Szerkezete ACLY a CoA kiderül, produktív, illetve terméketlen CoA conformations
Mi előállított rekombináns, teljes hosszúságú ACLY Escherichia coli a biokémiai, illetve strukturális elemzések (Extended Data Ábra. 1a, b)., Az enzim különböző kofaktorokkal végzett differenciálszkennelő fluorimetriája megerősítette az önmagában vagy kombinációban hozzáadott ligandumokhoz kapcsolódó kötési és potenciális szerkezeti változásokat (kiterjesztett adatok ábra. 1c). Ezeket az adatokat arra használtuk, hogy irányítsuk az ACLY szerkezetmeghatározását a társ-szubsztrátumokkal vagy a társtermékekkel.
elkészítettük a rekombináns fehérjét, és kezdetben negatív foltos egyrészecske-analízist végeztünk a fehérje metabolitok (ACLY-apo) hiányában., A kétdimenziós (2D) osztály átlagok 3000 részecskék megerősítette, hogy a fehérje képződött tetramer (kiterjesztett adatok ábra. 2a, b). További szerkezeti részletek elérése érdekében cryo-EM tanulmányt végeztünk az ACLY-citrate-CoA komplexről. A krio-EM minták optimalizálásának több fordulója után meghatároztuk az ACLY-citrate-CoA szerkezet D2 szimmetrikus krio–EM szerkezetét az átlagos 3.0 Å felbontásig. (Bővített Adatok Füge. 2c, d, 3 és 4 és 1. táblázat).,
az ACLY–citrate-CoA szerkezet homotetramert képez egy központi tetramer CSH modullal és két hamu domainnel a CSH modul ellentétes végein (protomerek 1 & 2 és 3 & 4) (ábra. 1a, b). A HAMUTARTOMÁNY (1-806-os maradványok) a citráthoz és ADP24-hez kötődő izolált N-terminális domain korábban jelentett α/β architektúrájához nagyon hasonló struktúrát alkalmaz., A CSH tartomány (maradék 859-1101) kizárólag hélixekből és rövid hurkokból áll, szerkezeti homológiával a ~90° – os szögben keresztező citrát szintáz dimerek dimerjéig (kiterjesztett adat ábra). 5a). Az egyes polipeptidláncok hamutartalmát és CSH-tartományait a 824 és a 829 maradványok közötti rövid α-hélix kivételével nagyrészt kiterjesztett ~50 maradékú tekercsrégió köti össze. A spirális régió ezen a linkeren belül az egyetlen jelentős érintkezési pont (van der Waals interakció) a molekula egyik oldalán lévő két HAMUTARTOMÁNY között., A kiterjesztett linker lehetővé teszi az egyik alegység CSH-jának, hogy kölcsönhatásba lépjen egy másik alegység hamu tartományával a CSH modul másik oldalán. A hamu protomerek közötti viszonylag ritka kölcsönhatásokkal ellentétben a CSH domének túlnyomórészt van der Waals kölcsönhatások kiterjedt hálózatát alkotják, amelyek azt sugallják, hogy a CSH domének merev tetramerikai modulként működnek, míg a négy HAMUTARTOMÁNY rugalmasabb. Ez összhangban van a megfigyelt em helyi felbontás becslésével az EM térképen, amely a legmagasabb a CSH tartományban (2.8 Å, kiterjesztett adatok ábra., 4c) és korábbi megfigyeléseink szerint a CSH-tartománynak magasabb olvadási hőmérséklete van a ~75 °C-os hamuhoz képest, szemben a ~55 °C-kal, 21.
