Madame Lelica

hay cuatro familias de complejos proteolíticos intracelulares ubicuos en eubacteria: Lon, HslUV (ClpQY), ClpXP y FtsH. Además de estos cinco, Htra (DegP) es un complejo proteolítico periplásmico/secretado, mientras que el proteasoma procariótico se encuentra solo en los actinomicetos. La estructura, función y papel en la patogénesis de cada proteasa ha sido revisada previamente.,13, 17 varios de estos complejos han sido investigados como potenciales dianas antibacterianas, incluyendo Lon,18 ClpXP,19 HtrA20 y el proteasoma.21 de estos, ClpXP ha sido investigado más ampliamente y es el único complejo para el que se han encontrado inhibidores de productos naturales hasta el momento.

el complejo proteolítico clp

Los ClpPs están bien conservados en la mayoría de las especies bacterianas y tienen un papel importante en el recambio de proteínas., Además de la homeostasis de proteínas y la degradación de proteínas mal plegadas, el ClpP también está involucrado en numerosos procesos regulatorios al dirigirse a los reguladores transcripcionales y remodelar el proteoma.22, 23, 24, 25 de hecho, se ha encontrado que el ClpP tiene un papel clave en la regulación de procesos como la división celular, la tolerancia al estrés, la virulencia, la diferenciación morfológica y la resistencia a los antibióticos.22, 23, 24 El papel del ClpP en estos procesos se basa en su estricta selección de sustratos proteicos, lo que logra restringiendo el acceso a sus sitios catalíticos., Cada complejo ClpP se forma apilando dos anillos heptaméricos para crear un tetradecámero (Figura 2).26 El canal que se forma alberga 14 sitios catalíticos de serina proteasa a los que no se puede acceder sin pasar por las aberturas axiales. Además, apo-ClpP adopta una conformación inactiva y comprimida en la que su tríada catalítica está desalineada.27 controlando la activación conformacional y el acceso a las aberturas axiales están las proteínas HSP100 de la superfamilia AAA + de Atpasas: ClpA o ClpX en bacterias gramnegativas y ClpC o ClpX en gram positivos., Estas Atpasas accesorias forman anillos hexaméricos que unen las caras axiales del tetradecámero utilizando motivos tripéptidos (L / I) GF que caben en bolsillos hidrofóbicos.28 La Unión en esta bolsa hidrofóbica regula la actividad del ClpP de dos maneras: primero, estabilizando el complejo en una conformación activa y extendida con la tríada catalítica alineada y, segundo, a través del despliegue del sustrato proteico., Las Atpasas AAA + interactúan con las dianas proteicas, ya sea directamente o a través de una proteína adaptadora cooperante, y utilizan la energía proporcionada por el ATP para desplegar el sustrato y alimentarlo en el poro central donde se hidroliza de manera independiente de la energía. Como las proteínas plegadas son demasiado grandes para entrar en el canal, estos socios AAA+ regulan estrechamente Qué sustratos de proteínas son objetivo para la degredación.28

La mayoría de las especies bacterianas, incluyendo E. coli, Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus, tienen un gen clpP que, junto con sus Atpasas AAA+ asociadas, no son esenciales para la viabilidad celular.25, 29, 30, 31, 32 Sin embargo, se ha observado que la deleción de clpP en estas especies aumenta su susceptibilidad a antibióticos como linezolid y rifampicina, y disminuye la virulencia en patógenos como Listeria monocytogenes y S. aureus.,23, 33 la pérdida de virulencia en cepas deficientes de ClpXP se ha relacionado con perturbaciones importantes en los niveles de factores transcripcionales de virulencia global, como la red reguladora sar/agr en S. aureus.23 curiosamente, el efecto de la inactivación de ClpP en varios de estos reguladores de virulencia parece ser dependiente de la cepa y, además, algunas cepas de S. aureus deficientes en la función de ClpXP parecen tener una susceptibilidad disminuida a vancomicina, daptomicina y antibióticos β-lactámicos.,34, 35, 36

en contraste con la mayoría de las bacterias, dos o más copias de clpP se encuentran en actinobacterias y cianobacterias y al menos una copia funcional es esencial para la viabilidad.37, 38 en Mycobacterium tuberculosis, clpP1 y clpP2 forman un operón y ambos genes son esenciales. Estas isoformas trabajan juntas para crear una proteasa funcional apilando homoheptámeros ClpP1 y ClpP2 en un heterotetradecámero.37, 39 de las cuatro Atpasas AAA + en M. tuberculosis, ClpX y ClpC1 son esenciales para la viabilidad.,40, 41

dado su papel en la viabilidad celular y la virulencia, el sistema ClpP es un objetivo prometedor para nuevos antibacterianos con tres posibles mecanismos de desregulación (Figura 2): inhibición de la proteólisis de ClpP, activación de la proteólisis de ClpP o perturbación de las Atpasas asociadas AAA+.

