A DNS szekvenálás alternatív stratégiái több kategóriába sorolhatók(amint azt korábban a ref. 4). Ezek közé tartoznak az i. mikroelektroforetikus módszerek9 (1. rovat), II. hibridizációval történő szekvenálás10 (2. rovat), iii. egyrészes molekulák valós idejű megfigyelése11, 12 (3. rovat) és iv. ciklikus tömb szekvenálás (J. S. et al.13 és ref. 14)., Itt van, hogy használjuk, második generációs’ hivatkozás a különböző implementációk a ciklikus-tömb szekvenálás, hogy a közelmúltban megvalósult egy kereskedelmi termék (pl., 454 szekvenálás (használt 454 Genom Szekvenszer, Roche Alkalmazott Tudomány; Bázel), Solexa technológia (használt Illumina (San Diego) Genom Analyzer), a Szilárd platform (Applied Biosystems; Foster City, CA, USA), a Polonator (Dover/Harvard), valamint a HeliScope Egyetlen Molekula Sequencer technológia (Helicos; Cambridge, MA, USA)., A ciklikus-tömb szekvenálás fogalmát úgy lehet összefoglalni, mint a DNS-jellemzők sűrű tömbjének szekvenálását enzimatikus manipuláció iteratív ciklusaival és képalkotó alapú adatgyűjtéssel15 (Shendure és colleagues16). Két jelentés 2005-ben leírta a ciklikus tömbstratégiák első integrált megvalósítását, amelyek mind gyakorlati, mind költség-versenyképesek voltak a hagyományos szekvenálással (J. S. et al.13 és ref. 14), és más csoportok gyorsan követik17, 18.,
bár ezek a platformok meglehetősen változatosak a biokémia szekvenálásában, valamint a tömb generálásában, a munkafolyamatok fogalmilag hasonlóak (ábra. 1b). A könyvtári előkészítés a DNS véletlenszerű fragmentációjával történik, amelyet a közös adapterszekvenciák in vitro ligálása követ. Alternatív protokollok használhatók Mate-párosított címkék ugráskönyvtárainak generálására szabályozható távolságelosztásokkal13, 19., A szekvenálási funkcióként szolgáló klonálisan fürtözött amplikonok generálása számos megközelítéssel érhető el, beleértve a situ polonies15, emulzió PCR20 vagy híd PCR21,22 (ábra. 2). Ezeknek a módszereknek az a közös vonása, hogy az adott egyetlen könyvtármolekulából származó PCR-amplikonok térben csoportosulnak, akár egy sík szubsztrátumon (in situ polonies, bridge PCR), akár mikron méretű gyöngyök felületére, amelyek visszanyerhetők és tömbölhetők (emulziós PCR)., A szekvenálási folyamat magában foglalja az enzimvezérelt biokémia váltakozó ciklusait és a képalkotó alapú adatgyűjtést (1.ábra). 3). Az itt tárgyalt platformok mind a szintézis szekvenálására támaszkodnak, vagyis az alapozott sablonok soros kiterjesztésére,de a szintézist vezető enzim lehet polimeráz16,23 vagy ligáz13, 24. Az adatokat a teljes tömb képalkotásával szerezzük meg minden ciklusban (pl. fluoreszcens címkével ellátott nukleotidok polimeráz által beépítve).
