The SSF concept
L’idea di eseguire simultaneamente l’idrolisi enzimatica e la fermentazione è stata avanzata da Gauss et al. in un brevetto del 1976 ., Gli autori hanno dichiarato che la resa di glucosio in una tradizionale idrolisi enzimatica separata (utilizzando enzimi prodotti dal fungo Trichoderma reesei) era bassa, probabilmente a causa dell’inibizione del prodotto finale dell’idrolisi da parte del glucosio e del cellobiosio. Gli autori potrebbero, tuttavia, dimostrare di aver ottenuto una maggiore resa complessiva di etanolo quando si utilizza SSF, che hanno attribuito alla rimozione di glucosio e cellobiosio dalla fermentazione e al conseguente rilascio di inibizione del prodotto finale., Il termine SSF (l’abbreviazione SSF è spesso usata anche per la fermentazione allo stato solido) non era usato dagli autori all’epoca, ma divenne la notazione comune per questo processo nel giro di pochi anni dall’invenzione originale. L’evitare l’inibizione del prodotto finale è ancora probabilmente la ragione più importante per l’utilizzo di SSF, ma ci sono diversi potenziali vantaggi aggiuntivi. Gauss e collaboratori hanno menzionato ad esempio il vantaggio che il glucosio non deve essere separato dalla frazione di lignina dopo una fase di idrolisi enzimatica separata, evitando così una potenziale perdita di zucchero., Inoltre, la combinazione di idrolisi e fermentazione riduce il numero di recipienti necessari e quindi i costi di investimento. La diminuzione degli investimenti di capitale è stata stimata superiore al 20%. Questo è abbastanza importante, poiché ci si può aspettare che i costi di capitale siano paragonabili ai costi delle materie prime nella produzione di etanolo da lignocellulosa . Altri vantaggi, relativi al co-consumo di zuccheri pentosi ed esosi e alla disintossicazione sono diventati evidenti più recentemente, come verrà discusso più avanti in questa recensione.,
Inevitabilmente, ci sono anche degli svantaggi di SSF rispetto al processo separato di idrolisi e fermentazione (SHF). La temperatura ottimale per l’idrolisi enzimatica è tipicamente superiore a quella della fermentazione-almeno quando si utilizza il lievito come organismo di fermentazione. In un processo SHF, la temperatura per l’idrolisi enzimatica può essere ottimizzata indipendentemente dalla temperatura di fermentazione, mentre un compromesso deve essere trovato in un processo SSF. Inoltre, il lievito non può essere riutilizzato in un processo SSF a causa dei problemi di separazione del lievito dalla lignina dopo la fermentazione., Pertanto, il lievito rappresenterà necessariamente una perdita di rendimento in un processo SSF, se il lievito è prodotto da carboidrati all’interno del processo (vedi Figura 1) o un costo di esercizio se viene fornito esternamente. Gli enzimi sono ugualmente difficili da riutilizzare, anche in un processo SHF. Gli enzimi sono prodotti all’interno del processo (cfr.figura 1) – rappresentando così una perdita di substrato – o sono forniti esternamente e quindi aumentano i costi chimici., Il ricircolo degli enzimi è altrettanto difficile poiché gli enzimi si legano al substrato, sebbene un desorbimento parziale possa essere ottenuto dopo l’aggiunta di tensioattivi .
Rappresentazione schematica di un processo SSF.
La disponibilità di materie prime lignocellulosiche varia a seconda della posizione geografica (vedi ad es., Kim e Dale), e le materie prime lignocellulosiche sono piuttosto eterogenee sia in termini di struttura che di composizione chimica (vedi Tabella 1). Questa eterogeneità ha un forte impatto sulla progettazione del processo, influenzando praticamente tutte le fasi del processo, ovvero la movimentazione meccanica del materiale, le condizioni di pretrattamento, la scelta degli enzimi e dei ceppi di lievito, nonché la separazione e le proprietà della lignina rimanente. Questo diventerà evidente nella discussione qui sotto.,
Pretrattamento
Lo scopo di pre-trattamento è quello di modificare il lignocellulosiche struttura e aumentare il tasso di idrolisi enzimatica principalmente di cellulosa. Questo dovrebbe essere fatto con una formazione minima di composti, che inibiscono i microrganismi fermentanti . La superficie accessibile è considerata uno dei fattori più importanti che influenzano l’efficacia della degradazione enzimatica della cellulosa ., Nel legno nativo solo una piccola frazione dei capillari della parete cellulare è accessibile agli enzimi . Il pretrattamento, tuttavia, aumenta l’area disponibile in diversi modi; i) si formano frammenti e crepe che producono un’area aumentata , ii) la frazione emicellulosa viene idrolizzata che diminuisce gli effetti di schermatura , iii) la lignina subisce anche cambiamenti strutturali e il legno viene delignificato in vari gradi, a seconda della tecnologia di pretrattamento . Pertanto, la schermatura delle microfibrille e l’occlusione dei pori, causata dalla lignina, possono essere rimossi., Altri fattori, che si ritiene influenzino la digeribilità in SSF, sono la cristallinità del substrato e il grado di polimerizzazione (DP) .