a CoA az egyes alegységek CSH és ASH tartományai közötti interfészen kötődik össze, és úgy tűnik, hogy a szuperdomaineket “összeköti”. Az adenin-bázis és a ribóz-gyűrű kölcsönhatásba lép az egyik monomer és a pantotén kar CSH-tartományával, valamint a β-merkapto csoport egy másik alegység HAMUTARTOMÁNYÁNAK aktív helyére tapadva (1.ábra). 1c (balra) és Fig. 1D (balra))., A CoA modellezése azon a megfigyelésen alapul, hogy a foszforilált ADP csoport jól megoldódott a krio-EM sűrűségben. A merkapto csoport azonban nem volt jól megoldva, ami a régió rugalmasságát sugallja. Bár több maradékainak CSH meg ASH domainek, hogy van der Waals kölcsönhatások CoA, hidrogén kötések a S574, R576, valamint S577 a HAMU domain K964 a CSH domain a ribóz foszfát oxygens jelenik meg kell játszani egy különösen fontos szerepe van a kötési CoA a HAMU–CSH felület., Érdekes módon az E599 hidrogénkötési távolságon belül van a CoA modellezett kénatomjához, ami azt sugallja, hogy fontos katalitikus szerepet játszhat. A HAMUTARTALOMBÓL és CSH–tartományból származó protein-CoA kölcsönhatások jelentőségét az r576 és K964 szermaradékok mutációs érzékenysége támasztja alá, és az e599 potenciális katalitikus szerepét az A vagy Q mutációs érzékenysége támasztja alá, de nem D (ábra. 1f). Bár a Cryo-EM rekonstrukció mintájába citrát került, a cryo-EM térképen nem lehetett magabiztosan megoldani.,
tekintettel a CoA merkapto-csoportjának megoldatlan sűrűségére, elvégeztük az ACLY-citrate-CoA struktúra újabb rekonstrukcióját anélkül, hogy D2 szimmetriát írnánk elő annak meghatározására, hogy a CoA különböző protomerekben eltérő konformációkat fogad-e el. 3,5 Å névleges felbontásra szimmetria (C1, aszimmetrikus zárt) nélkül tudtunk rekonstrukciót készíteni. Ebben az ACLY–citrate-CoA-C1 aszimmetrikus zárt szerkezetben a hamu tartomány körüli felbontás gyengébb, mint a D2 struktúrában, de a csh tartomány körüli helyi felbontás viszonylag magas, 2,8-3,2 Å., Ennek az ACLY–citrate-CoA-C1 aszimmetrikus zárt szerkezetnek az elemzése azt mutatta, hogy a HAMUTARTOMÁNYOK mindegyike, valamint a négy CSH domén és CoA molekula közül három ugyanolyan konfigurációt kapott, mint a D2 szerkezet. Az egyik CoA-molekula azonban egy alternatív konformációt alkalmaz, amelyben a foszforilált ADP-rész ~8 Å-t tolódik el a CSH-modul felé, a pantotén kar pedig meghajlik, hogy kölcsönhatásba lépjen a CSH-val (ábra. 1b, c (jobbra) és Fig. E.1. Az alternatív Koa konformációnak megfelelő krio-EM sűrűség nagyon világos (ábra. 1c (jobbra))., Figyelemre méltó, hogy a cryo-EM sűrűséget egy jól rendezett vízmolekula esetében is megfigyelték, amely úgy tűnik, hogy áthidalja a hidrogénkötési kölcsönhatásokat a COA terminális kénatom között a H900, D1026 és R1065 oldalláncmaradványaival, további van der Waals kölcsönhatásokkal az L969, I973, H975 és R976 (ábra. 1d (jobbra)). Ezzel az alternatív CoA konformációval egyidejűleg a csh-tartományon belüli hurok (965-986 maradványok)és a szegélyező spirálok eltolódnak, hogy megfeleljenek a CoA adenin bázis alternatív helyzetének (2. ábra). E.1., A h975, R976, D1026 és R1065 mutációi az alaninhoz képest mind veszélyeztetett aktivitást mutatnak, ami arra utal, hogy a CoA kötődése a CSH doménhez valamilyen módon részt vesz az enzimaktivitásban (ábra. 1f). Tekintettel arra, hogy CoA kell reagálni a citrát a HAMU domain, utalunk a CoA conformations a ciszteamin a pantothenic kar, hogy pont felé a VAKUT vagy a CSH, mint a ‘termékeny’, illetve ‘meddő’ CoA conformations, illetve köteles ACLY.,
