i dati a un sito di legame del citrato con valori Kd di 3,4 ± 0,5 µM e 1,4 ± 0,3 µM in assenza o presenza di CoA, con buoni valori R2 di 0,92 e 0,84, rispettivamente (Fig. 4d). Ciò è coerente con l’unico sito di legame del citrato osservato nella struttura cristallina del dominio ACLY ASH legato a citrate13 e la struttura cristallina di ACLY intatto legato a CoA e citrate22, mostrando che il CoA stabilizza il legame del citrato nel dominio ACLY ASH22., Successivamente abbiamo titolato OAA in ACLY e abbiamo scoperto che i dati si adattano significativamente meglio a un modello a due siti (R2 = 0,99) rispetto a un modello a un sito (R2 = 0,93) (Fig. 4 e). Il modello di legame a due siti ha accolto meglio la diminuzione della fluorescenza bifasica che diventa evidente a concentrazioni più elevate di OAA e dà origine a un sito di legame OAA ad alta affinità (Kd = 15 ± 4 µM) che rappresenta un terzo della variazione totale della fluorescenza e un sito di legame OAA a bassa affinità (Kd = 1.300 ± 500 µM) che rappresenta i restanti due terzi della variazione totale della fluorescenza (Fig. 4 e)., Questi dati sono coerenti con la rilevanza funzionale dei due siti di legame OAA osservati nella struttura ACLY–OAA–acetil-CoA.
ACLY-E599 è in grado di funzionare come un importante residuo catalitico
La struttura del co–prodotto ACLY ci ha permesso di affrontare una domanda di lunga data sul meccanismo molecolare ACLY. ACLY è proposto per fendere l’intermedio citril-CoA con l’aiuto di una base generale per estrarre un protone dal substrato del citrato e/o un acido generale per riprotonare il gruppo di uscita OAA16,27,28., Ciò è coerente con un’analisi del profilo del tasso di pH di ACLY con un pKa di ~8.5 (Fig. 5 bis). Ipotizziamo che l’E599 evolutivamente conservato sia posizionato per svolgere un importante ruolo catalitico, come base generale e/o acido, e / o per stabilizzare l’intermedio fosfo-citril-CoA (vedi sezione successiva e Fig. 4 ter). Un pKa relativamente alto per un residuo di glutammato sepolto è stato notato in precedenza29. Coerentemente con un importante ruolo catalitico per E599, abbiamo scoperto che i mutanti E599A e E599Q hanno un’attività significativamente compromessa (Fig. 1f), anche se il legame del cofattore non è stato influenzato (Fig. 5 ter)., Al contrario, abbiamo scoperto che un mutante E599D similmente acido esibiva un’attività simile a WT ACLY (Fig. 1f), con un profilo di pH simile (Fig. 5 bis). Presi insieme, i dati sostengono l’importanza di E599 per la catalisi da parte di ACLY.
a, profilo di pH dei mutanti ACLY-WT e ACLY-E599 (media ± deviazione standard, n = 3 repliche tecniche)., b, Calorimetria a scansione differenziale di ACLY-WT o ACLY-E599A con o senza citrato e COA cofattori (media ± deviazione standard, n = 2 repliche tecniche). La linea tratteggiata indica la temperatura media di fusione (Tm) per apo ACLY. I dati per a e b sono disponibili come dati di origine.,
Fonte dati
ACLY catalisi procede attraverso un fosfo-citryl-CoA intermedio nella CENERE di dominio
L’identificazione di E599 come un importante residuo catalitico per la scissione del citryl-CoA addotto acetil-CoA e OAA prodotti forniti per noi un’opportunità per intercettare un intermedio di reazione di un ACLY-E599Q mutante in presenza di ATP, citrato e CoA co-substrati., Abbiamo quindi mescolato il mutante ACLY-E599Q con concentrazioni saturanti di ATP, citrato e CoA (ACLY–E599Q-ATP-citrato-CoA) e determinato la sua struttura crio-EM, che siamo stati in grado di risolvere con una risoluzione complessiva di 2,85 Å. La struttura è stata determinata imponendo la simmetria D2 e ha rivelato che i domini ASH e CSH di ACLY erano disposti in modo simile al prodotto ACLY–citrato-CoA e alle strutture ACLY–OAA–acetil-CoA con valori r.m.s.d. per gli atomi di Ca di 0,584 e 0,620 Å, rispettivamente., Tuttavia, in contrasto con questi altri complessi di substrato e prodotto, il complesso ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA ha rivelato una densità crio-EM notevolmente ben definita nel sito attivo del dominio delle CENERI, che potrebbe essere modellata come ADP (ATP idrolizzato) e un intermedio fosfo-citril-CoA (Fig. 6 bis, lettera b). Inoltre, in contrasto con ciascuna delle altre strutture ACLY riportate in questo studio, l’amminoacido 752-767 loop che ospita il residuo H760, che ha dimostrato di mediare il trasferimento di fosfato dall’ATP al citrato, è ben ordinato nella struttura ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA (Fig. 6 quater)., Inoltre, si osserva che uno molecule di magnesio o una molecola d’acqua, anch’essa proposta per stabilizzare H760, è legata a E599 e al gruppo fosfato (Fig. 6 quater). Questa osservazione suggerisce che il residuo His760, il gruppo fosfato e lo ion di magnesio possono cooperare per stabilizzare il citrato per la legatura al CoA nel sito attivo del dominio della CENERE. Inoltre, il fatto che i prodotti acetil-CoA e OAA non siano osservati in questa struttura supporta ulteriormente le nostre conclusioni sul fatto che E599 svolge un importante ruolo catalitico nella scissione dell’intermedio fosfo-citril-CoA ai prodotti acetil-CoA e OAA all’interno del dominio delle CENERI.,
a, Struttura complessiva della struttura ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA, evidenziando l’ADP legato (ATP idrolizzato) e fosfo-citril-CoA intermedio. b, Primo piano dell’intermedio fosfo-citril-CoA, con la corrispondente densità di crio-EM. c, vista ingrandita delle interazioni della proteina prossimale all’intermedio del fosfo-citril-CoA., Sono mostrati residui che mediano i legami idrogeno o le interazioni di van der Waals con l’intermedio fosfo-citril-CoA.