az eubaktériumokban négy intracelluláris proteolitikus komplex család létezik: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP és FtsH. Ezen öt mellett a Htra (DegP) egy periplasmikus/szekretált proteolitikus komplex, míg a prokarióta proteaszóma csak aktinomycetesben található. Az egyes proteázok patogenezisében betöltött szerkezetét, funkcióját és szerepét korábban felülvizsgálták.,13, 17 számos ilyen komplexet vizsgáltak potenciális antibakteriális célpontként, köztük a Lon-t,a 18 ClpXP-t, a 19 HtrA20-at és a proteaszómát.Ezek közül 21, a ClpXP-t a legszélesebb körben vizsgálták, és ez az egyetlen olyan komplex, amelyre eddig természetes termékgátlókat találtak.
a clp proteolitikus komplex
a Clpp-k a legtöbb baktériumfajban jól konzerváltak, és fontos szerepet játszanak a fehérje forgalmában., A protein homeosztázis és a rosszul bekötött fehérjék lebomlása mellett a ClpP számos szabályozási folyamatban is részt vesz a transzkripciós szabályozók célzásával és a proteóma átalakításával.22, 23, 24, 25 valójában a ClpP kulcsszerepet játszott olyan folyamatok szabályozásában, mint a sejtosztódás, a stressztűrés, a virulencia, a morfológiai differenciálódás és az antibiotikum-rezisztencia.22, 23, 24 A ClpP szerepe ezekben a folyamatokban a fehérje szubsztrátok szigorú kiválasztásán alapul, amelyet a katalitikus helyekhez való hozzáférés korlátozásával ér el., Minden ClpP komplexet két heptamerikus gyűrű egymásra rakásával alakítanak ki tetradekamer létrehozásához (2.ábra).26 A kialakított csatorna 14 szerin proteáz katalitikus helyet foglal el, amelyek nem érhetők el az axiális nyílásokon való áthaladás nélkül. Ezenkívül az apo-ClpP inaktív, tömörített konformációt alkalmaz, amelyben katalitikus triádja rosszul van beállítva.27 a konformációs aktiválás ellenőrzése és az axiális nyílásokhoz való hozzáférés az Atpázok AAA + szupercsaládjának hsp100 fehérjéi: ClpA vagy ClpX Gram-negatív baktériumokban, ClpC vagy ClpX Gram pozitívokban., Ezek a kiegészítő Atpázok hexamerikus gyűrűket alkotnak, amelyek a tetradekamer axiális felületeit tripeptid (L/I)GF motívumokkal kötik össze, amelyek hidrofób zsebekbe illeszkednek.28 a kötés ebben a hidrofób zsebben kétféle módon szabályozza a ClpP aktivitását: először a komplex stabilizálásával egy aktív, kiterjesztett konformációban, a katalitikus triádhoz igazítva, másodszor pedig a fehérje szubsztrát kibontakozásával., AAA+ ATPases kölcsönhatásba fehérje célokat, vagy közvetlenül, vagy egy együttműködő adapter fehérje, valamint a által biztosított energia ATP bontakozik ki a szubsztrát etetni a központi pórusok, ahol hidrolizált egy energia-független módon. Mivel a hajtogatott fehérjék egyébként túl nagyok ahhoz, hogy belépjenek a csatornába, ezek az AAA+ partnerek szorosan szabályozzák, hogy mely fehérje szubsztrátokat célozzák meg a zsírtalanításhoz.28
a ClpP proteolitikus rendszer megzavarásának mechanizmusai., a) A ClpP-tetradekamerek (piros színnel jelölve) a szerin-proteolitikus helyeket (zöld színnel jelölve) a hsp100 ATPáz-hexamerek szorosan szabályozzák (kék színnel jelölve). (B-d) A (sárga színben látható) gyógyszerek háromféle módon okozhatnak perturbációt, ami sejthalálhoz vagy csökkent virulenciához vezethet. A ClpC1 ATPáz aktivitását aktiváló gyógyszerek az M. tuberculosisban (D) Úgy gondolják, hogy vagy leválasztják a ClpP-ből, gátolják a proteolízist, vagy növelik a fehérje lebomlását. A teljes színes változata ez a szám elérhető a Journal of antibiotikumok journal online.,