Szerkezet a ACLY–citrát-CoA betelepített alpopuláció kiderül, aszimmetrikus ASH irányok
amellett, hogy a fő ACLY–citrát-CoA részecske lakosság, ami 57% – a, a osztály 3 részecskék, a betelepített alpopuláció a ACLY–citrát-CoA összetett részecskék képviselő 23% – a alosztály a részecskék (10% – os általános) is készített 3D rekonstrukciója nélkül impozáns szimmetria, hogy felbontás 4.3 Å (Extended Data Ábra. 3)., Ez a betelepített alpopuláció részecskék általános szerkezete hasonló az őrnagy ACLY–citrát-CoA lakosság, kivéve, hogy az egyik a négy ASH tartományok forog ~50° felé a legközelebbi ASH alegység, hogy fogadjon el egy több, a “megnyitás” felépítésű, így hivatkoznak rá, mint ‘ACLY–citrát-CoA-C1 asymm megnyitás’. Ebben a struktúrában a sűrűség csak a két CoA-molekula foszforilált ADP-részénél látható, amelyek két szimmetrikus HAMUTARTALOMHOZ vannak kötve (ábra. 2a, b). Az egyik szimmetrikus és aszimmetrikus hamutartalom nem mutat bizonyítékot a CoA-kötésre., Nevezetesen, az aszimmetrikus hamu tartomány összeférhetetlennek tűnik a produktív CoA kötéssel (ábra. 2c). Azt javasoljuk, hogy ez az ACLY-citrate-CoA-C1 asymm nyitott szerkezet az ACLY köztes állapotát képviseli,ahol két aktív helyet katalízisre alapoznak, kettő pedig nem. Ennek a struktúrának a megfigyelése azt is sugallja, hogy a négy ACLY aktív hely önállóan működhet.
a, az ACLY–citrate-CoA-C1 teljes szerkezete, amely tartalmazza az aszimmetrikus hamu alegységet, és kiemeli a két kötött CoA molekulát zöldben. A megfelelő cryo-EM sűrűségű két CoA kötőhely egyikének kibővített nézete látható. b, A szimmetrikus (D2) és aszimmetrikus (C1 asymm open) ACLY–citrate-CoA szerkezetek átfedése., c, a COA átfedése a szimmetrikus ACLY–citrate-CoA (D2) szerkezetben az ACLY–citrate-CoA (C1 asymm open) szerkezet aszimmetrikus HAMUTARTALMÁRA kötve, szemléltetve, hogy az aszimmetrikus hamutartalom összeegyeztethetetlen a produktív CoA-kötéssel. Az ACLY szerkezet semleges, elektropozitív és elektronegatív felületei Fehér, kék, illetve piros színűek.,
az ACLY-apo állapot szerkezete kedvezőtlen a CoA-kötéshez
mivel a csh és ASH tartományok között korlátozott kölcsönhatások vannak, érdeklődtünk az ACLY szerkezetéről kötött ligandumok hiányában. Ehhez meghatároztuk az ACLY cryo-EM szerkezetét az apo formában, amelyet 4.3-Å felbontásra tudtunk megoldani(kiterjesztett adatok ábra. 4a és 1. táblázat)., Az ACLY-apo és az ACLY–citrate-CoA szerkezetek összehasonlítása azt mutatja, hogy az apo állapotban a tetramer ellentétes végein lévő HAMUPÁROKAT ~10° – kal elforgatják egymás felé, hogy nyitottabb ACLY tetramer alakuljon ki, és a HAMUTARTOMÁNYOKAT olyan pozíciókba helyezzék, amelyek látszólag diszfavoratív CoA-kötődést mutatnak (ábra. 3). Pontosabban, az F533, S574 és K1018 (a szomszédos CSH tartományból) középpontú HAMUSZÜRKÉK ütköznének az ACLY–citrate-CoA szerkezetben kötött CoA-val (ábra. 3b)., Ezenkívül a HAMUTARTOMÁNYBÓL, az R576-ból és az E599-ből származó, a CoA-hoz hidrogénkötési távolságon belül lévő két maradék az ACLY-apo szerkezetben (2. 3c). Eközben a CSH modul nagyrészt változatlan marad a két struktúra között. Az ACLY-apo és az ACLY–citrate-CoA struktúrák összehasonlítása együttesen azt mutatja, hogy az ACLY-apo struktúrának átrendeződnie kell a CoA szubsztrát befogadására.