(a) A 454, a Polonator és a SOLiD platform a pcr20 emulzióra támaszkodik a klonális szekvenálási funkciók erősítésére. Röviden, egy in vitro épített adapter-körötte puska könyvtár (látható, mint az arany, türkiz adapterek kísérő egyedi betétek) a PCR-erősített (a multi-sablon PCR, nem multiplex PCR, mivel csak egyetlen primer pár használt, amely az arany-türkiz adaptereket) összefüggésben a víz-olaj emulzió., Az egyik PCR-alapozó mikron méretű gyöngyök felületéhez van kötve (5 ‘ -csatolva), amelyek szintén szerepelnek a reakcióban. Az alacsony sablonkoncentráció a legtöbb gyöngytartalmú rekeszt eredményez, amelynek nulla vagy egy sablonmolekula van jelen. A produktív emulziós rekeszekben (ahol mind a gyöngy, mind a sablon molekula jelen van) a PCR ampliconokat a gyöngy felületére rögzítik. Az emulzió megtörése után az erősítő termékeket hordozó gyöngyök szelektíven dúsíthatók., Minden klonálisan felerősített gyöngy a felületén PCR termékeket visel, amelyek megfelelnek egy molekula felerősítésének a sablonkönyvtárból. (b) A Solexa technológia a bridge PCR21,22-re (más néven “cluster PCR”) támaszkodik a klonális szekvenálási funkciók erősítésére. Röviden, egy in vitro épített adapter–szegecses shotgun könyvtár PCR felerősített, de mindkét alapozó sűrűn bevonja a felület egy szilárd szubsztrát, csatolt saját 5 ” végei egy rugalmas linker., Ennek következtében a sablonkönyvtár bármely adott tagjából származó erősítő termékek helyben a származási hely közelében maradnak. A PCR megkötésekor minden klonális klaszter ∼1000 példányt tartalmaz a sablonkönyvtár egyetlen tagjáról. A sablonkönyvtár koncentrációjának pontos mérése kritikus fontosságú a klaszter sűrűségének maximalizálása érdekében, miközben egyidejűleg elkerüli a túlzsúfoltságot.
(a) A 454 platformmal klonálisan felerősített 28 µm-es gyöngyök, amelyeket emulzió PCR hoz létre, szekvenálási funkcióként szolgálnak, és véletlenszerűen egy picoliter méretű kutak mikrogömbjébe kerülnek. A pyrosequencing, minden ciklusban áll a bevezetés egyetlen nukleotid faj, amelyet ráadásul a szubsztrát (luciferin, adenozin-5′-phosphosulphate) vezetni fény termelés kutak, ahol polimeráz-vezérelt beépítése, hogy a nukleotid került sor., Ezt egy apiráz mosás követi, hogy eltávolítsa a nem bejegyzett nukleotidot. Kép Margulies et al. (2005)14. (b) A Solexa technológiával a clonally amplified sequencing funkciók sűrű tömbje közvetlenül a felületen keletkezik a bridge PCR (más néven cluster PCR) segítségével. Minden sorozatot ciklus tartalmazza az egyidejű hozzáadása keverék négy módosított deoxynucleotide faj, minden szem egy négy fluoreszkáló címkék, valamint egy reverzibilisen megszüntetéséről rész a 3′ hidroxil helyzetben. A módosított DNS-polimeráz az alapozott szekvenálási funkciók szinkron kiterjesztését hajtja végre., Ezt követi a képalkotás négy csatornában, majd mind a fluoreszkáló címkék, mind a lezáró rész hasítása. c) a szilárd és a Polonátor platformokkal klonálisan erősített 1 µm-es gyöngyöket használnak rendezetlen, sűrű szekvenálási jellemzők generálására13. A szekvenálást ligázzal végezzük,nem pedig polimerázsal13,24,26,27, 28. Szilárd állapotban minden szekvenálási ciklus fluoreszcens címkével ellátott oktamerek részlegesen degenerált populációját mutatja be., A populáció úgy van felépítve ,hogy a címke korrelál a központi 