Materiaalit ja Menetelmät
Hiirillä.
villityypin C57BL/6 hiiriä saatiin Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Pde8a ko-hiiriä valmisti aluksi Deltagen, Inc. (San Carlos, CA)sopimuksen nojalla Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, U. K.). Myöhemmin niitä kasvatettiin C57bl/6-hiiriksi Washingtonin yliopistossa 10 sukupolven ajan. Raportoiduissa kokeissa käytettiin 6-8 viikon ikäisiä hiiriä., Kaikki menettelyjä, joita käytetään hyväksyi Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ja University of Washington, mukaisesti National Institutes of Health Opas Hoito ja koe-Eläinten Käyttöä.
reaaliaikainen PCR.
Kives ekspressio oli valmistettu yhteensä RNA: n villin tyypin ja PDE8A-null hiiren kives käyttämällä SuperScript III ja Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). Real-Time PCR suoritettiin käyttämällä Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Alukkeet (IDT, Coralville, IA) varten PDE8A, suunnattu alueen alavirtaan kohdistaminen kasetti, olivat seuraavat: eteenpäin pohjamaali, GCCACAGAAATGACGAAGC (eksonin 19); reverse primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (eksonin 20). Hypoksantiini-guaniinifosforibosyylitransferaasin primerit olivat seuraavat: forward primer ATTATGCGAGGATTGGAA; reverse primer, CCCATCTCTTCATGACATCT.
In Situ Hybridization.
riboprobe-synteesin malli saatiin PCR: llä käyttämällä hiiren PDE8A-sekvenssiä sisältävää plasmidia., Erityisesti 3 alue hiiren PDE8A (eksonien 17-20) oli täydennetty käyttämällä seuraavia alukkeita: eteenpäin pohjamaali, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (alleviivattu T3 fagin RNA-polymeraasi promoottori järjestyksessä); reverse primer, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (alleviivattu T7 faagin RNA-polymeraasi promoottori järjestyksessä). PCR-tuotteet eristettiin agarose-geeleistä ja puhdistettiin geelin Uuttopakkauksella (Qiagen, Valencia, CA)., 35S-merkitty riboprobes oli syntetisoida in vitro-transkriptio, jossa MAXIscript T3/T7 kit (Ambion, Austin, TX), ja käyttämällä mallina PCR-tuote, joka sisältää T3-ja T7 faagin RNA-polymeraasi promoottori sivustoja. In vitro-transkriptio suoritettiin 20 µl reaktio seos, joka sisältää 5 µl UTP (tuotteiden loppuasiakasmyynti, Boston, MA) ja T3 RNA-polymeraasi tai T7 RNA-polymeraasi saada järkeä tai antisense riboprobe, vastaavasti.
Kivekset leikattiin villi-tyyppi ja PDE8A KO hiiret ja olivat nopeasti jäädytetään Tissue-Tek O. C. T. yhdiste (Sakura, Torrence, CA) on kuiva jäätä., Osat (20 µm) leikattiin kryostaattiin, joka oli asennettu Superfrostiin ja mikroslidiin (VWR Scientific, West Chester, PA) ja ilmakuivattiin. Osiot olivat kiinteä 4% paraformaldehydi 15 min huoneenlämmössä, käsitelty 0.25% etikkahappoanhydridi 0,1 M trietanoliamiini (pH 8.0) 10 min, ja kuivattu kautta arvostellaan etanoli-sarja (30, 60, 80, 95, 100%). Osat olivat sitten inkuboitiin hybridisaatio puskuri kosteassa kammiossa 60°C: ssa 4 h. Huuhtelun jälkeen 2× SSC (standard suolaliuosta sitraatti; 1× SSC = 0,15 M nacl/0.015 M natrium-sitraatti, pH 7.,2), osat olivat nestehukkaa läpi luokitellun etanolisarjan. Hybridisaatio suoritettiin puskuri sisältää 35S-merkitty antisense tai tunne-anturi (40 pg/34,000–38,000 cpm per µl) alle muovi coverslips kosteassa kammiossa 60°C: ssa yön yli. Se coverslips olivat varovasti pois, ja osat pestiin 2× SSC sisältää 10 mM DTT 30 min kahdesti 60°C. osiot olivat sitten inkuboitiin 30 min 37°C: ssa 20 µg/ml RNaseA 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5), ja 1 mM EDTA: ta, sitten pestään 50% formamidia, 2× SSC sisältää 10 mM DTT 30 min 60°C, 1× SSC sisältää 10 mM DTT 30 min 60°C, ja edelleen 0,1× SSC sisältää 10 mM DTT 30 min 60°C. Lopuksi osat oli kuivattu etanoliin (70, 95 ja 100%), kuivataan ilmassa, ja altistuvat BioMax XAR-elokuva (Eastman Kodak, Rochester, NY) 9 s. Nähdä solun jakautuminen PDE8A mRNA hybridisaatio, diat olivat päällystetty Autoradiografia NTB emulsio (Eastman Kodak) ja alttiina 1 viikko 4°C., Liukumäet kehitettiin, korjattiin ja asennettiin hematoksyliinilla ja asennettiin Canada balsamiin (Sigma-Aldrich).