a, ACLY-apo (orange) és ACLY–citrate-CoA (green) egymásra helyezése. CoA látható bíbor. b, az ACLY-citrate–CoA szerkezetből extrahált CoA közelképe, amely az ACLY-apo szerkezetre helyezkedik el, bemutatva a CoA jelentős összecsapásait, amelyek az acly-val fordulnak elő, különösen az F533 és K1018 maradékanyagokkal., c, az ACLY-apo és az ACLY–citrate-CoA struktúrák szuperpozíciójának CoA körüli megnagyobbodott nézet, kiemelve az R576 és E599 mozgását az ACLY-apo–tól az ACLY-citrate-CoA szerkezetekig a COA-tól számított hidrogénkötési távolságon belül.
ACLY-acetyl-CoA-OAA komplex CoA–citrát-lyáz reakciót tár fel a hamu tartományban
differenciális szkennelési fluorimetriai adatok azt mutatták, hogy mind az acetil-CoA, mind az OAA termékek stabilizálták az ACLY fehérjét(kiterjesztett adatok ábra. 1c)., Ez a megállapítás azt mutatta, hogy meg tudjuk ragadni az ACLY-OAA-acetil-CoA termékkomplexet, így jobban megértjük a reakciómechanizmust. Ebből a célból meghatároztuk a komplex krio-EM szerkezetét, amelyet D2 szimmetriával 3,1-Å felbontásra határoztunk meg(kiterjesztett adatok ábra. 4). Az ACLY–Co-product komplex teljes szerkezete leginkább a szimmetrikus ACLY–Co-szubsztrát (ACLY–citrate-CoA-D2) komplexhez volt hasonló, a Ca atomok esetében 0,407 Å általános gyökér-Közép-négyzet eltéréssel (R.m.S.d.) (ábra). 4a)., Megállapítottuk, hogy az acetil-CoA ugyanazt a kötőhelyet foglalja el, mint a CoA, és ugyanazokkal az alapmaradványokkal, az R576 és a K964 (ábra. 4b). Ezenkívül egyértelműen két OAA molekulát tudtunk modellezni, amelyek az egyes ACLY alegységekhez vannak kötve (ábra. 4b, c). Egy OAA molekula (OAA1) átfedésben van a hamutartományban lévő citrátkötő zsebbel, és az acetil-CoA acetilcsoportjához közel helyezkedik el. Az OAA1 viszonylag szerény kölcsönhatásokat tesz lehetővé a fehérjével, beleértve az n346-hoz és a t348-hoz, valamint a van der Waals-hoz kötődő hidrogénkötéseket az F547-Tel., A másik OAA molekula (OAA2) kötődik a CSH doménhez, és kiterjedtebb kölcsönhatásokat hoz létre az ACLY-val, mint az OAA1. Az OAA2 hidrogénkötésekkel lép kapcsolatba a CSH modullal a H900, D1026,R1065 és R1085, valamint van der Waals kölcsönhatások révén az F935 és F1061 egy alegységből, valamint hidrogénkötéssel az r1065-re egy másik alegységből (ábra). 4c). OAA2 átfedi jól kötött OAA sertés szív citrát synthase25 (kiterjesztett adatok ábra. 5b).