I metodi di pretrattamento possono essere suddivisi in metodi fisici e chimici, e le combinazioni di questi due sono comunemente usate (vedi ad esempio la recensione scritta da Mosier et al. ). Il tipo di materia prima influisce fortemente sulla scelta del metodo di pretrattamento. L’emicellulosa è, ad esempio, acetilata in misura elevata nei materiali ricchi di xilano., Poiché l’acetato viene liberato durante l’idrolisi, il pretrattamento di questi materiali è in una certa misura autocatalitico e richiede meno acido aggiunto e condizioni di processo più miti. Tuttavia, l’acetato liberato aggiunge alla tossicità degli idrolizzati dell’emicellulosa.
Il pretrattamento AFEX (Ammonia fiber / freeze explosion) è considerato un metodo interessante per il pretrattamento dei residui agricoli, producendo cellulosa altamente digeribile . AFEX depolimerizza la lignina, rimuove l’emicellulosa e decristallizza la cellulosa ., La temperatura moderata e il pH minimizzano anche la formazione di prodotti di degradazione dello zucchero. Tuttavia, il metodo soffre di alti costi di ammoniaca e recupero dell’ammoniaca . In questo contesto va menzionato anche il metodo della calce, a base di idrossido di calcio (o sodio). I pretrattamenti alcalini vengono eseguiti a temperature più basse per lunghi tempi di permanenza e, come per il metodo AFEX, si ottiene una delignificazione della biomassa.
L’esplosione di vapore è un metodo di pretrattamento intensamente studiato ., Gli effetti dell’esplosione di vapore non catalizzato – e dei pretrattamenti di acqua calda liquida-sulla biomassa sono principalmente attribuiti alla rimozione delle emicellulosi. Aggiungendo un catalizzatore acido, l’idrolisi può essere ulteriormente migliorata . I pretrattamenti acidi diluiti con H2SO4 o SO2 sono i metodi di pretrattamento più studiati a causa della loro efficacia e economicità. Questi metodi sono stati applicati in impianti pilota e, quindi, sono vicini alla commercializzazione . Il trattamento catalizzato acido migliora la rimozione dell’emicellulosa, dà un’idrolisi parziale della cellulosa e altera la struttura della lignina ., I principali inconvenienti sono legati ai requisiti delle apparecchiature di processo e alla formazione di inibitori . Finora, i pretrattamenti di successo con acqua calda alcalina , AFEX e liquida sono stati limitati ai residui agricoli e alle colture erbacee, mentre i pretrattamenti a vapore catalizzati dall’acido hanno generato elevate rese di zucchero da questi materiali e da materie prime di conifere .
Una semplice quantificazione della durezza di un processo di pretrattamento a vapore è il cosiddetto Fattore di gravità, log(R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Per i pretrattamenti catalizzati dall’acido viene talvolta utilizzato il fattore di gravità combinato, log(CS). Questo prende anche il pH in considerazione, log (CS) = log(R0) – pH, e valori tipici per acido catalizzato esplosione di vapore pretrattamento di conifere sono nell’intervallo 2 a 4 .
Le condizioni ottimali di pretrattamento in un processo SSF non differiscono necessariamente molto da quelle di un processo SHF che utilizza biomassa lignocellulosica. Tuttavia, diversi composti presenti negli idrolizzati di pretrattamento, che inibiscono l’idrolisi enzimatica, vengono convertiti dagli organismi fermentanti., Questa è una probabile spiegazione dietro le maggiori rese di etanolo riportate in SSF rispetto a SHF . La formazione di inibitori dal pretrattamento può quindi essere tollerata in misura maggiore in un processo SSF. I composti inibitori possono essere messi in tre gruppi principali; furaldeidi, acidi deboli e fenolici. Le due furaldeidi più comuni, HMF (5-idrossimetil-2-furaldeide) e furfurale (2-furaldeide), si formano in condizioni gravi da esosi e pentosi, rispettivamente ., Gli acidi deboli dei materiali lignocellulosici, come l’acido acetico, formico e levulinico, sono formati principalmente dalla de-acetilazione dell’emicellulosa o dalla rottura dell’HMF . I composti fenolici si formano principalmente durante la degradazione della lignina e si trovano in numerose varianti, a seconda del tipo di lignina . Per una discussione più approfondita sull’inibizione vedi ad esempio la recensione di Almeida et al .