a legtöbb baktériumfaj, köztük az E. coli, a Bacillus subtilis és a Staphylococcus aureus, rendelkezik egy clpP génnel, amely a kapcsolódó AAA+ Atpázokkal együtt nem nélkülözhetetlenek a sejtek életképességéhez.25, 29, 30, 31, 32 Mindazonáltal azt is megfigyelték, hogy clpP törlését ezek a fajok növeli az érzékenységet, hogy antibiotikumok, mint például a linezolid, valamint rifampicin, illetve csökken, virulencia, a kórokozók, például a Listeria monocytogenes, a S. aureus.,23, 33 a virulencia elvesztése a ClpXP-hiányos törzsekben a virulencia transzkripciós faktorok globális szintjeinek, például az sar/agr szabályozási hálózatának jelentős perturbációihoz kapcsolódott S. aureus.23 érdekes módon a ClpP inaktiválásának hatása ezen virulencia-szabályozók közül többre törésfüggőnek tűnik, ráadásul egyes ClpXP-funkcióban hiányos S. aureus törzsek csökkent érzékenységet mutatnak a vankomicinre, a daptomicinre és a β-laktám antibiotikumokra.,34, 35, 36
a legtöbb baktériummal ellentétben a clpP két vagy több példánya megtalálható az aktinobaktériumokban és a cianobaktériumokban, és legalább egy funkcionális példány elengedhetetlen az életképességhez.37, 38 a Mycobacterium tuberculosisban a clpP1 és a clpP2 egy operont alkot, és mindkét gén elengedhetetlen. Ezek az izoformák együtt működnek egy funkcionális proteáz létrehozásában, a ClpP1 és Clp2 homoheptamerek heterotetradekamerré rakásával.Az M. tuberculosisban, a ClpX-ben és a ClpC1-ben található négy AAA+ ATPáz közül 37, 39 létfontosságú az életképesség szempontjából.,40, 41
mivel szerepe van a sejtek életképességében és virulenciájában, a ClpP rendszer ígéretes célpont az új antibakteriális szerek számára, három lehetséges deregulációs mechanizmussal (2.ábra): a ClpP proteolízis gátlása, ClpP proteolízis aktiválása vagy a partner AAA+ Atpázok perturbációja.
clpp inhibitorok
talán a ClpP rendszer célzásának legnyilvánvalóbb megközelítése a ClpP aktív hely inhibitorának kifejlesztése. Ennek a hatásmechanizmusnak az elvét igazolták S. aureus, Streptococcus pneumoniae és L., monocytogenes, ahol clpP kiütések nem okozhatnak bőrfertőzés tályogok, tüdőfertőzések vagy in vivo makrofág parazitizmus, illetőleg.22, 42, 43 a virulencia csökkenése az extracelluláris proteázok, lipázok, Dnázok és α-hemolizin csökkent aktivitásával járt S. aureusban, valamint α-listerolizin és lizeriális foszfolipáz L. monocytogenesben.
Böttcher és Sieber44 úttörő erőfeszítései a ClpP-k célba juttatására egy sor β-lakton inhibitor kifejlesztéséhez vezettek., A természetben található β-laktonok reaktivitása ihlette, alkin-címkézett származékok könyvtárát szintetizálták (például D3 lakton; 3a ábra), amelyeket több bakteriális proteóma ellen szűrtek. Click chemistry on the alkyne tag was used to attach a fluorophore and allow for the identification of reaktív enzimek. Ily módon a ClpP-t nagyon specifikus célpontként azonosították, amely kovalens mellékterméket képez az aktív szer98 és a β-lakton között, ezáltal visszafordíthatatlanul gátolja a proteolitikus aktivitást (3b ábra).,44 a későbbi jellemzések azt mutatták, hogy a β-laktonok képesek csökkenteni a virulencia faktor aktivitását, beleértve az α-hemolizint és a listerolizint az S. aureus-ban, illetve az L. Monocytogenes-ben.45, 46 a virulencia faktorok csökkenése Korrelált azzal a képességgel, hogy az optimalizált β-lakton állványok (U1; 3a.ábra) jelentősen csökkentik az S. aureus fertőzést szubkután alkalmazás után bőrtályog modellben és L. monocytogenes növekedés makrofágokban.46, 47 továbbá, β-lakton-származékok (7. vegyület; 3a. ábra) az M-be bejutó vegyületek kiváltságos csoportjába tartoztak., a tuberkulózis annak érdekében, hogy hatékonyan gátolja a növekedést egy MIKROFON 28 µg ml−1.48 végső Soron azonban alacsony plazma stabilitás miatt gyors hidrolízis a ciklikus észter kizárná további klinikai fejlesztés.