a, Acly–citrate-CoA (gray) és ACLY–OAA–acetyl-CoA (aqua) szerkezetek összehasonlítása. A kötött acetil-CoA (lila) és OAA molekulák 1 és 2 (Sárga) CPK renderelésben jelennek meg. b, a CoA és OAA kötőhelyek körüli ACLY elektrosztatikus felületének megnagyobbított képe, kiemelve a kötött ligandumokat (botokat) és a megfelelő krio-EM sűrűséget (hálót). A kötött metabolitokkal kölcsönhatásba lépő kulcsfontosságú maradékok láthatók., c, Közelkép a hidrogénkötésről és a van der Waals kölcsönhatásáról az OAA1-gyel (balra) és az OAA2-vel (jobbra). d, Plot a steady-state fluoreszcencia változás ACLY függvényében növekvő koncentrációban citrát hiányában (kék) vagy jelenléte (narancs) 200 µM CoA. A szilárd vonalak a legjobban illeszkednek az egyhelyes kötési modellhez. e, az ACLY egyensúlyi fluoreszcencia változásának ábrázolása az OAA koncentrációjának növelésével. A tömör vonalak a legjobban illeszkednek az egyhelyes kötési modellhez (kék) és a kéthelyes kötési modellhez (narancssárga)., A d-ben és e-ben szereplő adatok az N = 4 független kísérletből származó átlag ± standard hibájaként vannak ábrázolva, és forrásadatként állnak rendelkezésre.,
Forrás adatokat,
Mi is finomított a krio-EM térkép a ACLY–OAA–acetil-CoA szerkezet nélkül szimmetria korlátok kapott egy azonos szerkezetű, D2 szimmetria, kivéve, hogy az egyik a négy acetil-CoA molekulák mutatott két lehetséges conformations a pantothenic kar acetil-CoA, a ciszteamin a CoA felé a VAKU tartomány, mint a másik három protomers, a másik felé a CSH domain (Extended Data Ábra. 6a)., Azonban, ellentétben az ACLY–citrate-CoA szerkezetben található CoA alternatív konformációjával, a foszforilált ADP csoport helyzete nem változott ebben a két konformációban. Az acetil-CoA potenciális alternatív konformációja az enzimforgalomban vagy az enzim autoinhibitív állapotában lehetséges szubsztrát-felszabadulási útvonalra utalhat (az alábbiakban tárgyaljuk).
az OAA1 és az acetil-CoA termékek megfigyelése a HAMUTARTOMÁNYBAN erősen azt sugallta, hogy a lyázkémia ott történik, ellentétben a korábbi javaslatokkal,amelyek szerint ezt a kémiát a CSH domain22, 23-ban végzik., Úgy gondoljuk, hogy az OAA2 működhet, hogy segítsen megszervezni a CSH domain együttműködés a hamu domain és/vagy jár, mint egy második OAA termék autoinhibitory helyszínen, amely képes lekötni a pantotén kar acetil-CoA (vagy a ciszteamin CoA), hogy üljön át a CSH domain, oly módon,hogy a kölcsönösen kizáró kötődés CoA produktív konformáció gátolják a magas sejt OAA koncentrációban (kiterjesztett adatok ábra. 6a)., Érdekes, hogy míg a produktív kiterjesztett CoA orientáció a ciszteamin felé mutató hamu tartomány nem lehet modellezni ACLY-apo nélkül jelentős steric összecsapás (ábra. 2b), a tükrözött orientáció a ciszteamin felé mutató csh domain lehet (kiterjesztett adatok ábra. 6b). Ez összhangban van azzal a megállapítással, hogy a CoA citrát és/vagy ATP hiányában képes az ACLY-hez kötődni( az adatok nem jelennek meg), de hajlított konformációt javasolunk, amint azt az ACLY–citrate-CoA-C1 protomerek egyikében megfigyeltük (ábra. 1c (jobbra) és Fig., 1d (jobbra)), valamint a CSH domain22 izolált szerkezete.