Idrolisi enzimatica
Un pretrattamento riuscito ha in larga misura rimosso l’emicellulosa, lasciando la cellulosa disponibile per l’idrolisi., Poiché i microrganismi più comunemente usati per la produzione di etanolo utilizzano esclusivamente monomeri di zucchero, la cellulosa deve essere idrolizzata, che in un SSF si verifica in concomitanza con la fermentazione. Storicamente, la digestione industriale della cellulosa è stata fatta con idrolisi acida e l’ottimizzazione dell’idrolisi acida di vari materiali lignocellulosici è stata effettuata per scopi di produzione di etanolo ., L’idrolisi acida, tuttavia, produce idrolizzati che sono relativamente tossici per i microrganismi in fermentazione e la resa massima di glucosio è limitata a circa il 60% in un processo batch per ragioni cinetiche . La degradazione enzimatica della frazione di cellulosa, d’altra parte, ha il potenziale di produrre idrolizzati relativamente non tossici con rese zuccherine più elevate.
Enzimi specializzati nella rottura del β-1-4-i legami glicosidici del glucano sono collettivamente chiamati cellulasi. Nel 1950, Reese et al hanno presentato un modello di idrolisi enzimatica della cellulosa basata su enzimi multipli (C1 e CX)., Si è ipotizzato che l’enzima C1 produca catene polianidro-glucosio più corte, mentre la solubilizzazione è stata attribuita all’enzima CX. Fondamentalmente la stessa immagine si applica oggi, ma c’è stato un enorme progresso nella conoscenza di tutti i diversi componenti enzimatici specifici coinvolti. Le cellulasi sono suddivise in tre sottocategorie, che rappresentano tre tipi di attività: endoglucanasi, exoglucanasi (cellobioidrolasi) e β-glucosidasi., Le endoglucanasi riducono significativamente il grado di polimerizzazione del substrato attaccando casualmente le parti interne, principalmente nelle regioni amorfe della cellulosa. Le exoglucanasi (o cellobioidrolasi), d’altra parte, accorciano in modo incrementale le molecole di glucano legandosi alle estremità del glucano e rilasciando principalmente unità di cellobiosio. Infine, le β-glucosidasi dividono il disaccaride cellobiose in due unità di glucosio.,
Diversi tipi di microrganismi possono produrre sistemi di cellulasi tra cui funghi filamentosi aerobici, actinomiceti aerobici, batteri ipertermofili anaerobici e funghi anaerobici (vedi ad esempio recensione di Lynd et al. ). La ricerca intensiva sui funghi filamentosi aerobici T. reesei negli ultimi decenni ha portato ad un efficiente organismo produttore di cellulasi, che sta attualmente dominando la produzione industriale di cellulasi .
Come già accennato, un importante vantaggio con SSF rispetto a SHF è la riduzione dell’inibizione del prodotto finale da parte degli zuccheri formati nell’idrolisi., Il prodotto di fermentazione etanolo inibisce anche l’idrolisi, ma in misura minore rispetto cellobiose o glucosio . Un altro vantaggio è che gli inibitori del pretrattamento possono essere metabolizzati dai microrganismi . Tuttavia, anche il processo SSF può soffrire di idrolisi incompleta della frazione lignocellulosica solida. Ad eccezione dell’inibizione da parte dei prodotti finali o di altri componenti , ciò può essere dovuto alla disattivazione enzimatica, all’adsorbimento enzimatico improduttivo , alla diminuzione della disponibilità delle estremità della catena e all’aumento della cristallinità con la conversione della cellulosa pretrattata .,
In un SSF industriale, le concentrazioni enzimatiche e cellulari devono essere adeguatamente bilanciate al fine di ridurre al minimo i costi per la produzione di lieviti e enzimi. Le sinergie tra gli enzimi , ad esempio il sinergismo end-exo , il sinergismo exo-exo e il sinergismo tra end – o exoglucanasi e β-glucosidasi , dovrebbero essere ottimizzate anche sintonizzando la composizione delle miscele enzimatiche. La composizione ottimale dipenderà sicuramente dalla materia prima lignocellulosica.,
Microrganismi in fermentazione