2 bp identitásával az oktamerben (a 2 bp-vel való korreláció, nem pedig 1 bp, a két bázis kódolás alapja)26. Miután lekötésével, valamint képalkotó négy csatornák, a jelölt része a octamer (a ‘zzz’) hasított keresztül módosított összekapcsolási helyszínek között, 5, 6, így egy ingyenes végén még egy ciklus lekötésével. Számos ilyen ciklus iteratív módon lekérdezi az egyenletesen elosztott, zavaró bázisokat., A rendszer akkor reset (a denaturáció a hosszabb alapozó), valamint a folyamat ismétlődik a különböző offset (pl. alapozó állítsa vissza az eredeti helyére, amelyet egy vagy több bázisok) olyan, hogy egy sor különböző discontiguous bázisok kihallgatnak a következő körben a soros ligations. d) A HeliScope platformmal az egyetlen nukleinsavmolekulákat közvetlenül szekvenálják, vagyis nincs szükség klonális amplifikációs lépésre., A poli-a-farkú sablonmolekulákat hibridizációval rögzítik a felszíni kötésű poli-t oligomerekhez, hogy rendezetlen tömböt hozzanak létre az alapozott egymolekula szekvenálási sablonokból. A sablonok Cy3 címkével vannak ellátva, így a képalkotás képes azonosítani a tömbkoordináták azon részhalmazát,ahol szekvenálás várható. Minden ciklus egy-egy fluoreszcens címkével ellátott nukleotidfaj polimeráz-alapú beépüléséből áll a sablonok egy részhalmazába, majd a címke teljes tömbjének fluoreszcens képalkotása és kémiai hasítása következik. Kép Braslavsky et al. (2003)30.,
a Globális előnye a második generációs vagy ciklikus-tömb stratégiák, relatív, hogy Sanger szekvenálás, a következők: (i) az in vitro építkezés egy sorozatot, könyvtár, majd in vitro klonális hangerősítő generálni szekvenálás funkciók, circumvents több szűk keresztmetszetek, hogy korlátozza a párhuzamosság a hagyományos szekvenálás (az átalakulás az E. coli, valamint kolónia szedés). (ii) a tömb alapú szekvenálás sokkal nagyobb mértékű párhuzamosságot tesz lehetővé, mint a hagyományos kapilláris alapú szekvenálás., Mivel a szekvenálási funkciók tényleges mérete 1 µm-es nagyságrendű lehet, több százmillió szekvenálási leolvasást lehet elérni párhuzamosan egy ésszerűen méretű felület raszteres képalkotásával. (iii) mivel a tömb jellemzői egy sík felületre immobilizálódnak, egyetlen reagens térfogatával enzimatikus módon manipulálhatók. Bár a gyakorlatban mikroliter-skála reagensmennyiségeket használnak, ezek lényegében amortizálódnak a tömb teljes szekvenálási funkcióján, a jellemző effektív reagensmennyiséget a pikoliterek vagy femtoliterek méretére csökkentve., Együttesen ezek a különbségek drámaian alacsonyabb költségeket jelentenek a DNS-szekvencia előállításához.
a második generációs DNS szekvenálás előnyeit jelenleg számos hátrány ellensúlyozza. Ezek közül a legjelentősebbek az olvasási hossz (az összes új platformon az olvasási hossz jelenleg sokkal rövidebb, mint a hagyományos szekvenálás) és a nyers pontosság (átlagosan az új platformok által generált alaphívások legalább tízszer kevésbé pontosak, mint a Sanger szekvenálás által generált alaphívások)., Bár ezek a korlátozások fontos algoritmikus kihívásokat jelentenek a közeljövőben, szem előtt kell tartanunk, hogy ezek a technológiák továbbra is javulni fognak e paraméterek tekintetében, ugyanúgy, mint a hagyományos szekvenálás fokozatosan fejlődött három évtized alatt, hogy elérje jelenlegi műszaki teljesítményét.