összhangban azzal a hipotézissel, hogy az OAA2 ACLY autoinhibitory helyként szolgálhat, egy korábbi tanulmány kimutatta, hogy az OAA képes gátolni a patkánymájat ACLY módon, amely nem versenyképes a citrate26-tal. Az ACLY–OAA–acetil-CoA szerkezetben megfigyelt két OAA-hely funkcionális jelentőségének érvényesítéséhez steady-state fluoreszcencia kioltási kísérletet alkalmaztunk., Mint a kontroll kísérletet, először egyéni citrát a ACLY a hiánya vagy jelenléte telítődik koncentrációja CoA volt képes, hogy illeszkedjen az adatokat egy citrát kötőhely a Kd értékek 3.4 ± 0.5 µM 1,4 ± 0.3 µM a hiánya vagy jelenléte CoA, jó R2 értékek 0.92 0.84, valamint, illetve (Fig. 4d). Ez összhangban van a citráthoz kötődő ACLY ASH domén kristályszerkezetében13, valamint a CoA-hoz és citráthoz kötött ép ACLY KRISTÁLYSZERKEZETÉBEN22 megfigyelt egy citrátkötési helygel, ami azt mutatja, hogy a CoA stabilizálja a citrát kötődését az ACLY ASH domain22-ben., Mi a következő beállítani, OAA a ACLY, majd megállapította, hogy az adatok illik lényegesen jobb, hogy egy két helyszínen modell (R2 = 0,99), mint egy webhely modell (R2 = 0.93) (Fig. E.4. A két helyszínen kötelező modell jobb alkalmazkodást a kétfázisú fluoreszcencia csökkenés, ami nyilvánvalóvá válik, hogy a magasabb OAA esetén ad okot, hogy egy nagy affinitású OAA kötőhely (Kd = 15 ± 4 µM), hogy a számlák egyharmada a teljes fluoreszcencia változás, illetve alacsony affinitású OAA kötőhely (Kd = 1,300 ± 500 µM) a számlák, a fennmaradó kétharmad a teljes fluoreszcencia-változás (Fig. E.4., Ezek az adatok összhangban vannak az ACLY–OAA–acetil-CoA szerkezetben megfigyelt két OAA kötőhely funkcionális relevanciájával.
az ACLY-E599 fontos katalitikus szermaradékként működik
az ACLY–Co-product szerkezete lehetővé tette számunkra, hogy egy régóta fennálló kérdéssel foglalkozzunk az ACLY molekuláris mechanizmussal kapcsolatban. Az ACLY azt javasolja, hogy a citril-CoA köztiterméket egy általános bázis segítségével hasítsák ki a citrát szubsztrátból származó proton és/vagy egy általános sav kivonására,hogy az OAA elhagyó csoportját reprotonálják16,27, 28., Ez összhangban van az ACLY pH-érték profil elemzésével, ~8,5 pKa-val (ábra. 5a). Feltételezzük, hogy az evolúciósan konzervált E599 fontos katalitikus szerepet játszik, mint általános bázis és/vagy sav, és/vagy a foszfo-citril-CoA közbülső stabilizálására (lásd a következő részt és az ábrát. 4b). Korábban viszonylag magas PKA-t figyeltek meg egy eltemetett glutamátmaradványhoz29. Az E599 fontos katalitikus szerepével összhangban megállapítottuk, hogy az E599A és az E599Q mutánsok jelentősen veszélyeztetik az aktivitást (ábra. 1f), annak ellenére, hogy a kofaktor kötés nem volt hatással (ábra. 5b)., Ezzel szemben azt találtuk, hogy egy hasonlóan savas e599d mutáns hasonló aktivitást mutatott, mint a WT ACLY (ábra. 1F), hasonló pH-érték profillal (ábra. 5a). Az adatok együttesen vitatják az E599 fontosságát az ACLY katalíziséhez.