I requisiti generali per un organismo da utilizzare nella produzione di etanolo sono che dovrebbe dare un alto rendimento di etanolo, un’alta produttività ed essere in grado di resistere ad alte concentrazioni di etanolo al fine di mantenere bassi i costi di distillazione . Oltre a questi requisiti generali, la tolleranza dell’inibitore, la tolleranza della temperatura e la capacità di utilizzare gli zuccheri multipli sono essenziali per le applicazioni di SSF. La tolleranza verso bassi valori di pH minimizzerà il rischio di contaminazione., Il cavallo da lavoro nella produzione di etanolo a base di amido o saccarosio è il lievito comune dei panettieri, Saccharomyces cerevisiae. Questo organismo produce etanolo ad alta resa (superiore a 0,45 g g-1 in condizioni ottimali) e un alto tasso specifico (fino a 1,3 g g-1 massa cellulare h-1 ). Inoltre ha una tolleranza molto alta dell’etanolo, oltre 100 g L-1 è stato segnalato per alcuni ceppi e mezzi . Inoltre, l’organismo ha dimostrato di essere robusto ad altri inibitori, e quindi è adatto per la fermentazione di materiali lignocellulosici .,
L’emicellulosa proveniente da latifoglie e residui agricoli è tipicamente ricca di xilani (cfr. Tabella 1) – legno duro contenente principalmente O-acetil-4-O-metil-glucuronossilano, mentre le erbe contengono arabinoxilano . L’emicellulosa di conifere, d’altra parte, contiene più mannani – principalmente nella forma del galattoglucomannano – e meno xilano. La fermentazione del mannosio è normalmente efficiente in S., cerevisiae, mentre la capacità di fermentare il galattosio è dipendente dal ceppo, e i geni per l’utilizzo del galattosio sono inoltre repressi dal glucosio , portando ad un tipico utilizzo sequenziale degli zuccheri. Chiaramente, la fermentazione dello xilosio è un problema più significativo per i residui agricoli e il legno duro rispetto al legno tenero. Lo xilosio non è metabolizzato da S. cerevisiae wild-type, a parte una riduzione minore a xilitolo. Questo, e per alcune parti la tolleranza alla temperatura, sono stati il motivo principale dietro l’interesse di testare anche altri microrganismi per la conversione della lignocellulosa in SSF.,
Lieviti naturalmente fermentanti xilosio, come Pichia stipitis e Candida shehatae , potrebbero potenzialmente essere vantaggiosi da utilizzare in SSF di materiali con alto contenuto di xilano. Tuttavia, la loro tolleranza ai composti inibitori negli idrolizzati di lignocellulosa non tossici è piuttosto bassa e, inoltre, è necessaria una fornitura di ossigeno molto bassa e ben controllata per un’efficiente fermentazione dello xilosio . I principali “concorrenti” al lievito sono stati i batteri Zymomonas mobilis e Escherichia coli geneticamente modificati. Z., mobilis, un batterio obbligatoriamente anaerobico, che manca di un sistema funzionale per la fosforilazione ossidativa, produce etanolo e anidride carbonica come principali prodotti di fermentazione. È interessante notare che Z. mobilis utilizza la via Entner-Duodoroff che fornisce una produzione di ATP inferiore per glucosio catabolizzato . Questo a sua volta dà una minore resa di biomassa e una maggiore resa di etanolo sul glucosio rispetto a S. cerevisiae . Tuttavia, wild-type Z. mobilis manca la capacità di fermentare gli zuccheri pentosi, e un grave inconveniente è inoltre che non è un organismo molto robusto., In generale, i batteri sembrano essere meno tolleranti agli inibitori derivati dalla lignocellulosa e potrebbe essere necessaria una fase di disintossicazione prima della fermentazione. A differenza del lievito di panetteria e dello Z. mobilis, E. coli è in grado di metabolizzare un’ampia varietà di substrati (inclusi esosi, pentosi e lattosio), ma l’organismo wild-type ha una via fermentativa mista ed è quindi un povero produttore di etanolo. In un contributo punto di riferimento, assegnato U. S. numero di brevetto 5000000 , un ceppo di E., coli è stato geneticamente modificato in un produttore di etanolo da sovraespressione di PDC (codifica piruvato decarbossilasi) e adhB (codifica alcol deidrogenasi) da Z. mobilis . Risultati eccellenti sono stati ottenuti con E. coli ricombinante, ad esempio il ceppo KO11, che ha mostrato rendimenti di etanolo da 86 a quasi il 100% delle concentrazioni teoriche e finali di etanolo fino a 40 g L-1 su idrolizzati di emicellulosa di bagassa, mais stover e gusci di mais ., Tuttavia, solo la frazione liquida è stata utilizzata negli studi riportati e gli idrolizzati sono stati ulteriormente disintossicati prima dell’uso mediante sovralimentazione a pH 9 con idrossido di calcio e quindi regolata a pH 6,0–6,5 con HCl. Inoltre, poiché il pH ottimale è 6.5, E. coli è meno adatto per processi SSF con cellulasi T. reesei, che generalmente è considerato avere un pH ottimale intorno a 4.8 .