ClpP. a) nagyon aktív β-laktonok és fenil-észterek kémiai szerkezete. a β-Lakton D3 eredetileg használni, mint egy szonda ClpP gátlása által kattintson a kémia, majd a későbbi optimalizálás hozott β-lakton U1. a β-lakton 7-et m-re optimalizálták., a tuberkulózis növekedésének gátlása. b) A β-laktonok proteolitikus aktív hely gátlásának mechanizmusa a szer98 kovalens módosításával. Az acil-enzim komplex hidrolízisét felezési ideje írja le. C) A β-lakton és a fenilészter stabilitásának, hatékonyságának és aktivitásának összehasonlítása. A hemolízis csökkentése arra utal, hogy az S. aureus kultúrák által okozott vér agar lemezeken történő tisztítással számszerűsíthető. (ND, nincs meghatározva). A teljes színes változata ez a szám elérhető a Journal of antibiotikumok journal online.,
újabban a Sieber és a collees49 felfedezte a hatékony ClpP inhibitorok új osztályát, a fenilésztereket (AV170; 3a ábra). A 137 000 szintetikus vegyületből álló elfogulatlan képernyő segítségével fedezték fel egy Fluorogén vizsgálatban a clpp aktivitásához, a fenil-észterek a szer98 azonos kovalens módosításával járnak el, mint a β-laktonok., Érdekes, hogy egyes enantiomerek képesek a ClpP tetradekamer deoligomerizációját heptamerekké is kiváltani, kedvező hatásmechanizmus, mivel a szerin katalitikus triád konformációs ellenőrzése inaktívvá teszi ClpP heptamerikus formájában. Annak ellenére, hogy a fenil-észterek jobb potencia proteáz gátló át β-laktonok, az anti-virulencia aktivitás csökken, ahogy csak képes csökkenteni, nem pedig eltörli α-hemolysin termelés (3c Ábra). A hatékonyság növelésére tett erőfeszítések a stabilitás és a reaktivitás közötti kompromisszumot tártak fel.,49
bár a ClpP gátlása ígéretesnek bizonyul, mint hatásmechanizmus, az új állványok továbbfejlesztése és felfedezése egyértelműen szükséges. Továbbá, tekintettel a gyógyszerrezisztencia legújabb bizonyítékaira bizonyos clpP knockout törzsekben, 34, 36 bizonyos óvatosság indokolt lehet ezen az úton.
ClpP aktivátorok
a ClpP proteáz rendszer aktiválása különösen érdekes terápiás lehetőség. Az intracelluláris proteázok jellemzője az aktivitás szigorú szabályozása a célfehérje lebomlásának elkerülése érdekében. Az eukariótákban ezt gyakran az organellák felosztásával érik el., Ezzel szemben a baktériumok szűk szabályozó fehérjekomplexeket fejlesztettek ki a proteázaktivitás szabályozására. Azáltal, hogy a proteolitikus aktivitást válogatás nélkül lebontja a fehérjéket, a gyógyszer nemcsak azokban a fajokban képes sejthalált okozni, ahol a ClpP elengedhetetlen, hanem azokban is, ahol a ClpP elengedhetetlen. A ClpP aktivitását megszüntető mutációk, miközben elméletileg rezisztenciát biztosítanak, végzetesek lennének azokban a sejtekben, ahol a ClpP elengedhetetlen, és rontják a virulenciát azokban a sejtekben, ahol a ClpP nélkülözhető., Végül, a soha nem látott hatásmód aktiválással, nem pedig a cél gátlásával lehetővé teheti egy ilyen gyógyszer hatékonyságát a nyugvó persister sejtek ellen.