454 pyrosequencing. A 454 rendszer volt az első Következő generációs szekvenáló platform, amely kereskedelmi termékként volt elérhető14. Ebben a megközelítésben a könyvtárak bármilyen módszerrel felépíthetők, amely rövid, adaptív oldalú töredékek keverékét eredményezi., A klonális szekvenálási funkciókat a pcr20 emulzió generálja, az amplikonokat 28 µm-es gyöngyök felületére rögzítik (ábra. 2a). Szakítás után az emulzió, gyöngyök kezelt denaturálószer lehet eltávolítani a repülő szál, majd kitéve a hibridizáció-alapú gazdagodás a amplicon-csapágy gyöngyök (vagyis azok, amelyek jelen voltak, emulzió rekesz támogató produktív PCR-reakció). A szekvenáló primer hibridizálódik az univerzális adapterrel a megfelelő helyzetben és tájolásban, vagyis közvetlenül az ismeretlen szekvencia kezdete mellett.,
A szekvenálást a pyrosequencing method25 (ábra. 3a). Röviden, Az amplicont hordozó gyöngyöket bacillus stearothermophilus (Bst) polimerázzal és egyszálú kötő fehérjével előinkubáljuk, majd egy picoliter méretű kutakra (olyan méretekkel, hogy csak egy gyöngy illeszkedik egy kútba) helyezzük, hogy ez a biokémia kompatibilis legyen a tömb alapú szekvenálással. Kisebb gyöngyöket is adnak hozzá, amelyek immobilizált enzimeket tartalmaznak a piroszekvenáláshoz (ATP-szulfuriláz és luciferáz) is., A szekvenálás során a félig elrendezett tömb egyik oldala áramlási cellaként működik a szekvenáló reagensek bevezetésére és eltávolítására, míg a másik oldal egy száloptikai köteghez van kötve a CCD (töltés-kapcsolt eszköz) alapú jelérzékeléshez. A több száz ciklus mindegyikében egyetlen faj nélküli nukleotid kerül bevezetésre. Azon sablonokon, ahol ez beépülési eseményt eredményez, pirofoszfát szabadul fel., Az ATP-szulfuriláz és a luciferáz révén a beépülési események azonnal fényrobbanást generálnak, amelyet a CCD az egyes kutak tömbkoordinátáinak megfelelően érzékel. Más platformokkal ellentétben ezért a szintézis szerinti szekvenálást “élőben” kell ellenőrizni (vagyis a kamera nem mozog a tömbhöz képest). Több cikluson keresztül (pl. A-G-C-t-a-G-C-T…), a detektált beépülési események mintája feltárja az egyes gyöngyök által képviselt sablonok sorrendjét., Mint a HeliScope (az alábbiakban tárgyaljuk), a szekvenálás “aszinkron”, hogy egyes funkciók előre vagy mögött más funkciók sorrendjétől függően a bázis hozzáadása.
a 454-es technológia jelentős korlátozása homopolimerekre vonatkozik (azaz ugyanazon alap egymást követő példányaira, például az AAA vagy a GGG). Mivel egy adott ciklusban nincs több egymást követő beépítést megakadályozó megszakító rész, az összes homopolimer hosszát a jel intenzitásából kell következtetni., Ez hajlamos a nagyobb hibaarány, mint a diszkrimináció beépítése versus nonincorporation. Ennek következtében a 454 platform domináns hibatípusa a behelyezés-törlés, nem pedig a helyettesítés. Más következő generációs platformokhoz képest a 454 platform legfontosabb előnye az olvasási hossz. Például, a 454 FLX eszköz generál ∼400.000 olvasás per műszer-futás hosszában 200 hogy 300 bp. Jelenleg a 454 platformmal történő szekvenálás bázisonkénti költsége sokkal nagyobb, mint más platformoké (pl.,, Szilárd és Solexa), de ez lehet a választott módszer bizonyos alkalmazásokhoz, ahol a hosszú olvasási hossz kritikus (pl. de novo assembly és metagenomics).