Fermentazione pentosa da S. cerevisiae ingegnerizzato
Grazie alle proprietà molto attraenti di S., cerevisiae nelle fermentazioni industriali, ci sono stati sforzi significativi fatti negli ultimi decenni per progettare ceppi di fermentazione ricombinanti di xilosio e arabinosio di questo lievito. I ceppi fermentanti di xilosio di S. cerevisiae possono in linea di principio essere costruiti introducendo geni che codificano la xilosio isomerasi (XI) da batteri e funghi , o geni che codificano la xilosio reduttasi (XR) e la xilitolo deidrogenasi (XDH) da funghi . Anche il gene endogeno XKS1 che codifica la xilulochinasi (XK) deve essere sovraespresso per ottenere una significativa fermentazione dello xilosio ., Le proteine di trasporto sono necessarie per l’assorbimento dello xilosio e di altri zuccheri nel lievito. In S. cerevisiae, lo xilosio è stato trovato per essere trasportato dai trasportatori dell’esosio, ma l’affinità per xilosio è approssimativamente 200 volte più bassa che per glucosio . Di conseguenza, l’assorbimento dello xilosio è inibito competitivamente dal glucosio.
Ci sono 20 diversi geni che codificano proteine correlate al trasporto dello zucchero, 18 singoli sistemi (Hxt1-17 e Gal2) e due proteine del segnale correlate (Snf3p e Rgt2p)., I trasportatori mostrano diverse affinità per gli zuccheri e l’espressione dei loro geni corrispondenti è regolata dalle concentrazioni di zucchero, cioè dalla disponibilità della fonte di carbonio . In precedenza è stato suggerito che lo xilosio sia assorbito dai sistemi ad alta e bassa affinità dei trasportatori del glucosio (Figura 2), ma l’assorbimento è aumentato in presenza di basse concentrazioni di glucosio . Gli studi hanno indicato che i trasportatori dell’esosio di alto e intermedio-affinità; Hxt4, Hxt5 Hxt7 e Gal2 sono infatti i trasportatori più importanti per xilosio ., Inoltre, è stato dimostrato che è necessaria una concentrazione di glucosio bassa (ma diversa da zero) nel mezzo per un assorbimento efficiente dello xilosio . Ciò è stato spiegato dalla necessità di glucosio per l’espressione di enzimi glicolitici e intermedi , nonché dalla generazione di metaboliti intermedi per le fasi iniziali del metabolismo dello xilosio e della via del pentoso fosfato . Un’altra possibile spiegazione, dedotta da entrambi gli esperimenti e dalla modellazione al computer, è che il glucosio è necessario per l’espressione di trasportatori esosi con proprietà di trasporto dello xilosio favorevoli, ad esempio Hxt4 ., Di conseguenza, al fine di ottenere un’efficiente co-fermentazione di xilosio e glucosio in SSF (a volte indicato come SSCF – saccarificazione simultanea e co-fermentazione) con S. cerevisiae ricombinante, è necessario mantenere bassa la concentrazione di glucosio, come è stato dimostrato in pratica in recenti studi su SSF .
Schema semplificato di trasporto e metabolismo dello zucchero in S. cerevisiae. 1. Trasportatori esosi a bassa e media affinità. 2. Trasportatori esosi ad alta affinità., (Abbreviazioni: PPP, via dei pentoso fosfati; XR, xilosio reduttasi; XDH, xilitolo deidrogenasi; XK, xylulokinase; GK, glucochinasi; IGP, phosphoglucose isomerasi; PFK, fosfofruttochinasi; ANNUNCIO aldolasi; TPI, triose fosfato isomerasi; GDH, gliceraldeide-3-P deidrogenasi; GPD, glicerolo-3-P deidrogenasi; GPP, glicerolo-3-fosfato; PDC, piruvato decarbossilasi; ALD, acetaldeide deidrogenasi; ADH, l’alcol deidrogenasi)