ennek az egyedülálló hatásmechanizmusnak az elvi bizonyítékát jelentették az acyldepszipeptidek felfedezésével (ADEPs; 4a ábra). Az adep-eket először 1985-ben írták le egy szabadalomban, mint az “A54556 komplexet”, amely a Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP által termelt nyolc szorosan kapcsolódó vegyület csoportját azonosította az ADEP molekuláris céljaként 2005-ben, amikor Brötz-Oesterhelt et al.,51 fordított genomikát alkalmazott egy ADEP-rezisztens E. coli törzsre, hogy azonosítsa a rezisztencia determinánst a ClpP mutációjaként, amely inaktívvá teszi. Ez a megállapítás azt sugallta, hogy az ADEPs aktiválja a ClpP-t, ami nem megfelelő fehérje lebomlást okoz. Valójában a fluorogén peptidek hasadását mérő in vitro vizsgálatok és az in vivo proteomikus analízis megerősítette, hogy az ADEP-aktivált B. subtilis ClpP képes volt a fehérjéket az AAA+ szabályozástól vagy ATP hidrolízistől függetlenül lebontani.,51
ClpP aktivátorok. a) A természetes termék ClpP aktivátorainak ADEP1 és szklerotiamid kémiai szerkezete, valamint az optimalizált szintetikus ClpP aktivátor ACP1b. b) az E. coli ClpP tetradekamer kristályszerkezete ADEP komplexben (PDB 3MT6) 55 az Egymásra rakható heptamerek világos/sötét színekben, a ClpP monomerek váltakozó vörös és kék színben, az ADEP molekulák pedig zöld színben jelennek meg., c) az ADEP SAR reprezentatív struktúrái, amelyek számos Gyógyszerkémiai erőfeszítésből származnak. Az S. aureus elleni mikrofonok felsorolásra kerülnek.54 (d) ADEP dokkoló hely két ClpP monomer interfészén, világos rózsaszín / kék színben. A nitrogéneket sötétkék színnel jelölik, míg az oxigéneket piros színnel jelölik. Két jelentett transzannuláris h kötést sárga szaggatott vonalak mutatnak. A teljes színes változata ez a szám elérhető a Journal of antibiotikumok journal online.,
a Szabályozás elvesztését az E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis és Neisseria meningitidis által aktivált Adep kristályszerkezetei biztosították (4b.ábra).52, 53, 54, 55 egy ADEP molekula kötődik a ClpP tetradekamer minden egyes monomerjéhez ugyanabban a hidrofób zsebben, amelyet az AAA+ Atpázok használnak, ezáltal gátolva kölcsönhatásukat (4D ábra).,52, 55, 56 Kötelező utánozza az Atpáz van conformational ellenőrzése ClpP, indukáló összehangolása a szerin katalitikus triád egy merev test forgása a ClpP monomerek, térhatás az axiális pórusok 10-12 Å 20 Å E. coli-ban.27, 52, 55 a gating mechanizmust az N-terminális domének is biztosítják, amelyek lefelé mozognak, vagy zárt konformáció felfelé, vagy nyitott konformáció az ADEP kötésen.,Az 52, 55 ADEP aktiválás nem teszi lehetővé a stabilan hajtogatott fehérjék lebomlását, mivel még mindig túl nagyok ahhoz, hogy belépjenek a ClpP axiális lumenébe, de lehetővé teszi a riboszómából kialakuló instabil fehérjék és születő láncok lebontását, különösen, ha lassan hajtódnak.Úgy gondolják, hogy az 57 sejthalál ennek a válogatás nélküli lebomlásnak, valamint a normál ClpP funkció gátlásának eredménye.