inhibidores de ClpP

quizás el enfoque más obvio para atacar el sistema ClpP es desarrollar un inhibidor de sitio activo de ClpP. La prueba de principio de este modo de acción se ha demostrado en S. aureus, Streptococcus pneumoniae y L., monocytogenes, donde los knockouts de clpP son incapaces de causar abscesos de la infección de la piel, infecciones pulmonares o parasitismo in vivo de los macrófagos, respectivamente.22, 42, 43 esta pérdida de virulencia se ha asociado con una disminución de la actividad de proteasas extracelulares, lipasas, Dnasas y α-hemolisina en S. aureus, y α-listerolisina y fosfolipasa listerial en L. monocytogenes.

los esfuerzos pioneros de Böttcher y Sieber44 para atacar el ClpP llevaron al desarrollo de una serie de inhibidores de β-lactona., Inspirados por la reactividad de Las β-lactonas que se encuentran en la naturaleza, sintetizaron una biblioteca de derivados marcados con alquino (por ejemplo, lactona D3; figura 3a), que se examinaron contra varios proteomas bacterianos. Click chemistry on the alkyne tag was used to attach a fluorophore and allow for the identification of reactive enzymes. De esta manera, el ClpP fue identificado como un objetivo altamente específico que forma un aducto covalente entre su sitio activo Ser98 y la β-lactona, inhibiendo así irreversiblemente la actividad proteolítica (figura 3b).,La caracterización posterior demostró la capacidad de Las β-lactonas para reducir la actividad del factor de virulencia, incluyendo α-hemolisina y listerolisina, en S. aureus y L. Monocytogenes, respectivamente.Esta reducción de los factores de virulencia se correlacionó con la capacidad de los armazones optimizados de β-lactona (U1; figura 3a) para reducir significativamente la infección por S. aureus después de la administración subcutánea en un modelo de absceso cutáneo y el crecimiento de L. monocytogenes en macrófagos.46, 47 además, los derivados de β-lactona (compuesto 7; Figura 3a) se encontraron entre el grupo privilegiado de compuestos capaces de entrar en M., tuberculosis con el fin de inhibir eficazmente el crecimiento con una CMI de 28 µg ml−1.48 en última instancia, sin embargo, baja estabilidad plasmática debido a la rápida hidrólisis del éster cíclico que impide el desarrollo clínico posterior.

Más recientemente, Sieber y collages49 han descubierto una nueva clase de inhibidores potentes de ClpP, los ésteres fenílicos (AV170; figura 3a). Descubiertos usando una pantalla imparcial de 137 000 compuestos sintéticos en un ensayo fluorogénico para la actividad de ClpP, los ésteres fenílicos actúan por la misma modificación covalente de Ser98 que las β-lactonas., Curiosamente, algunos enantiómeros también son capaces de desencadenar la desoligomerización del tetradecámero de ClpP en heptámeros, un modo de acción favorable dado que el control conformacional de la tríada catalítica de serina la inactiva en forma heptamérica de ClpP. A pesar de la potencia mejorada de los ésteres fenil de inhibición de la proteasa sobre Las β-lactonas, su actividad antivirulente se reduce, ya que solo son capaces de disminuir y no abolir la producción de α-hemolisina (figura 3c). Los esfuerzos para aumentar la potencia revelaron un equilibrio entre la estabilidad y la reactividad.,49

aunque la inhibición de ClpP muestra promesa como mecanismo de acción, es claramente necesario un mayor desarrollo y descubrimiento de nuevos andamios. Además, dada la evidencia reciente de resistencia a los medicamentos en ciertas cepas knockout de clpP,34, 36, Se puede justificar cierta precaución en este camino.

