Madame Lelica

Rakenne ACLY kanssa CoA paljastaa tuottavaa ja tuottamatonta CoA conformations

– Meillä on tuotettu yhdistelmä -, koko-pituus ACLY Escherichia coli kaikki meidän biokemiallisia ja rakenteellisia analyysejä (Extended Data Fig. 1 A, b)., Ero skannaus fluorimetry entsyymin eri cofactors vahvistettu sitova ja mahdolliset rakenteelliset muutokset liittyvät ligandien lisätty yksin tai yhdessä (Extended Data Fig. 1c). Käytimme näitä tietoja ohjataksemme ACLY: n rakenteen määrittämistä sen substraattien tai co-tuotteiden kanssa.

Olemme valmiita rekombinantti proteiini, ja alun perin tehty negatiivinen tahra yhden hiukkasen analyysi proteiinin puuttuessa aineenvaihduntatuotteiden (ACLY-apo)., Kaksiulotteisen (2D) luokan keskiarvot 3 000 hiukkasesta vahvistivat, että proteiini muodosti tetrameerin (Extended Data Fig. 2 A, b). Saadaksemme lisää rakenteellisia yksityiskohtia, teimme cryo-EM-tutkimuksen ACLY-citrate-CoA-kompleksista. Jälkeen useita kierroksia optimointi cryo-EM näytteitä, olemme päättäneet, D2-symmetrinen cryo-EM rakenne ACLY–citrate-CoA-rakenne keskimäärin kokonaisratkaisun 3.0 Å. (Extended Data Viikunat. 2C, d, 3 ja 4 sekä taulukko 1).,

ACLY–citrate-CoA-rakenne muodostaa homotetramer kanssa keski-tetrameric CSH-moduuli ja kaksi TUHKA verkkotunnukset vastakkaisissa päissä CSH-moduuli (protomers 1 & 2 ja 3 & 4) (Fig. 1 A, b). TUHKA domain (jäämät 1-806) hyväksyi rakenne hyvin samanlainen kuin aiemmin raportoitu α/β arkkitehtuuri eristetty N-terminal domain pakko citrate ja ADP24., CSH domain (jäämät 859-1101) koostuu yksinomaan heliksejä ja lyhyitä silmukoita, joiden rakenteellinen homologia on dimeerin citrate nopaliinisyntaasin dimeerit, että rajat ~90° kulmassa (Extended Data Fig. 5 a). TUHKA ja CSH verkkotunnukset kunkin polypeptidi ketju on yhdistetty pitkälti pidennetty, ~50-jäännös kela alueella paitsi lyhyen α-helix välillä jäämiä 824 ja 829. Kierteiset alueen sisällä tämä linkitys on vain pisteen merkittävää yhteyttä (van der Waalsin vuorovaikutus) kahden TUHKA verkkotunnukset toisella puolella molekyyli., Laajennettu linker mahdollistaa yhden alayksikön CSH: n vuorovaikutuksessa toisen alayksikön ASH-verkkotunnuksen kanssa CSH-moduulin vastakkaisella puolella. Toisin kuin suhteellisen harva vuorovaikutusta TUHKA protomers, CSH-toimialueet muodostavat laaja pääasiassa van der Waalsin vuorovaikutukset, jotka viittaavat siihen, että CSH verkkotunnuksia toiminta koska jäykkä tetrameric moduuli, kun taas neljä TUHKA verkkotunnukset ovat joustavampia. Tämä on yhdenmukaista sen kanssa, että EM-kartalla havaittu em-paikallinen resoluutio on korkein CSH-alueella (2.8 Å, Extended Data Fig., 4c) ja aikaisemmat havainnot, että CSH-domain on korkeampi sulamislämpötila suhteellinen TUHKAA ~75 °C vs. ~55 °C, respectively21.