az ADEPs számos Gram-pozitív baktérium ellen aktív, beleértve a klinikailag releváns meticillin-rezisztens S. aureust (MRSA), a vankomicin-rezisztens enterococcusokat és a penicillin-rezisztens S.-T., pneumoniae, valamint a Gram-negatív kórokozók N. meningitidis és Neisseria gonorrhoeae.51, 54 a félszintetikus ADEP-származékok hatásosak az Enterococcus faecalis, S. aureus és S. pneumoniae ellen egér – és patkánymodellekben, amelyek aktivitása meghaladja a linezolidot, 51, az MRSA elleni aktivitás pedig egy Murin periotinitis modellben jobb, mint a vankomicin.58 nevezetesen, az ADEPs-szel szembeni rezisztencia 10-6-os gyakorisággal alakul ki ezekben a baktériumfajokban a ClpP funkcióját csökkentő mutációk révén, amelyek nem nélkülözhetetlenek., Mindazonáltal segítségével clpP mutáns csökkent, fitness, mint előnyt, kombinációs terápiák ADEP, valamint rifampicin kimutatták, hogy teljesen felszámolják a vankomicin rezisztens MRSA lakosság in vitro.59
még ígéretesebb az ADEPs azon képessége, hogy megszüntesse a persister sejteket.59 Conlon et al.59 először ezt a tulajdonságot írta le, amikor egy ADEP hatékonyan megölte mind az álló fázisú S. aureus-t, mind a ciprofloxacin-kezelés után maradt persister S. aureus-t. Ez a megállapítás hatással van az ADEPs alkalmazására a kábítószer-toleráns M. tuberculosis persisters által okozott látens tuberkulózis fertőzések ellen., A mai napig nem írták le az M. tuberculosis persisters elleni aktivitást, de kimutatták, hogy az ADEPs lassítja az M. tuberculosis növekedését, ha két efflux pumpa inhibitorral, reserpinnel és verapamillal kombinálják.39
Bár ADEPs ígéretes vezet a kábítószer-jelöltek vannak kedvezőtlen farmakológiai tulajdonságok, beleértve a szegény víz oldhatóság, gyors szisztémás clearance kémiai instabilitás.51, 60 miután felfedezték az ADEPs hatásmechanizmusát, a Bayer AG elindította a medicinal chemistry SAR programot, hogy az ADEP stabilabb és hatásosabb származékát fejlessze ki., Ez a törekvés eredményezte a fejlesztés ADEP4, egy nagyon erős ADEP1 származtatott, három fontos módosítás: Phe helyébe 3,5-difluorophenylalanine, amely azt hittem, hogy formában H kötvények ClpP, az acyl polyene helyébe egy α,β-telítetlen hexenoyl farkát, hogy javítja a stabilitást, illetve N-MeAla helyébe pipecolate, ami növeli ADEP merevsége.Az ADEP4 60 aktivitását tovább javította Carney et al.61 úgy, hogy a Ser-t Allo-Thr-re, a Pip-t pedig 4-MePip-re cseréljük az ADEP további szigorítása érdekében., A hidrogén-deutérium árfolyamok 1H NMR alkalmazásával történő számszerűsítésével kimutatták, hogy az ADEP molekula merevítése erősíti a transzannuláris H kötéseket, ezáltal csökkentve a ClpP-hez való kötődés entróp költségeit. A Carney ADEP-származéka 600-1200-szor nagyobb hatékonysággal rendelkezik, mint az ADEP1 Gram-pozitív kórokozókkal szemben.61
Ezen ADEP-származékok fokozott hatékonysága ellenére még mindig csak korlátozott aktivitással rendelkeznek a Gram-negatív baktériumok ellen, és aktív efflux-szal hatékonyan távolítják el őket a sejtből, különösen az M. tuberkulózisban.,39, 62 számos más szintetikus kémiai erőfeszítések feltárt motívumok leküzdeni ezeket a korlátozásokat, de a legtöbb eredményezett csökkent aktivitás (ábra 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 tekintettel az ADEP hidrofób zsebében való intim kötődésére, ez az eredmény talán kiszámítható, és azt sugallja, hogy az ADEP állványon történő módosítás zsákutcába juthatott.
két nagy áteresztőképességű képernyőt szereltek fel az új ClpP aktivátorok azonosítására.65, 68 mindkét azonosított kis molekulájú aktivátorok E., coli ClpP in vitro vizsgálati módszerrel mérve a fluoreszcencia növekedését, amelyet a fluoreszcein izotiocianát–kazein hasítása okoz, amely a ClpP modell szubsztrátja. Az első, Leung et al.65 szűrt 60 000 kábítószer-szerű szintetikus vegyi anyagok, azonosítására öt vegyületek nevezett ACP1–5 (ábra 4A). Ezen vegyületek közül a legaktívabb a ClpP aktiválásakor 10-20-szor kevésbé volt hatásos, mint az ADEP1, és csak szerény antibakteriális aktivitást mutatott még permeabilizáló szerek jelenlétében is. Lavey et al.,68 ehelyett >20 450 gombás és bakteriális kivonatot vagy metabolitot vizsgáltak, és egyetlen ClpP aktivátort, szklerotiamidot azonosítottak (4a.ábra). Ez a paraherquamiddal összefüggő indolinon az EcClpP aktiválásakor 73-szor volt kevésbé hatásos, mint az ADEP1, és nem gátolta az efflux-hiányos E. coli vagy Pseudomonas aeruginosa növekedését.