Activadores de ClpP

la activación del sistema de proteasa ClpP es una opción terapéutica particularmente intrigante. Un sello distintivo de las proteasas intracelulares es la estricta regulación de la actividad para evitar la degradación de la proteína diana. En los eucariotas, esto se logra a menudo por compartimentación en orgánulos., En contraste, las bacterias han desarrollado complejos de proteínas reguladoras apretadas para controlar la actividad de la proteasa. Al activar la actividad proteolítica para degradar indiscriminadamente las proteínas, un medicamento podría causar muerte celular no solo en aquellas especies donde el ClpP es esencial, sino también en aquellas donde el ClpP es prescindible. Las mutaciones que suprimen la actividad del ClpP, aunque teóricamente confieren resistencia, serían fatales en células donde el ClpP es esencial y afectarían la virulencia en células donde el ClpP es prescindible., Finalmente, el modo de acción sin precedentes por activación en lugar de inhibición de su objetivo puede permitir que tal fármaco sea eficaz contra las células persistentes latentes.

la prueba fortuita del principio de este mecanismo único de la acción fue divulgada con el descubrimiento de acildepsipéptidos (ADEPs; figura 4a). Los ADEPs fueron descritos por primera vez en una patente en 1985 como el ‘complejo A54556’, un grupo de ocho compuestos estrechamente relacionados producidos por Streptomyces hawaiiensis NRRL15010.50 ClpP fue identificado como el objetivo molecular de ADEP en 2005 cuando Brötz-oesterhelt et al.,51 aplicó genómica inversa a una cepa de E. coli resistente a ADEP para identificar el determinante de la resistencia como una mutación en ClpP que la vuelve inactiva. Este hallazgo sugiere que los ADEP activan el ClpP, causando una degradación inadecuada de la proteína. De hecho, estudios in vitro que midieron la escisión de péptidos fluorogénicos y análisis proteómicos in vivo confirmaron que B. subtilis clpp activado por ADEP fue capaz de degradar proteínas independientes de la regulación AAA+ o hidrólisis ATP.,51

La comprensión de esta pérdida de regulación ha sido proporcionada por las estructuras cristalinas de ClpP activado por ADEP de E. coli, B. subtilis, M. tuberculosis y Neisseria meningitidis (figura 4b).52, 53, 54, 55 una molécula ADEP se une a cada monómero en el tetradecámero ClpP en el mismo bolsillo hidrofóbico que es utilizado por las ATPASAS AAA+, inhibiendo así su interacción (figura 4d).,52, 55, 56 La Unión imita el control conformacional de la ATPasa del ClpP, induciendo la alineación de la tríada catalítica de serina y una rotación rígida del cuerpo de los monómeros del ClpP, ensanchando el poro axial de 10-12 Å a 20 Å en E. coli.27, 52, 55 un mecanismo de compuerta también es proporcionado por los dominios N-terminales, que se mueven de una conformación hacia abajo, o cerrada, a una conformación hacia arriba, o abierta en el enlace ADEP.,52, 55 la activación de ADEP no permite que las proteínas plegadas de forma estable se degraden, ya que todavía son demasiado grandes para entrar en el lumen axial de ClpP, pero sí permite que las proteínas inestables y las cadenas nacientes que emergen del ribosoma se degraden, especialmente si se doblan lentamente.57 se cree que la muerte celular es el resultado de esta degradación indiscriminada, así como la inhibición de la función normal de ClpP.

Los ADEP son activos contra una variedad de bacterias Gram-positivas, incluyendo S. aureus resistente a meticilina clínicamente relevante( MRSA), enterococos resistentes a vancomicina y s resistente a penicilina., pneumoniae, así como los patógenos gramnegativos N. meningitidis y Neisseria gonorrheae.Los derivados semisintéticos de ADEP son eficaces contra Enterococcus faecalis, S. aureus y S. pneumoniae en modelos de ratón y rata con actividad superior a linezolid51, y la actividad contra SARM en un modelo de periotinitis murina es superior a vancomicina.58 notablemente, la resistencia a los ADEPs se desarrolla a una frecuencia tan alta como 10-6 en estas especies bacterianas por mutaciones que disminuyen la función de ClpP, que no es esencial., Sin embargo, utilizando como ventaja la disminución de la aptitud de los mutantes clpP, se ha demostrado que las terapias combinadas de ADEP y rifampicina erradican completamente in vitro una población de SARM resistente a vancomicina.59