Pde8a Immunoprecipitation and Assay.
Hiiri sperma oli eristetty cauda lisäkivesten, jonka uida-out-menetelmä (38) ja homogenoitu PBS, jossa 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM para-amino benzamidine, ja Sigma-proteaasin estäjä seos (Sigma-Aldrich)., Se homogenaattia oli sentrifugoidaan 5 min 16000 x g microcentrifuge ja 200 µl näytettä, supernatantti, joka vastaa 106 sperma, olivat inkuboitiin yön yli 20 µl 1:1 liete proteiinia G-agaroosia helmiä (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) pde8a-vasta-aineen läsnä ollessa tai puuttuessa (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Seuraavana päivänä, immunoprecipitate pestiin kolme kertaa PBS: llä ja sitten arvioidaan for PDE toimintaa, kun läsnä on 10 nM-leiri alustan, 40 mM Mops (pH 7.5), 15 mM: n Mg-asetaatti, 2 mM EGTA, ja 0,2 mg/ml BSA kuten ref. 39.,
Immunohistotokemia.
Juuri jäätynyt hiiri kivekset olivat upotettu Tissue-Tek O. C. T. yhdiste, ja sitten leikattu on kryostaatti 20 µm per siivu. Kudosleikkeiden tai eristetty Leydigin solut olivat kuivattu ja korjattu 4% (wt/vol) paraformaldehydi/PBS-puskuriin (pH 7.4) huoneenlämmössä 10 min ja pestään kolmeen kertaan PBS: llä. Liukumäkiä preincuboitiin estopuskurilla (5% donkey serum, 1 mg/ml BSA ja 0.,1% Triton X-100 PBS: ssä) 1 h huoneenlämmössä, inkuboidaan anti-PDE8A vasta-aine (200 µl 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) PBS, jossa 1% aasin seerumia, 1 mg/ml BSA, ja 0,1% Triton X-100 yön yli 4°C, pestään PBS, joka sisältää 0.05% Tween 20: tä kolme kertaa 20 min, inkuboidaan kanssa donkey anti-goat Alexa546 (200 µl 1:500; Invitrogen) PBS, jotka sisältävät 1 mg/ml BSA ja 0,1% Triton X-100: 2 h huoneenlämmössä ja pestiin., Diat olivat edelleen inkuboitiin esto-puskuria, joka sisälsi 5% vuohen seerumi 1 h huoneenlämmössä, inkuboidaan sytokromi P450-side chain cleavage-entsyymi (CYP11A) aine (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) yön yli 4°C, pestään PBS, joka sisältää 0.05% Tween 20: tä kolme kertaa 20 min, ja inkuboitiin vuohen anti-kani Alexa488 (1:500; Invitrogen) kuten edellä. Osat olivat nyt counterstained kanssa-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) PBS 5 min, pesty ja asennettu SlowFade Kultaa antifade-reagenssia (Invitrogen)., Testata PDE8A vasta-aineiden spesifisyys vasta-aine, liuosta esi-inkuboitiin 2,5 µg/ml antigeeni peptidi (Santa Cruz Biotechnology) 2 h huoneenlämmössä ennen värjäystä. Jotkin osat inkuboitiin ilman ensisijaisia vasta-aineita toissijaisten vasta-aineiden aiheuttaman taustan määrittämiseksi. Immunostiiviset signaalit visualisoitiin konfokaalimikroskoopilla (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). β-galaktosidaasi-aktiivisuus, ilmaistaan nuclear localization signal, jonka Bensley geeni kohdistaminen kasetti, arvioitiin X-gal-värjäyksellä., Osiot olivat ensimmäinen inkuboitiin anti-CYP11A vasta jälkeen anti-rabbit alkalinen fosfataasi-konjugaattia (1:500; Invitrogen) ja NBT/BCIP (Roche) väri kehitystä. Tämän jälkeen X-gal-värjäys tehtiin kuvatulla tavalla (40) X-Gal-seoksessa 37°C: ssa yön yli. Osat pestiin ja asennettiin glyseroli / Tris-puskuroidulla suolaliuoksella.