az ACP-k és a szklerotiamid korlátozott hatásossága ellenére ezek a vizsgálatok újszerű állványzatokat biztosítanak a származtatáshoz, és megnyitják az ajtót a jövőbeli tanulmányok előtt a ClpP aktivátorok azonosítása érdekében., El lehet képzelni például az alternatív aktiválási kötőhelyek azonosítását a ClpP-n. A ClpP szabályozása nemcsak az AAA+ ATPáz asszociáció során a pórusok kiszélesedésével szabályozza a szubsztrát bejutását, hanem a szerin katalitikus hely kialakulását is oligomerizációval tetradekamerekbe.69 talán egy kis molekula, amely aktív helyképződést váltott ki, miközben a ClpP-t heptamerként tartotta fenn, lehetővé teheti az aktív hely könnyű hozzáférését válogatás nélküli szubsztrátumokkal.,
AAA+ ATPase uncouplers as therapeutics
mivel a ClpP AAA+ ATPases-ra támaszkodik a fehérje szubsztrátok kiválasztásához és kibontásához, ezen partnerek perturbációja szintén deregulálhatja a ClpP proteolitikus rendszert. Ez különösen igaz az M. tuberkulózisra, ahol a ClpC1 és ClpX Atpázok elengedhetetlenek a sejtek életképességéhez.40, 41 valójában a ClpC1-et célzó három vegyület mindegyikét, amelyet eddig jellemeztek, felfedezték a természetes termékkivonatok szűrésével az anti-M. tuberkulózis aktivitására., Ezek közül az első a cyclomarin a (cymA), a Streptomyces sp tengeri baktérium által termelt ciklikus heptapeptid. CNB-982 (5a. ábra).70 bár 1999-ben írták le, mint egy erős gyulladáscsökkentő szer citotoxicitással a rákos sejtek ellen, csak 2011-ben fedezték fel az M. tuberculosis elleni aktivitást egy természetes termék teljes sejtes képernyőjén.71 a cymA molekuláris célpontjának azonosítására irányuló első kísérlet során fordított genomikai megközelítést alkalmaztak. Azonban, miután nem spontán rezisztens M., a tuberkulózis mutánsok visszanyerhetők, az affinitási kromatográfiát ehelyett arra használták, hogy megmutassák, hogy a cymA nagy specificitással célozza meg a ClpC1-et. Későbbi co-crystalization a cymA a ClpC1 N-terminális domén feltárt maradványok legfontosabb kötelező, illetve, annak ellenére, hogy az képtelenség, hogy létre spontán rezisztens mutánsok, lehetővé tette, hogy a teremtés ClpC1 mutánsok biztosító ellenállás cymA.72
ClpC1 aktivátorok. a) a cymA, ecumicin és lassomicin kémiai szerkezete., A bázikus aminosavak pirosak, az alifás/aromás kék színűek. b) a clpc1 M. tuberculosis N-terminális tartományának kristályszerkezete (PDB 3WDC). Az egyes aktivátorok különálló kötőhelyeit az aktivátorkötésben részt vevő helymaradványok mutatják, sárga (lassomicin), kék (ciklomarin) és piros (ecumicin) színnel. A teljes színes változata ez a szám elérhető a Journal of antibiotikumok journal online.