aún más prometedora es la capacidad de los ADEPs para eliminar las células persistentes.59 Conlon y otros59 describieron por primera vez esta propiedad cuando un ADEP mató de manera efectiva tanto la fase estacionaria de S. aureus como la persistente de S. aureus después del tratamiento con ciprofloxacina. Este hallazgo tiene implicaciones para el uso de ADEPs contra infecciones tuberculosas latentes causadas por M. tuberculosis persistente tolerante a fármacos., Hasta la fecha, la actividad frente a M. tuberculosis persisters no ha sido descrito, pero ADEPs han demostrado reducir el crecimiento de M. tuberculosis cuando se combina con dos inhibidores de la bomba de eflujo, reserpina y verapamilo.39

aunque los ADEP son pistas prometedoras para los candidatos a fármacos, tienen propiedades farmacológicas desfavorables que incluyen una pobre solubilidad en agua, un aclaramiento sistémico rápido e inestabilidad química.51, 60 tras el descubrimiento del modo de acción de ADEPs, Bayer AG lanzó un programa SAR de Química medicinal para desarrollar un derivado más estable y potente de ADEP., Este esfuerzo resultó en el desarrollo de ADEP4, un derivado muy potente de ADEP1 con tres modificaciones importantes: Phe es reemplazado por 3,5-difluorofenilalanina, que se cree que forma enlaces H con ClpP, el acil polieno es reemplazado por una cola hexenoil α,β-insaturada para mejorar la estabilidad y N-MeAla es reemplazado por pipecolato, lo que aumenta la rigidez de ADEP.60 la actividad de ADEP4 fue mejorada por Carney et al.61 reemplazando Ser con Allo-Thr y Pip con 4-MePip para endurecer aún más ADEP., Mediante la cuantificación de los tipos de cambio hidrógeno-deuterio utilizando la RMN de 1H, se demostró que la rigidificación de la molécula ADEP fortalecía los enlaces h transanulares, reduciendo así los costos entrópicos de la unión al ClpP. El derivado de ADEP de Carney tiene una potencia 600-1200 veces mayor que el ADEP1 contra patógenos grampositivos.61

a pesar de la mayor potencia de estos derivados del ADEP, todavía tienen una actividad limitada contra bacterias gramnegativas y se eliminan eficientemente de la célula por eflujo activo, especialmente en M. tuberculosis.,39, 62 muchos otros esfuerzos de química sintética han explorado motivos para superar estas limitaciones, pero la mayoría han resultado en una disminución de la actividad (figura 4c).54, 63, 64, 65, 66, 67 dada la unión íntima del ADEP en su bolsillo hidrofóbico, este resultado es quizás predecible y sugiere que la modificación en el andamio del ADEP puede haber llegado a un callejón sin salida.

Se han montado dos pantallas de alto rendimiento para identificar nuevos Activadores de ClpP.65, 68 ambos identificaron Activadores de moléculas pequeñas de E., coli ClpP mediante el uso de un ensayo in vitro que mide los aumentos de fluorescencia causados por la escisión del isotiocianato de fluoresceína–caseína, un sustrato modelo para ClpP. En la primera, Leung et al.65 se examinaron 60 000 sustancias químicas sintéticas similares a las drogas, identificando cinco compuestos denominados ACP1–5 (Figura 4a). El más activo de estos compuestos fue 10-20 veces menos potente que el ADEP1 en la activación de ClpP y solo mostró actividad antibacteriana modesta incluso en presencia de agentes permeabilizantes. Lavey et al.,En su lugar, se examinaron > 20 450 extractos o metabolitos de hongos y bacterias e identificaron un solo activador de ClpP, la esclerotiamida (figura 4a). Esta indolinona relacionada con la paraherquamida fue 73 veces menos potente que la ADEP1 en la activación de EcClpP y no logró inhibir el crecimiento de E. coli o Pseudomonas aeruginosa con deficiencia de eflujo.