CoA sitoo rajapinnalla CSH-ja TUHKA-aloilla erillinen alayksikön ja näyttää ’katkottua’ n superdomains yhdessä. Se adeniini pohja ja riboosi rengas vuorovaikutuksessa CSH-domain yhden monomeerin ja pantoteenihappo käsi-ja β-merkapto-ryhmä pistää aktiivisen TUHKA verkkotunnuksen toinen alayksikkö (Fig. 1c (vas.) ja kuva. 1D (vas.))., Mallinnus CoA perustuu havaintoon, että ADP fosforyloituu ryhmä on hyvin ratkaista cryo-EM tiheys. Mercapto-ryhmä ei kuitenkaan saanut hyvää ratkaisua, mikä viittaa alueen joustavuuteen. Vaikka useita jäämiä CSH ja TUHKA verkkotunnuksia tehdä van der Waals vuorovaikutus CoA -, vety joukkovelkakirjoja S574, R576 ja S577 TUHKA domain ja K964 päässä CSH-domain riboosi fosfaatti oxygens näyttävät erityisen tärkeä rooli vuonna nidonta CoA-TUHKA–CSH-käyttöliittymä., Mielenkiintoista, E599 on majoitusliike, vety-liimaus etäisyys mallinnettu rikki atomin CoA, syyllistämättä, että se voisi olla tärkeä katalyyttinen rooli. Merkitystä proteiini–CoA-interaktio TUHKA ja CSH domain tukee mutaation herkkyys jäämiä R576 ja K964, ja mahdollinen katalyyttinen rooli E599 tukee sen mutaation herkkyys tai Q, mutta ei D (Fig. 1 F). Vaikka sitraatti oli mukana näyte cryo-EM jälleenrakentamiseen, se ei voi varmuudella ratkaista cryo-EM kartta.,

Koska ratkaisematta tiheys varten merkapto ryhmä CoA, me tehdään toinen jälleenrakentamiseen ACLY–citrate-CoA-rakenne asettamatta D2-symmetria määrittää, jos CoA saattaa antaa eri conformations eri protomers. Pystyimme valmistelemaan rekonstruktion asettamatta symmetriaa (C1, epäsymmetrinen suljettu) nimellistarkkuudelle 3,5 Å. Tässä ACLY–citrate-CoA-C1 epäsymmetrinen suljettu rakenne, resoluutio noin TUHKA domain on huonompi kuin D2 rakenne, mutta paikallinen resoluutio ympäri CSH-domain on edelleen suhteellisen korkea, 2,8 3,2 Å., Analyysi tämän ACLY–citrate-CoA-C1 epäsymmetrinen suljettu rakenne paljasti, että jokaisen TUHKA-aloilla, ja kolme neljästä CSH-toimialueet ja-CoA-molekyylejä, antoi sama kokoonpano kuin D2 rakenne. Kuitenkin, yksi CoA-molekyylejä hyväksyy vaihtoehtoinen rakenne, jossa ADP fosforyloituu osa on siirtynyt ~8 Å kohti CSH-moduuli ja pantoteenihappo varsi on taivutettu yli vuorovaikutuksessa CSH (Fig. 1b, C (oik.) ja Fig. 1e). Tätä vaihtoehtoista CoA-konformaatiota vastaava Kryo-EM-tiheys on hyvin selkeä(kuva. 1c (oik.))., Merkillistä, cryo-EM tiheys on myös havaittu hyvin järjestettyä vesi-molekyyli, joka näyttää silta vetysidos vuorovaikutus terminaali rikki atomin CoA puolella ketju jäämiä H900, D1026 ja R1065 ylimääräisiä van der Waals vuorovaikutusten L969, I973, H975 ja R976 (Fig. 1D (oik.)). Samanaikaisesti tämän varajäsen CoA-rakenne, silmukan sisällä CSH-domain (jäämät 965-986) ja reuna-heliksejä muutos mahtuu vaihtoehtoinen asema CoA-adeniini-emäs (Fig. 1e)., Mutaatioita H975, R976, D1026 ja R1065 että alaniini kaikki näyttää vaarantunut toimintaa, mikä viittaa siihen, että sitova CoA CSH domain on jotenkin mukana entsyymin toimintaa (Kuva. 1 F). Kun otetaan huomioon, että CoA on reagoitava citrate TUHKAN verkkotunnuksen, me katso CoA conformations kanssa kysteamiini ja pantoteenihappo käsi, joka osoittaa kohti TUHKA ja CSH kuin ’tuottava’ ja ’tuottamattomia’ CoA conformations, vastaavasti, pakko ACLY.,

