anyagok és módszerek
egereken.
vad típusú c57bl / 6 egereket nyert a Charles River Laboratories (Wilmington, MA). PDE8A Ko egerek eredetileg által termelt Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) szerződés alapján a Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Egyesült Királyság). Ezt követően C57BL / 6 egerekre tenyésztették őket a Washingtoni Egyetemen 10 generáció számára. A jelentett kísérletekhez 6-8 hetes korú egereket alkalmaztak., Minden alkalmazott eljárást a Washingtoni Egyetem állategészségügyi és Állategészségügyi Intézete (Iacuc) hagyott jóvá a laboratóriumi állatok gondozására és használatára vonatkozó Nemzeti Egészségügyi Intézetek útmutatójának megfelelően.
valós idejű PCR.
Here ben készült, a teljes RNS-vad típusú, illetve PDE8A-null egér here segítségével felső indexben III. Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). A valós idejű PCR-t a Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) használatával hajtottuk végre., Primerek (IDT, Coralville, IA) a PDE8A, irányított a terület downstream a célzás kazetta, a következők voltak: előre primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon 19); fordított primer, ATGTCTTCCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). A hipoxantin-guanin-foszforiboziltranszferáz primerjei a következők voltak: elülső primer ATTATGCCGAGGATTGGAA; fordított primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
in Situ hibridizáció.
a riboprobe szintézis sablonját PCR-vel nyerték az egér PDE8A szekvenciáját tartalmazó plazmid használatával., Különösen az egér pde8a (exons 17-20) 3 ‘ régióját a következő primerek segítségével erősítették meg:forward primer, aattaacctcactaaaggacggcgtatttcctttccccag( aláhúzott T3 fág RNS polimeráz promoter szekvencia); reverz primer, TAATACGACTCACTATAGGGACGTCGGCACACACTTAAT (aláhúzott T7 fág RNS polimeráz promoter szekvencia). A PCR-termékeket agaróz gélekből izolálták, és Gélkivonó készlettel (Qiagen, Valencia, CA) tisztították., A 35S címkével ellátott riboprobákat in vitro transzkripcióval szintetizáltuk egy MAXIscript T3/T7 készlettel (Ambion, Austin, TX), A T3 és T7 fág RNS polimeráz promoter oldalakat tartalmazó PCR termék sablonként történő felhasználásával. In vitro átírás végezték, 20 µl reakció tartalmazó keverék 5 µl UTP (PerkinElmer, Boston, MA), valamint a T3 RNS polimeráz vagy a T7 RNS polimeráz megszerezni az értelemben, vagy antiszensz riboprobe, ill.
a heréket vad típusú és PDE8A Ko egerekből boncolták, és gyorsan megfagytak a szöveti tek O. C. T. vegyületben (Sakura, Torrence, CA) szárazjégen., A metszeteket (20 µm) egy Kriosztátba vágták, egy Szuperfrosztra és mikroszlidre (VWR, West Chester, PA) szerelték fel, majd levegőn szárították. A metszeteket rögzített 4% paraformaldehidet 15 percig szobahőmérsékleten, kezelt 0.25% ecetsav-anhidrid a 0,1 M trietanol-amin (pH 8.0) 10 perc, dehidratált keresztül osztályozott etanol sorozat (30, 60, 80, 95, 100% – os). A szakaszok, majd inkubáljuk hibridizáció puffer nedves kamrában 60°C-on 4 h. Öblítés után a 2× SSC (standard citrát só; 1× SSC = 0.15 M nátrium-klorid/0.015 M nátrium-citrát, pH 7-es.,2), a szakaszok dehidratált keresztül Osztályozott etanol sorozat. Hibridizáció végezték a puffert tartalmazó 35S-jelölt antiszensz vagy értelme szonda (40 pg/34,000–38,000 cpm per µl) a műanyag coverslips a nedves kamrában 60°C-on egyik napról a másikra. A burkolatokat óvatosan eltávolítottuk, és a szelvényeket 2× SSC-vel mossuk, amely 10 mM DTT-t tartalmaz 30 percig kétszer 60°C-on. a szelvényeket ezután 30 percig inkubáltuk 37°C-on, 20 µg/ml Rnasea-val 0,5 M NaCl-Ben, 10 mM Tris·HCl-ben (pH 7.,5), 1 mM EDTA, majd mossuk 50% formamid, 2× SSC tartalmazó 10 mM DTT, 30 perc 60°C, 1× SSC tartalmazó 10 mM DTT, 30 min 60°C-on, majd további 0,1× SSC tartalmazó 10 mM DTT, 30 min 60°C. Végül a szakaszok ki volt száradva az etil-alkohol (70, 95, 100% – os), levegőn szárított, majd kitéve a BioMax XAR film (Eastman Kodak, Rochester, NY) 9 h. Látni a sejt megoszlása PDE8A mrns hibridizáció, a csúszdák voltak bevonva Autoradiography NTB emulzió (Eastman Kodak), valamint kitéve, 1 hét, 4°C., A diákat hematoxilinnal fejlesztették ki, rögzítették és ellenezték, majd Kanadában (Sigma-Aldrich) szerelték fel.