Illumina Genom Analyzer. Ez a platform a Turcatti és a colleages22, 23 és négy vállalat—a Solexa (Essex,UK), A Lynx Therapeutics (Hayward, CA, USA), A Manteia prediktív Medicine (Coinsins, Svájc) és az Illumina-egyesüléséből származik., A könyvtárak bármilyen módszerrel elkészíthetők, amely akár több száz bázispár (bp) hosszúságú adaptertekercses töredékek keverékét eredményezi. Az erősített szekvenálási funkciókat a bridge PCR21, 22 generálja (ábra. 2b). Ebben a megközelítésben, mind előre, hátra PCR primerek vannak kikötve, hogy a szilárd hordozó rugalmas linker, oly módon, hogy minden amplicons eredő egységes sablon molekula során a hangerősítő továbbra is rögzített, valamint fürtözött, hogy egyetlen fizikai helyét egy tömb., Az Illumina platformon a PCR híd kissé szokatlan abban, hogy a BST polimerázzal történő kiterjesztés váltakozó ciklusaira támaszkodik, a formamiddal denaturálva. A kapott “klaszterek” mindegyike ∼1000 klonális amplikonból áll. Több millió klaszterek lehet egészíteni, hogy megkülönböztethető helyen belül az egyes nyolc független ‘sáv’, hogy egyetlen flow-sejt (például, hogy a nyolc független könyvtárak lehet szekvenált párhuzamosan ugyanebben az eszköz futtatása)., Miután klaszter generáció, a amplicons egyedülálló átállási (linearizálással), valamint egy szekvenáló primer keresztez, hogy egy egyetemes sorrend kísérő a régió érdekeit. A szekvencia-lekérdezés minden ciklusa egybázisú kiterjesztésből áll, módosított DNS-polimerázzal és négy nukleotid keverékével (2.ábra). 3b). Ezek a nukleotidok kétféleképpen módosulnak., Ezek “reverzibilis terminátorok”, mivel a 3′ hidroxilpozícióban lévő kémiailag hasítható rész csak egy bázisú beépülést tesz lehetővé minden ciklusban; és a négy fluoreszkáló címke egyike, amely kémiailag is hasítható, megfelel az egyes nukleotidok azonosságának23. A négycsatornás képek egy-bázisos kiterjesztése és megszerzése után a következő ciklusra mindkét csoport kémiai hasítása megkezdődik. Olvasási hossz akár 36 bp jelenleg rutin; hosszabb olvasás lehetséges, de előfordulhat, hogy magasabb hibaarány.,
Az Olvasási hosszt több tényező korlátozza, amelyek jelromlást és defázist okoznak, mint például a fluoreszcens címkék hiányos hasítása vagy a végtelenített motívumok. A domináns hibatípus a helyettesítés, nem pedig a betoldások vagy törlések (és a homopolimerek minden bizonnyal kevésbé fontosak, mint más platformok, például a 454). Az átlagos nyers hibaarányok 1-1, 5%-os sorrendben vannak, de a 0,1% – os vagy annál kisebb hibaaránnyal rendelkező nagyobb pontossági bázisok az egyes alaphívásokhoz kapcsolódó minőségi mutatókkal azonosíthatók., Mint más rendszerek, módosítások nemrégiben engedélyezve van, haver-párosított olvas; például minden szekvenálás funkció hozamú 2 × 36 bp független olvassa származik, mindegyik végén egy adott könyvtár molekula több száz bázis hosszúságú.