2014-ben ecumicin, a nonomuraea sp makrociklikus tridekapeptidje., MJM5123, 73 és lassomycin, a Lentzea kentuckyensis sp 16 tagú lasszópeptidje., 74 izoláltuk mindkét szűrésével nyers actinomycete kivonatok (ábra 5a). A ClpC1 N-terminális doménjét ezeknek a vegyületeknek a molekuláris céljaként azonosították a spontán rezisztens mutánsok fordított genomikájával. Annak ellenére, hogy a cymA, az ecumicin és a lassomicin közös célt szolgál, a szerkezeti jellemzések és az egyes vegyületekkel szembeni rezisztenciát biztosító mutációk helyzete azt sugallja, hogy mindegyik kissé eltérő helyzetben kötődik a ClpC1 N-terminális tartományához (5b.ábra)., Például, ellentétben cymA, valamint ecumicin, lassomycin nagyon alapvető, amely több Arg maradványok, valamint a kikötőben egy erősen savas régió ClpC1.74
CymA, ecumicin, valamint lassomycin minden baktericid ellen replikálódó M. tuberculosis, számos más mycobaktérium faj multidrug-rezisztens M. tuberculosis. Fontos, hogy aktívak a nem replikáló M. tuberculosis ellen is. Az AAA+ Atpázisok lényegtelenségének hiányával összhangban mindegyiknek nincs aktivitása más Gram-pozitív és Gram-negatív fajokkal, például az S. aureus és a P. aeruginosa ellen., Ennek a sajátosságnak előnyei vannak, mivel az emberi mikrobioták commensal tagjaival szemben is hiányzik az aktivitás.
az M. tuberculosis sejthalálának előidézése érdekében úgy tűnik, hogy az ecumicin és a lassomicin stimulálja az ATPáz aktivitást, de nem gátolja a fehérje lebomlását.73, 74 ily módon gátolja a természetes szubsztrátok lebomlását, ami felhalmozódásához és toxicitásához vezet, hasonlóan mind a ClpP inhibitorok, mind az M. tuberculosis aktivátorainak hatásához., Ezzel szemben ecumicin, valamint lassomycin, cymA javasolta, hogy növelje a fehérje lebontás, ahogy azt a csökkenése LeuAspAsp tripeptide-jelölt zöld fluoreszcens fehérje fluoreszcencia célzott, hogy ClpC1 a lappangási a cymA.71 lehetséges azonban, hogy a fluoreszcencia csökkenése a clpc1 által a lebomlás helyett kibontakozó zöld fluoreszcens fehérje eredménye, ezért a cymA-nak ugyanaz a leválasztási mechanizmusa lehet, mint az ecumicinnek és a lassomicinnek., Számos kérdés megválaszolatlan marad ezeknek a gyógyszereknek a hatásmechanizmusával kapcsolatban, beleértve a fehérje kibontakozására gyakorolt hatásukat, valamint az ATPáz aktivitásának stimulálását és a proteolízist gátolják, például a Clp1p2-vel való kölcsönhatás gátlásával. Továbbá, jellemzése még folyamatban van egy újabb ClpC1 inhibitor nemrég felfedezett, a rufomicin analóg RUF-I. 75
annak ellenére, hogy a viszonylag nagy potenciát cymA, ecumicin és lassomycin ellen M. tuberkulózis, optimalizálás farmakológiai tulajdonságok van szükség., Például a cymA máj clearance-ét és rövid felezési időt mutat egerekben, az ecumicin pedig korlátozott oldhatósággal és gyenge bélfelszívódással rendelkezik.13, 73 a legújabb teljes szintézis és erjedés optimalizálás segíthet ezekben a fejlesztésekben.76, 77, 78
bár a ClpC1-et célzó gyógyszerek érdekes lehetőséget jelentenek az anti-M. tuberkulózis terápiákra, általában nem rendelkeznek baktericid hatással az aktinobaktériumokon kívüli fajokkal szemben., Ezekben a fajokban, ahol a ClpP és a kapcsolódó AAA+ Atpázok nélkülözhetetlenek, lehetséges, hogy ezeknek az Atpázoknak a célzása a ClpP inhibitorokkal megfigyelt antivirulenciához hasonló hatást fejtene ki. Egy ilyen vegyületnek azonban valószínűleg képesnek kell lennie arra, hogy több ATPase-partnerre irányuljon annak érdekében, hogy olyan széles körben elterjedjen, mint a ClpP-re gyakorolt közvetlen hatás. Ezeket a potenciális antivirulencia hatásokat nem vizsgálták cymA, lassomycin vagy ecumicin esetén.,
a bakteriális proteolitikus komplexek specifikusságának elérése