Leydigin solujen Puhdistus.
Leydig-solut eristettiin ref: ssä kuvatulla tavalla. 41. Lyhyesti, kivekset aikuisten hiiret olivat decapsulated ja dispergoitu vesihauderavistin 34°C 10 min 10 ml Medium 199 (M-199) 0.,25 mg/ml-kollagenaasia D, 35 mU/ml Dispase II, ja 6 µg/ml DNase I lopettaa kudoksen hajonta, 40 ml 1% BSA M-199 media, jossa on 15 mM Hepes, 4 mM natriumbikarbonaattia, ja 25 µg/ml soijapavun trypsiini-inhibiittori lisättiin laimentaa alkuperäinen jousitus. Tämän jälkeen putkia rajattiin ja käännettiin useita kertoja. Siementiehyiden annettiin asettua painovoiman avulla, ja interstitiaalisoluja sisältävä supernatantti kerättiin talteen. Toimenpide toistettiin kaksi kertaa, jotta interstitiaalisoluja saatiin lisää., Solut pelletoitiin 50 ml: n putkiin sentrifugoimalla 800 × g, 20 min, 4°C: ssa ja sitten fraktioidut käyttämällä jatkuva Percoll (GE Healthcare, Piscataway, NJ) kaltevuus (55% Percoll vuonna hankin puskuroitu suolaliuos, hbss puskurissa 15 mM Hepes ja 25 µg/ml soijapavun trypsiini-inhibiittori) yhteensä tilavuus 35 ml. Liukuvärit oli muodostettu in situ sentrifugoimalla ne NY-20 kiinteä kulma roottorilla (Beckman Coulter, Fullerton, CA) 23,700 x g, 30 min, 4°C. sisältävän putken tiheys merkki helmiä (GE Healthcare) käytettiin referenssinä tunnistaa eri tiheys kerrokset., Leydig-solut saatiin talteen tiheydestä 1,07 g/ml alkaen gradientin pohjalle. Viisi määriä hankin puskuroitu suolaliuos, hbss lisättiin laimentaa Percoll, ja solut pelletoitiin 200 × g 10 min 4°C: lopullinen pelletti saatu kaksi kivekset, rikastettu Leydigin soluja, oli sekoitettava uudelleen 4 ml DMEM/F-12 täydentää 1% BSA ja käyttää välittömästi kokeissa.
3β-Hydoksisteroididehydrogenaasimääritys.
testosteronin tuotannon mittaaminen.
Leydigin solut suspendoidaan uudelleen kuten edellä ja 100 µl näytettä olivat annostellaan 96-kuoppalevyillä., Soluja stimuloitiin 150-µl lopullinen tilavuus ilmoitettu pitoisuudet yhdistelmä LH 3 h 5% CO2-inkubaattorissa 37°C: Rekombinantti ihmisen LH oli saatu Kansallinen Hormoni & Peptidi-Ohjelma (A. F. Parlow, Torrance, CA). Testosteroni päästetään media päällekkäisiä solun näytteitä kunkin LH-pitoisuus mitattiin käyttämällä immunoenzymatic assay kit Neogen (Lexington, KY).
kaikki tiedot ilmaistaan keskiarvona ± SD., EC50-arvot LH toimintaa testosteronin tuotanto on laskettu epälineaarinen sovitus LH pitoisuus-riippuvuus käyrät saadaan kunkin Leydigin solujen valmistelu käyttämällä ohjelmisto (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). Tilastollinen analyysi tehtiin opiskelijan t-testillä. Eroja pidettiin merkittävinä p < 0, 05.