a pesar de la limitada eficacia de los ACPs y la esclerotiamida, estos estudios proporcionan nuevos andamios para la derivatización y abren la puerta a estudios futuros para identificar Activadores de ClpP., Uno podría imaginar, por ejemplo, la identificación de sitios de enlace de activación alternativos en ClpP. La regulación del ClpP implica no solo el control de la entrada de sustrato mediante el ensanchamiento de los poros tras la Asociación de la ATPasa AAA+, sino también la formación del sitio catalítico de la serina a través de la oligomerización en tetradecámeros.69 tal vez una pequeña molécula que indujo la formación de un sitio activo mientras mantenía el ClpP como heptámero podría permitir un fácil acceso a este sitio activo por sustratos indiscriminados.,

desenganchadores de ATPasa AAA+ como tratamiento

como ClpP se basa en ATPASAS AAA+ para seleccionar y desplegar sustratos proteicos, la perturbación de estos socios también puede desregular el sistema proteolítico ClpP. En particular, esto es cierto en M. tuberculosis, donde las Atpasas ClpC1 y ClpX son esenciales para la viabilidad celular.40, 41 de hecho, cada uno de los tres compuestos dirigidos a ClpC1 caracterizados hasta la fecha fueron descubiertos mediante la detección de extractos de productos naturales para la actividad anti-M. tuberculosis., El primero de ellos en ser descubierto es ciclomarina a (cymA), un heptapéptido cíclico producido por la bacteria Marina Streptomyces sp. CNB-982 (figura 5a).70 aunque fue descrito en 1999 como un potente agente antiinflamatorio con citotoxicidad contra las células cancerosas, no fue hasta 2011 que se descubrió la actividad contra M. tuberculosis durante un cribado de células enteras de producto natural.71 en un primer intento de identificar el objetivo molecular de cymA, se tomó un enfoque de genómica inversa. Sin embargo, después de no espontánea resistente M., los mutantes de la tuberculosis podrían ser recuperados, la cromatografía de afinidad fue utilizada en su lugar para mostrar que cymA se dirige a ClpC1 con alta especificidad. La posterior Co-cristalización de la cymA con el dominio N-terminal de ClpC1 identificó residuos importantes para la Unión y, a pesar de la incapacidad de generar mutantes resistentes espontáneos, permitió la creación de mutantes ClpC1 que confieren resistencia a la cymA.72

En 2014, ecumicin, un macrocíclicos tridecapeptide de Nonomuraea sp., MJM5123, 73 y lassomicina, un lasso-péptido de 16 miembros de Lentzea kentuckyensis sp., 74 se aislaron mediante cribado de extractos crudos de actinomicetos (figura 5a). El dominio N-terminal de ClpC1 fue identificado como el objetivo molecular de estos compuestos por genómica inversa en mutantes resistentes espontáneos. A pesar de que la cymA, la ecumicina y la lassomicina comparten un objetivo común, la caracterización estructural y la posición de las mutaciones que confieren resistencia a cada compuesto sugieren que cada uno se une en una posición ligeramente diferente en el dominio N-terminal de ClpC1 (figura 5b)., Por ejemplo, en contraste con cymA y ecumicin, la lassomicina es altamente básica, contiene varios residuos de Arg, y se acopla en una región altamente ácida de ClpC1.74

CymA, ecumicin y lassomicina son bactericidas contra la replicación de M. tuberculosis, una gama de otras especies de micobacterias y M. tuberculosis multirresistente. Es importante destacar, que también son activos contra replican M. tuberculosis. Consistente con la falta de esencialidad de las ATPASAS AAA+, cada una carece de actividad contra otras especies Gram-positivas y Gram-negativas como S. aureus y P. aeruginosa., Esta especificidad tiene beneficios, ya que también carecen de actividad contra los miembros comensales de la microbiota humana.

para causar la muerte celular en M. tuberculosis, la ecumicina y la lassomicina parecen estimular la actividad de la ATPasa, pero desacoplarla de la degradación de las proteínas.73, 74 de esta manera, la degradación de los sustratos naturales se inhibe y conduce a su acumulación y toxicidad, similar a las acciones de los inhibidores y activadores de ClpP en M. tuberculosis., A diferencia de la ecumicina y la lassomicina, se ha sugerido que la cymA aumenta la degradación de las proteínas, como lo demuestra una disminución de la fluorescencia de la proteína verde fluorescente etiquetada con tripéptido de LeuAspAsp dirigida a ClpC1 en la incubación con cymA.71 sin embargo, es posible que esta disminución en la fluorescencia sea el resultado del despliegue de la proteína fluorescente verde por ClpC1 en lugar de la degradación y por lo tanto la cymA puede tener el mismo mecanismo de desacoplamiento que la ecumicina y la lassomicina., Varias preguntas permanecen sin respuesta sobre el mecanismo de acción de estos fármacos, incluyendo sus efectos sobre el despliegue de proteínas y cómo se estimula la actividad de la ATPasa y se inhibe la proteólisis, por ejemplo, inhibiendo la interacción con ClpP1P2. Además, todavía se está realizando la caracterización de otro inhibidor de ClpC1 recientemente descubierto, el análogo de rufomicina RUF-I. 75