PDE8A Immunprecipitáció és vizsgálat.
az egér spermáját a cauda epididymis-ből úsztatott módszerrel (38) izolálták, és PBS-ben homogenizálták, amely 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidin és Sigma proteáz inhibitor keveréket (Sigma-Aldrich) tartalmaz., A homogenate volt centrifugált 5 perc 16,000 × g a mikrocentrifuga, majd 200 µl-es aliquot a felülúszót, egyenértékű 106 sperma, voltak keltetett egyik napról a másikra 20 µl 1:1 hígtrágya fehérje G-agaróz gyöngyök (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) PDE8A antitest jelenlétében vagy hiányában (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Másnap az immunoprecipitátot háromszor PBS-vel mossuk, majd 10 nM-es cAMP szubsztrát, 40 mM-es Mops (pH 7,5), 15 mM Mg-acetát, 2 mM EGTA és 0,2 mg/ml BSA jelenlétében vizsgáljuk a PDE-aktivitás szempontjából, mint ref. 39.,
Immunhisztotokémia.
a frissen fagyasztott egér heréket Szövet-tek O. C. T. vegyületbe ágyazták, majd szeletenként 20 µm-es kriosztátra osztották. Szövetrészeket vagy izolált Leydig sejteket szárítottak és 4% (wt/vol) paraformaldehid/PBS-ben (pH 7.4) rögzítettek szobahőmérsékleten 10 percig, majd háromszor PBS-vel mosták. A diákat blokkoló pufferrel (5% szamárszérum, 1 mg/ml BSA és 0) előinkubálták.,1% Triton X-100-PBS-en), 1 h szobahőmérsékleten, inkubáljuk egy anti-PDE8A antitest (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) tartalmazó PBS-ben 1% szamár szérum, 1 mg/ml BSA, 0,1% Triton X-100 egy éjszakán át 4°C, mosott PBS-ben tartalmazó 0.05% Tween 20 háromszor 20 percig inkubáljuk szamár anti-kecske Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) a PBS-t tartalmazó 1 mg/ml BSA, 0,1% Triton X-100 2 h szobahőmérsékleten, majd a mosott., A diákat tovább inkubáltuk blokkoló pufferrel, amely 5% kecskeszérumot tartalmaz 1 órán át szobahőmérsékleten, inkubáltuk citokróm P450 oldallánc-hasító enzimmel (CYP11A) antitest (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) egyik napról a másikra 4°C-on, 0,05% – os 20% – os Tween-t tartalmazó PBS-ben 20 percen keresztül háromszor 20 percig mossuk, és kecsketartó alexa488 (1:500; Invitrogen) inkubáljuk a fentiek szerint. A szekciókat végül a PRO-3 (1:1000; Invitrogen) PBS-ben 5 percig ellensúlyozták, megmosták, majd lassú arany antifade reagensbe (Invitrogen) szerelték., A PDE8A antitest specificitás teszteléséhez az antitestoldatot 2, 5 µg/ml antigén peptiddel (Santa Cruz Biotechnológia) előinkubáltuk 2 órán át szobahőmérsékleten, festés előtt. Egyes szakaszokat a másodlagos antitestek miatt a háttér meghatározására szolgáló elsődleges antitestek nélkül inkubáltak. Az immunfestő jeleket konfokális mikroszkóppal (Leica sl; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). a β-galaktozidáz aktivitást, amelyet a LacZ gén nukleáris lokalizációs jelével fejeztek ki a célzókazettában, x-gal festéssel értékelték., A szekciókat először anti-CYP11A antitesttel inkubálták, majd nyúlellenes alkalikus foszfatáz konjugátum (1:500; Invitrogén) és NBT / BCIP (Roche) követte a színfejlődéshez. Az X-gal festést ezután az alábbiak szerint hajtottuk végre (40) Az X-gal keverékben 37°C-on egy éjszakán át. A szekciókat glicerinnel/trisz-pufferelt sóoldattal mostuk és szereltük fel.