Rakenne ACLY–citrate-CoA tekemät paljastaa epäsymmetrinen TUHKA linjaukset

lisäksi suurten ACLY–citrate-CoA-hiukkanen väestöstä, mikä vastaa 57% luokan 3 hiukkasia, tekemät ja ACLY–citrate-CoA monimutkainen hiukkasia, jotka edustavat 23% alaluokka hiukkaset (10 prosenttia) oli myös kuvattu 3D jälleenrakentamiseen asettamatta symmetria päätöslauselman 4.3 Å (Extended Data Fig. 3)., Tämä tekemät hiukkasia on yleinen rakenne, joka on samanlainen suurten ACLY–citrate-CoA-väestö, paitsi että yksi neljästä TUHKA-aloilla on pyöritetty ~50° kohti sen lähin TUHKA-alayksikkö antaa enemmän ”avoin” rakenne, niin me kutsumme sitä ’ACLY–citrate-CoA-C1 asymm auki’. Tässä rakenne, tiheys on näkyvissä vain, että ADP fosforyloituu komponenttina kaksi CoA-molekyylejä sidottu kaksi symmetrinen TUHKA verkkotunnukset (Fig. 2 A, b). Yksi symmetrisistä ja epäsymmetrisistä ASH-alayksiköistä ei osoita mitään näyttöä CoA: n sitoutumisesta., Asymmetrinen ASH-alue näyttää olevan yhteensopimaton tuottavan CoA-sidonnan kanssa(kuva. 2 C). Ehdotamme, että tämä ACLY–citrate-CoA-C1 asymm avoin rakenne on väliaikainen tila ACLY, jossa kaksi aktiivista sivustoja ovat pohjamaalattu katalyysi ja kaksi ei. Tämän rakenteen havainnointi viittaa myös siihen, että neljä toimivaa toimipistettä voivat toimia itsenäisesti.

Rakenne ACLY-apo tila on epäsuotuisa CoA sitova

Koska rajallinen vuorovaikutus CSH-ja TUHKA-aloilla, meidän tiedusteli rakenne ACLY ilman sitoo ligandeja. Tätä varten määritimme aclyn Kryo-EM-rakenteen apo-muodossa, jonka pystyimme ratkaisemaan 4,3-Å: n resoluutioon (Extended Data Fig. 4a ja taulukko 1)., Vertailu ACLY-apo ja ACLY–citrate-CoA-rakenteet paljastaa, että apo valtion, kunkin TUHKA paria vastakkaisilla puolilla tetramer pyörivät toisiaan kohti, jonka ~10° muodostaa enemmän auki ACLY tetramer ja aseta TUHKA-aloilla kantoja, jotka näyttävät epäsuosioon tuottava CoA-sitova (Fig. 3). Erityisesti TUHKAN silmukoita keskittyy F533, S574 ja K1018 (viereisestä CSH domain) olisi ristiriidassa CoA kuin sidottu ACLY–citrate-CoA-rakenne (Kuva. 3 B)., Lisäksi kaksi jäämiä, jotka ovat sisällä vety-liimaus etäisyys CoA-TUHKA verkkotunnuksen, R576 ja E599, siirrä pois vety-liimaus etäisyys ACLY-apo rakenne (Kuva. 3 C). Samaan aikaan CSH-moduuli pysyy suurelta osin muuttumattomana näiden kahden rakenteen välillä. Yhdessä, vertailu ACLY-apo ja ACLY–citrate-CoA-rakenteet paljastaa, että ACLY-apo rakenne on järjestää mahtuu CoA-alustaan.