AB SOLiD. Ez a platform a J. S. és a colleagues13 által 2005-ben leírt rendszerben, valamint az Agencourt Personal Genomics (Beverly, MA, USA) (az Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) által 2006-ban megszerzett alkalmazott Biosystems (Foster City, CA, USA) által végzett munkában gyökerezik., Könyvtárak lehet építeni bármilyen módszerrel, hogy ad okot, hogy a keverék a rövid, adapter-szegélyű töredékek, bár sok erőfeszítést ezzel a rendszerrel került protokollok mate-párosított tag könyvtárak szabályozható és rendkívül rugalmas távolság eloszlások13, 19. A klonális szekvenálási funkciókat PCR emulzió generálja, az 1 µM-es paramágneses gyöngyök felületére rögzített amplikonokkal (20.ábra). 2a). Az emulzió megtörése után az erősítő termékeket hordozó gyöngyöket szelektíven visszanyerik, majd egy szilárd sík szubsztrátumra immobilizálják, hogy sűrű, rendezetlen tömböt hozzanak létre., A szintézissel történő szekvenálást DNS-ligáz hajtja13,24,26,27,28, nem pedig polimeráz. Az adapterszekvenciát kiegészítő univerzális alapozó hibridizálódik az amplicont hordozó gyöngyök tömbjéhez. A szekvenálás minden ciklusa magában foglalja a fluoreszcens címkével ellátott oktamerek degenerált populációjának ligálását (ábra. 3c). Az oktamer keverék strukturált, abban az értelemben, hogy az oktamer(pl. 5.bázis) specifikus pozíciójának (pozícióinak) azonossága korrelál a fluoreszcens címke azonosságával., A ligálás után a képeket négy csatornában szerezzük be, hatékonyan gyűjtve az azonos alaphelyzetekre vonatkozó adatokat az összes sablon-hordozó gyöngyön. Ezután az oktamer kémiailag hasad az 5. és 6. pozíció között, eltávolítva a fluoreszkáló címkét. Az oktamer ligálás progresszív fordulói lehetővé teszik minden 5. bázis szekvenálását (például 5, 10, 15, 20 bázisok). Több ilyen ciklus befejezése után a kiterjesztett alapozót denaturálják a rendszer visszaállításához. A folyamat későbbi iterációi különböző pozíciókra irányíthatók (pl.,, bázisok 4, 9, 14, 19) vagy olyan alapozóval, amely egy vagy több bázist állít vissza az Adapter-betét csomópontból, vagy oktamerek különböző keverékeinek felhasználásával, ahol egy másik helyzet (például 2.bázis) korrelál a címkével. Ennek a platformnak egy további jellemzője a két bázisú kódolás használata, amely egy hibajavító séma, amelyben két szomszédos bázis, nem pedig egyetlen bázis, korrelál a label26-tal., Minden bázispozíciót ezután kétszer (egyszer az első bázisként, egyszer pedig a második bázisként, egy adott cikluson lekérdezett 2 bp-es készletben) lekérdeznek, hogy a miscalls könnyebben azonosítható legyen.
a szilárd anyaghoz kapcsolódó rendszer a Polonátor, amely részben a J. S. által kifejlesztett rendszeren és a Harvardon működő Church group13-on alapul. Ez a platform is használ szekvenálás által generált emulzió PCR szekvenálás ligálás. Az eszköz költsége azonban lényegesen alacsonyabb, mint a többi második generációs szekvenáló eszközé., Ezenkívül az eszköz nyílt forráskódú és programozható, potenciálisan lehetővé téve a felhasználói innovációt (pl. alternatív biokémiák használata). A jelenlegi olvasási hossz azonban jelentősen korlátozhatja.
további hátrány, hogy a 454-es, a SOLiD és a Polonator-ra jellemző, hogy az emulziós PCR nehézkes és technikailag nehézkes lehet., Másrészt lehetséges, hogy a sorozatot, hogy a high-density array nagyon kicsi (1 µm), gyöngyök (a szekvencia által lekötésével, polimeráz kiterjesztését, vagy egy másik biokémia) is képviselhet, ha a legegyszerűbb lehetőség, hogy elérjék rendkívül magas adatok sűrűség, egyszerűen azért, mert 1-µm gyöngyök fizikailag zárja ki a másikat, a térköz, hogy a sorrendben az optikai határ. Ezenkívül az 1 µm-es gyöngysorok nagyfelbontású rendezése, amint azt a közelmúltban leírták29, lehetővé teheti, hogy a szekvenálásonként egy pixel határérték szorosan megközelítse.