a, az ACLY-WT és az ACLY-E599 mutánsok pH-értéke (átlagos ± szórás, n = 3 technikai replikáció)., b, acly-WT vagy ACLY-E599A differenciál pásztázó kalorimetriája citráttal és CoA-kofaktorokkal vagy anélkül (átlagos ± szórás, n = 2 technikai replikáció). A szaggatott vonal az apo ACLY átlagos olvadási hőmérsékletét (TM) jelzi. Az A és b adatok forrásadatként állnak rendelkezésre.,
Forrás adatokat,
ACLY katalízis bevétel keresztül phospho-citryl-CoA közbenső a VAKU tartomány
Az azonosító E599 fontos katalitikus maradék a dekoltázs, a citryl-CoA adduktot is, hogy acetil-CoA, valamint OAA termékek biztosított számunkra a lehetőséget, hogy csapda reakció köztes egy ACLY-E599Q mutáns jelenlétében az ATP, citrát, CoA co-hordozók., Ezért összekeverjük az ACLY-E599Q mutánst az ATP, a citrát és a CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrát-CoA) telítődési koncentrációival, és meghatároztuk a cryo-EM szerkezetét, amelyet 2,85 Å-es általános felbontásra tudtunk megoldani. A szerkezetet D2 szimmetriával határozták meg, és kiderült, hogy az ACLY hamu és CSH doménjei az ACLY–citrát-CoA termékhez és az ACLY–OAA–acetil-CoA szerkezetekhez hasonlóan vannak elrendezve, r. m. S. d. értékekkel a Ca atomok 0,584, illetve 0,620 Å értékei., Az ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA komplex azonban más szubsztrát-és termékkomplexekkel ellentétben rendkívül jól definiált krioem sűrűséget tárt fel a HAMUTARTOMÁNYBAN, amelyet ADP-ként (hidrolizált ATP) és foszfo-citril-CoA közbenső anyagként lehet modellezni (ábra). 6a, b). Továbbá, ellentétben minden más ACLY struktúrák számolt be a tanulmány, az aminosav-752-767 hurok menedéket a H760 maradvány, amelyek kimutatták, hogy a mediációt a foszfát át az ATP, hogy citrát, a jól rendezett a ACLY-E599Q–ATP-citrát-CoA szerkezet (Fig. 6c)., Ezenkívül egy magnézium-ion vagy vízmolekula, amelyet szintén javasoltak a H760 stabilizálására, megfigyelhető, hogy az e599-hez és a foszfátcsoporthoz kötődik (ábra. 6c). Ez a megfigyelés arra utal, hogy a His760 maradék, foszfát-csoport és magnézium-ion együttműködhet a citrát stabilizálásában a CoA-hoz való kötéshez a HAMUTARTOMÁNY aktív helyén. Ezen túlmenően az a tény, hogy az acetil-CoA és az OAA termékek nem figyelhetők meg ebben a struktúrában, alátámasztja azt a következtetésünket, hogy az e599 fontos katalitikus szerepet játszik a foszfo-citril-CoA köztes anyag hasításában az acetil-CoA és az OAA termékekhez a HAMUTARTOMÁNYON belül.,
a, az ACLY-E599Q–ATP-citrate-CoA szerkezet teljes szerkezete, kiemelve a kötött ADP-t (hidrolizált ATP) és a foszfo-citril-CoA közbenső anyagot. b, a foszfo-citril-CoA köztes közelítése, a megfelelő krio-EM sűrűséggel. c, a foszfo-citril-CoA intermedierhez közeli fehérje kölcsönhatások megnagyobbodott képe., A foszfo-citril-CoA intermedierrel való kölcsönhatásokat hidrogénkötéseket vagy van der Waals-t közvetítő maradványok jelennek meg.