ACLY–asetyyli-CoA–HEI monimutkainen paljastaa CoA–sitraatti lyase reaktio tapahtuu SAARNI toimialue

Ero skannaus fluorimetry tiedoista kävi ilmi, että sekä asetyyli-CoA-ja HEI tuotteiden vakiintunut ACLY proteiinia (Extended Data Fig. 1c)., Tämä havainto osoitti, että voisimme kaapata ACLY–HEI–asetyyli-CoA tuotteen monimutkainen, ja jotta paremmin ymmärtää reaktion mekanismi. Tämän vuoksi olemme päättäneet, kryo-EM rakenne monimutkainen, joka päätimme 3.1-Å resoluutiolla käyttämällä D2-symmetria (Extended Data Fig. 4). Yleinen rakenne ACLY–co-tuotteen monimutkainen oli eniten samanlainen symmetrinen ACLY–co-alustan (ACLY–citrate-CoA-D2) monimutkainen, kokonaisvaltainen root-mean-square poikkeama (r.m.s.d.) ja 0.407 Å Ca atomien (Fig. 4 A)., Huomasimme, että asetyyli-CoA käytössä sama sitova sivusto kuten CoA-ja oli myös vakiintunut sama perus jäämiä, R576 ja K964 (Fig. 4 B). Lisäksi pystyimme yksiselitteisesti mallintamaan kaksi OAA-molekyyliä, jotka sitoutuivat kuhunkin ACLY-alayksikköön(Kuva. 4 b, c). Yksi HEI molekyyli (OAA1) päällekkäinen citrate sitova tasku sisällä SAARNI toimialue ja proksimaalinen, että asetyyli-ryhmä asetyyli-CoA. OAA1 tekee suhteellisen vaatimaton vuorovaikutus proteiinia, kuten vety joukkovelkakirjoja N346 ja T348-ja van der Waals vuorovaikutus F547., Toinen OAA-molekyyli (OAA2) sitoutuu CSH-domeeniin ja tekee laajempia vuorovaikutuksia ACLY: n kanssa kuin OAA1. OAA2 yhteystiedot CSH-moduulin kautta vety joukkovelkakirjoja H900, D1026, R1065 ja R1085 läpi ja van der Waalsin vuorovaikutukset F935 ja F1061 yksi alayksikkö, kautta sekä vety bond R1065 toisesta alayksikkö (Fig. 4 C). OAA2 päällekkäisyyksiä hyvin sidottu HEI sian sydän citrate synthase25 (Extended Data Fig. 5 b).

– Meillä on myös hienostunut kryo-EM-kartta ACLY–HEI–asetyyli-CoA rakenne ilman symmetria rajoitteet ja saada identtinen rakenne D2-symmetria, paitsi että yksi neljästä asetyyli-CoA-molekyylien havaittiin kaksi mahdollista conformations, että pantoteenihappo käsi asetyyli-CoA, yksi kysteamiini of CoA kohti SAARNI toimialue, kuten muut kolme protomers, ja toinen kohti CSH-domain (Extended Data Fig. 6 A)., Kuitenkin, toisin kuin vaihtoehtoinen rakenne CoA löydy ACLY–citrate-CoA-rakenne, asema ADP fosforyloituu ryhmä ei muuttanut näiden kahden conformations. Mahdollinen vaihtoehtoinen rakenne asetyyli-CoA voisi ehdottaa mahdollista alustan julkaisu väylän entsyymi liikevaihto tai autoinhibitory valtion entsyymin (käsitellään jäljempänä).