HeliScope., A Helicos sequencer18, amely a Quake ‘ s group30 munkáján alapul, szintén a szekvenálási funkciók sűrű sorozatának ciklikus kihallgatására támaszkodik. Ennek a platformnak azonban egyedülálló aspektusa az, hogy nincs szükség klonális erősítésre. Ehelyett egy nagyon érzékeny fluoreszcencia-érzékelő rendszert használnak az egyes DNS-molekulák közvetlen lekérdezésére szintézissel történő szekvenálással., Sablon könyvtárak, készítette random töredezettség, valamint poli-Egy követ (ez nem PCR amplifikáció), ragadja meg a hibridizáció felület-sisakok poli-T oligomers, hogy a hozam egy rendezetlen tömb alapozott egységes-molekula sorozatot, sablonok. Minden ciklusban DNS-polimerázt és egyetlen fluoreszcens címkével ellátott nukleotidot adunk hozzá, ami a felület-immobilizált primer-sablon duplexek sablonfüggő kiterjesztését eredményezi (2.ábra). 3d)., A teljes tömböt burkoló képek megszerzése után a fluoreszkáló címke kémiai hasítása és felszabadítása lehetővé teszi a későbbi kiterjesztési és képalkotási ciklust. Amint azt egy nemrégiben készült jelentésben18, több száz ciklus egybázisú kiterjesztés (azaz A, G, C, t, A, G, C, T…) átlagos olvasási hossza 25 bp vagy annál nagyobb. A rendszer figyelemre méltó szempontjai a következők. Először is, mint a 454 platform, a szekvenálás aszinkron, mivel egyes szálak sorrendben előre vagy mások mögött esnek., A véletlen is szerepet játszik, mivel egyes sablonok egyszerűen nem tudnak beépülni egy adott ciklusba annak ellenére, hogy a megfelelő bázis a következő helyzetben van. Mivel azonban ezek egymolekulák, a dephasing nem jelent problémát, és az ilyen események önmagukban nem vezetnek hibákhoz.
második, a jelzett nukleotidokon nincs záró rész. A 454-es rendszerhez hasonlóan ezért a homopolimer futása is fontos kérdés. Mivel azonban egyetlen molekulát szekvenálnak, a problémát a beépülési események sebességének korlátozásával lehet enyhíteni. Továbbá, Harris et al.,18 megjegyezte, hogy a jelzett nukleotid egymást követő beépítése a homopolimerekben olyan kioltó kölcsönhatást eredményezett, amely lehetővé tette a szerzők számára, hogy az alapító dokumentumok diszkrét számát (például a versus AA versus AAA) következtethessék.
harmadszor, a nyers szekvenálási pontosság jelentősen javítható egy kétlépcsős stratégiával, amelyben az egymolekula sablonok tömbjét (itt mindkét végén adapterekkel) a fent leírtak szerint szekvenálják, majd teljesen lemásolják. Mivel az újonnan szintetizált szál felszíni kötésű, az eredeti sablon denaturálással eltávolítható., A disztális adapterből alapozott szekvenálás ezután egy második szekvenciát eredményez ugyanahhoz a sablonhoz, amelyet az ellenkező tájolásban kapunk. Pozíciók, amelyek összhangban vannak a két olvasás van phred-szerű minőségi pontszámok közeledik 30 (refs. 8,18).
és végül, nagyrészt másodlagos beépítése szennyező, jelöletlen vagy nem illeszkedő bázisok, a domináns hiba típus törlés (2-7% hibaarány egy menetben; 0,2–1% két menetben). A helyettesítési hibaarányok azonban lényegesen alacsonyabbak (0,01-1% egy menetben)., Két lépésben a bázisonkénti nyers helyettesítési hibaarány (megközelíti a 0.001%-ot) jelenleg a legalacsonyabb lehet a második generációs platformok közül.