, a HslUV kivételével mindegyiknek van humán ortologja, és sokan valójában intenzíven tanulmányozzák potenciális rákellenes célpontként. Például a mitokondriális proteázok, a LONP1, a ClpXP és az m-AAA (FtsH homolog) fontos szerepet játszanak a mitokondriumok minőségellenőrzésében, különösen a légzőszervi stressz során.Az M-AAA 79 mutációja szintén szerepet játszik a spasztikus paraplegiában, egy örökletes neurodegeneratív betegségben.80 mint ilyen, elengedhetetlen, hogy az antimikrobiális szerek képesek legyenek kifejezetten a bakteriális homologra célozni.,
öngyilkossági szubsztrátként ható proteázgátlók esetében a konzervált katalitikus mechanizmusok miatt a specificitás elérése kihívást jelenthet. Valójában a specificitás hiánya tapasztalható mind a prokarióta proteaszóma, mind a bakteriális lon proteáz inhibitorainak kifejlesztésére irányuló erőfeszítésekben. Az M. tuberculosis prokarióta proteaszóma ígéretes gátlást tesz lehetővé, mivel in vitro elengedhetetlen a növekedéshez, de elengedhetetlen a nitrogén-monoxid stressz túléléséhez81 és az egerekben való perzisztencia.,62, 82 számos kísérletet tettek egy gyógyszer kifejlesztésére a mycobacterium proteasome ellen, általában peptidil-epoxiketonok, aldehidek vagy bórátok formájában, de a legtöbb gátolja az emlős proteasome-ot, mint az M. tuberculosis.A 83 szelektivitás azonban nem példa nélküli, amint azt az oxatiazol-2-on vegyületek GL5 és HT1171 felfedezése is bizonyítja (6.ábra). Ezek a vegyületek baktericidek a nem replikáló M ellen., a salétromsav-oxid21 al-gátló szintjeivel kezelt tuberkulózis >1000-szer nagyobb aktivitással rendelkezik a mycobacteriummal szemben a humán proteaszómákkal szemben. Úgy gondolják, hogy a specificitást a hatóanyagnak az emlős proteaszómákban nem konzervált hatóanyagon kívüli szermaradékokkal való kölcsönhatása biztosítja.21
M. az oxatiazol-2-on család tuberkulózisproteasome inhibitorai.,
Lon is tesz egy ígéretes célpont, mint ez volt, részt vett a biofilm kialakulását, mozgékonysága, stressz tűrés, valamint a mutánsok kimutatták, hogy csökkentik a megszállás, majd virulencia a Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, a kolera a Vibrio P. aeruginosa-t.84, 85, 86, 87 a bakteriális Lon inhibitorok azonosítására irányuló eddigi egyetlen erőfeszítés során a proteaszóma inhibitorokat in vitro szűrték, és azonosították az MG262 peptidil-boronátot.,18 Ez a vegyület azonban még mindig 2000-szer erősebb a 20-as évek proteaszóma ellen.18 mint az oxatiazol-2-on vegyületek esetében, a humán homológokban eltérő szermaradékok kihasználása valószínűleg szükséges egy nagyon specifikus Lon-inhibitor kialakulásához.
Sajátosság is lehet elérni azáltal, hogy kint a katalitikusan aktív az oldalon, hogy kötőhely, hogy megzavarhatja proteáz funkció, de rosszul kézirattár között emberi baktériumok orthologs. Az ADEPs találóan bemutatja ennek a megközelítésnek a potenciálját., Bár közvetlenül nem vizsgálták humán ClpP-n (hClpP), az Adep-k nem mérgezőek az emberi sejtekre 25 µg ml−1-ig, ami arra utal, hogy gyenge, ha van ilyen, affinitása van az emberi enzimhez.Az E. coli (EcClpP) és a hClpP (Hclpp) szerkezeti összehasonlítása alátámasztja ezt az elképzelést. Gerincszerkezetük nagyrészt konzervált, gyökértömése 0.,63 Å; 88 az ADEP-kötéshez használt hidrofób zseb vizsgálata azonban azt mutatja, hogy a hClpP-nek számos szubsztitúciója van, amelyek csökkentik hidrofobicitását (Asn55Pro, His60Tyr és His112Phe), valamint a dokkoló horony disztális részén található töltésinverziót (Glu56Lys). Lehetséges, hogy ezek a változások megakadályozzák az ADEP kötődését a hClpP-ben. Meg kell azonban jegyezni, hogy az EcClpX, bár nem EcClpA, aktiválhatja a hClpP-t.88 mindenesetre a kevésbé konzervált szabályozási helyszíneket kötő Gyógyszerek keresése lehet a kulcs a nagyon specifikus antibakteriális szerek megtalálásához.