havainto OAA1 ja asetyyli-CoA tuotteiden TUHKA domain vahvasti ehdotti, että lyase kemia suoritetaan siellä, toisin kuin aiemmat ehdotukset, että tämä kemia suoritetaan CSH domain22,23., Me spekuloida, että OAA2 toiminto voi auttaa järjestämään CSH verkkotunnuksen yhteistyötä TUHKA domain-ja/tai toimia toisen HEI tuotteen autoinhibitory-sivuston että voisi eristää pantoteenihappo käsi asetyyli-CoA (tai kysteamiini of CoA) istua koko CSH-domain, niin että toisiaan poissulkevia sitova CoA tuottava rakenne on estetty suurella cellular HEI pitoisuudet (Extended Data Fig. 6 A)., Mielenkiintoista, vaikka tuottava laajennettu CoA suunta kysteamiini osoittaa kohti ASH domain ei voida mallintaa ACLY-apo ilman merkittävää steric yhteentörmäys (Kuva. 2b), käännetty suunta kysteamiini osoittaa kohti CSH verkkotunnuksen voi (laajennettu data Kuva. 6 B). Tämä on sopusoinnussa meidän havainnot, että CoA on mahdollisuus sitoa ACLY ilman sitraatti ja/tai ATP (tiedot eivät ole näkyvissä), mutta ehdotamme, taivutettu rakenne, kuten havaittiin yksi ACLY–citrate-CoA-C1 protomers (Fig. 1c (oik.) ja kuva., 1D (oik.)) ja myös CSH domainin eristetty rakenne22.

Yhdenmukainen hypoteesin, että OAA2 voi toimia ACLY autoinhibitory sivusto, edellinen tutkimus osoitti, että HEI voi estää rotan maksan ACLY tavalla, joka on ei-kilpailukykyinen citrate26. Vahvista toiminnallinen merkitys kahden HEI sivustoja havaittu ACLY–HEI–asetyyli-CoA rakenne, meillä työskentelee steady-state-fluoresenssi sammutus kokeilla., Koska ohjaus kokeilu, meidän on ensin titrataan citrate osaksi ACLY puuttuessa tai läsnä kyllästää pitoisuus CoA-ja pystyivät sopimaan tiedot yhden citrate sitoutumispaikan Kd-arvot 3,4 ± 0,5 µM ja 1,4 ± 0,3 µM puuttuminen tai läsnäolo-CoA, jossa on hyvä R2-arvot 0.92 ja 0,84, vastaavasti (Kuva. 4d). Tämä on sopusoinnussa yksi citrate sitova sivusto havaittu ACLY TUHKA domain kiderakenne pakko citrate13 ja kiderakenne ehjä ACLY pakko CoA-ja citrate22, joka osoittaa, että CoA vakauttaa citrate sitovia ACLY TUHKA domain22., Olemme ensi titrataan HEI osaksi ACLY ja totesi, että tiedot sopivat huomattavasti paremmin kaksi-sivuston malli (R2 = 0.99) kuin yksi-sivuston malli (R2 = 0.93) (Fig. 4 e). Kaksi-sivuston sitova malli paremmin huomioon kaksivaiheinen fluoresenssin lasku, joka ilmenee suuremmilla HEI pitoisuuksia ja aiheuttaa korkea-affiniteetti HEI sitoutumiskohta (Kd = 15 ± 4 µM), jonka osuus kolmasosa koko fluoresenssin muutos ja alhainen affiniteetti HEI sitoutumiskohta (Kd = 1,300 ± 500 µM), jonka osuus on kaksi kolmasosaa kokonaismäärästä fluoresenssin muutos (Fig. 4 e)., Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia toiminnallinen merkitys kahden HEI sitova sivustoja havaittu ACLY–HEI–asetyyli-CoA-rakenne.