Leydig sejt Tisztítás.
a Leydig sejteket a ref. 41. Röviden, a felnőtt egerekből származó heréket dekapszulázták és 34°C-on, 10 percen át rázó vízfürdőben diszpergálták 10 ml 199 (M-199) közegben, 0-mal.,25 mg/ml kollagenáz D, 35 mU/ml Dispase II és 6 µg/ml DNáz I. a szöveti diszperzió megszüntetése érdekében 40 ml 1% BSA-t adtak 15 mM Hepes-t, 4 mM-es nátrium-hidrogén-karbonátot és 25 µg/ml szójabab-tripszin inhibitort tartalmazó m-199 közegben az eredeti szuszpenzió hígításához. A csöveket ezután többször befedték és megfordították. A szemcsés tubulusokat a gravitáció engedte leülepedni, és összegyűjtötték az interstitialis sejteket tartalmazó felülúszót. Az eljárást kétszer megismételtük az intersticiális sejtek további betakarítására., A sejteket 50 ml-es csövekben, 800 × g-os centrifugálással, 20 percig 4°C-on, majd folyamatos Perkoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) gradienssel frakcionálták (55% Percoll HBSS-ben, 15 mM Hepes-szel és 25 µg/ml szójabab-tripszin inhibitorral pufferelve), 35 ml teljes térfogatban. A gradienseket in situ-ban egy JA-20 rögzített szögű rotorban (Beckman Coulter, Fullerton, CA) centrifugálással alakították ki 23,700 × g-on 30 percig 4°C-on.a sűrűségjelző gyöngyöket (GE Healthcare) tartalmazó csövet referenciaként használták a különböző sűrűségű rétegek azonosítására., A Leydig sejteket a gradiens aljára 1, 07 G/ml sűrűséggel kezdve nyerték vissza. Öt kötetben HBSS volt hozzá, hogy híg a Percoll, a sejtek pellet 200 × g, 10 perc, 4°C. Az utolsó golyót kapott két herék, dúsított Leydig sejtek, volt újraszuszpendált 4 ml DMEM/F-12 kiegészítve 1% BSA használt, azonnal a kísérletek.
3β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz vizsgálat.
A tesztoszteron termelés mérése.
a Leydig sejteket a fentiek szerint reszuszpendálták, és 100 µl aliquotot adtak ki 96-kútlemezben., A sejteket 150 µl végső térfogatban stimulálták, a rekombináns LH jelzett koncentrációjával 3 órán át, 5% – os CO2 inkubátorban, 37°C-on.a rekombináns humán LH-t a & Peptidprogramból (A. F. Parlow, Torrance, CA) nyerték. A Neogen (Lexington, KY) immunoenzimatikus tesztkészletével az egyes LH-koncentrációkhoz a duplikált sejtminták közegébe felszabaduló tesztoszteront mértük.
minden adat átlag ± SD-ként van kifejezve., A tesztoszteron termelésre vonatkozó LH-hatás EC50 értékeit úgy számítottuk ki, hogy az egyes Leydig-sejtek előkészítéséhez kapott LH koncentráció-függőségi görbéket nemlineáris módon illesztettük be egy szoftvercsomag segítségével (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). A statisztikai elemzést a hallgató t-tesztje végezte. A különbségeket szignifikánsnak tekintették a p < 0, 05.