ACLY-E599 on voinut toimia tärkeänä katalyyttinen jäännös

ACLY–co-tuotteen rakenne antoi meille mahdollisuuden osoite pitkäaikainen kysymys ACLY molekyylitason mekanismi. ACLY on ehdotettu cleave citryl-CoA-väli-tuella yleinen pohja poimia protoni päässä citrate alustan ja/tai yleinen happo reprotonate, että HEI jättäen group16,27,28., Tämä on yhdenmukaista pH rate-profiilianalyysin kanssa ACLY, jonka pKa on ~8,5 (Kuva. 5 a). Oletamme, että evolutiivisesti konservoituneita E599 on sijoitettu tärkeä katalyyttinen rooli, koska yleinen perus-ja/tai happoa, ja/tai vakauttaa phospho-citryl-CoA-väli (katso seuraava jakso ja Kuva. 4 B). Haudatulle glutamaattijäämälle on todettu suhteellisen korkea pKa-arvo29. Sopusoinnussa tärkeä katalyyttinen rooli E599, huomasimme, että E599A ja E599Q mutantteja on merkittävästi heikentynyt toiminta (Fig. 1f), vaikka kofaktorin sitominen ei vaikuttanutkaan (Kuva. 5 b)., Sen sijaan havaitsimme, että yhtä hapokkaalla E599D-mutantilla oli samanlainen aktiivisuus kuin WT ACLYLLÄ (Kuva. 1f), jolla on samanlainen pH-kurssiprofiili (Kuva. 5 a). Yhdessä tiedot puoltavat E599: n merkitystä AKLY: n katalyysille.

ACLY katalyysi etenee läpi phospho-citryl-CoA-väli TUHKAN domain

tunnistaminen E599 tärkeä katalyyttinen jäännös katkaisua citryl-CoA adduct asetyyli-CoA-ja HEI tuotteet tarjosi meille mahdollisuuden ansa reaktion välituotetta koskevan ACLY-E599Q mutantti läsnäollessa ATP -, sitraatti-ja CoA-co-alustoille., Siksi sekoittaa ACLY-E599Q mutantti kanssa kyllästää pitoisuus ATP -, sitraatti-ja CoA (ACLY-E599Q–ATP-sitraatti-CoA) ja määritetään sen cryo-EM rakenne, joka meillä oli mahdollisuus ratkaista yleistä päätöslauselman 2.85 Å. Rakenne määritettiin asettamalla D2-symmetria ja kävi ilmi, että TUHKA ja CSH aloilla ACLY oli järjestetty samalla tavalla ACLY–citrate-CoA-tuote-ja ACLY–HEI–asetyyli-CoA-rakenteita, joissa on r.m.s.d. arvot Ca atomien 0.584 ja 0.620 Å, vastaavasti., Kuitenkin, toisin kuin nämä muut alustan ja tuotteen komplekseja, ACLY-E599Q–ATP-sitraatti-CoA monimutkainen paljasti huomattavan hyvin määritelty cryo-EM tiheys TUHKA domain aktiivinen sivusto, joka voidaan mallintaa AR (hydrolysoitu ATP) ja phospho-citryl-CoA-väli (Kuva. 6 A, b). Myös, toisin kuin muut ACLY rakenteet raportoitu tässä tutkimuksessa, aminohappo 752-767 silmukka kätkeminen H760 jäännös, joka on osoitettu välittävän fosfaatti siirto ATP citrate, on hyvin tilata ACLY-E599Q–ATP-sitraatti-CoA-rakenne (Kuva. 6 c)., Lisäksi magnesium-ioni-tai vesi-molekyyli, myös ehdottanut vakauttamiseksi H760, on havaittu olevan pakko E599-ja fosfaatti-ryhmä (Fig. 6 c). Tämä havainto viittaa siihen, että His760 jäännös, fosfaatti ryhmä ja magnesium-ioni voi tehdä yhteistyötä vakauttaa citrate for ligaatio CoA TUHKAN domain aktiivinen sivusto. Lisäksi se, että asetyyli-CoA-ja HEI tuotteita ei havaittu tämä rakenne tukee edelleen päätelmiä, jotka E599 on tärkeä katalyyttinen rooli lohkaisu phospho-citryl-CoA-väli asetyyli-CoA-ja HEI tuotteet sisällä TUHKAA domain.,