A pesar de la potencia relativamente alta de cymA, ecumicina y lassomicina contra M. tuberculosis, se requiere la optimización de las propiedades farmacológicas., Por ejemplo, cymA exhibe aclaramiento hepático y una vida media corta en ratones, y ecumicin tiene solubilidad limitada y mala absorción intestinal.13, 73 las síntesis totales recientes y la optimización de la fermentación pueden ayudar en estos desarrollos.76, 77, 78

aunque los medicamentos dirigidos a ClpC1 son una posibilidad intrigante para la terapéutica anti-M. tuberculosis, generalmente no tienen actividad bactericida contra otras especies que no sean actinobacterias., En estas especies donde el ClpP y las ATPASAS AAA + asociadas son prescindibles, es posible que el objetivo de estas Atpasas tenga efectos antivirulentes similares a los observados con los inhibidores del ClpP. Sin embargo, tal compuesto probablemente tendría que ser capaz de apuntar a múltiples socios de ATPasa para tener un efecto tan generalizado como la acción directa sobre ClpP. Estos posibles efectos antivirulentes no han sido investigados para cymA, lassomicina o ecumicina.,

El logro de la especificidad

de los complejos proteolíticos bacterianos, todos excepto HslUV tiene un ortólogo humano y muchos son de hecho intensamente estudiados como blancos anticancerígenos potenciales. Por ejemplo, las proteasas mitocondriales LONP1, ClpXP y M-AAA (FtsH homólogo) tienen papeles importantes en el control de calidad en las mitocondrias, especialmente durante el estrés respiratorio.79 mutaciones en M-AAA también están implicadas en la paraplejia espástica, una enfermedad neurodegenerativa hereditaria.80 como tal, es vital que los agentes antimicrobianos puedan dirigirse específicamente a su homólogo bacteriano.,

en el caso de los inhibidores de la proteasa que pretenden actuar como sustratos suicidas, lograr la especificidad puede ser un desafío, debido a los mecanismos catalíticos conservados. De hecho, se ha encontrado una falta de especificidad en los esfuerzos para desarrollar inhibidores tanto del proteasoma procariótico como de la proteasa bacteriana. El proteasoma procariótico en M. tuberculosis es un objetivo prometedor para la inhibición, ya que es prescindible para el crecimiento in vitro, pero es esencial para la supervivencia del estrés de óxido nítrico81 y la persistencia en ratones.,62, 82 se han hecho muchos intentos para desarrollar un fármaco contra el proteasoma micobacteriano, generalmente como peptidil epoxiquetonas, aldehídos o boronatos, pero la mayoría inhiben el proteasoma de mamíferos con más potencia que el de M. tuberculosis.83 sin embargo, la selectividad no es inédita, como lo demuestra el descubrimiento de los compuestos de oxatiazol-2-one GL5 y HT1171 (Figura 6). Estos compuestos son bactericidas contra de no repetición M., tuberculosis tratada con niveles subinhibitorios de óxido nítrico21 y con > 1000 veces mayor actividad frente a micobacterias sobre proteasomas humanos. Se cree que la especificidad es conferida por la interacción del fármaco con residuos fuera del sitio activo no conservados en proteasomas de mamíferos.21

LON también es un objetivo prometedor, ya que se ha implicado en la formación de biopelículas, la motilidad y la tolerancia al estrés, y se ha demostrado que los mutantes han reducido la colonización y la virulencia en Salmonella enterica serovar Typhimurium, Actinobacillus pleuropneuoniae, Vibrio cholera y P. aeruginosa.84, 85, 86, 87 en el único esfuerzo realizado hasta la fecha para identificar los inhibidores bacterianos de la ON, los inhibidores del proteasoma se evaluaron in vitro y se identificó el boronato de peptidilo MG262.,18 Sin embargo, este compuesto es todavía 2000 veces más potente contra el proteasoma 20S.18 Al igual que con los compuestos de oxatiazol-2-one, es probable que sea necesario aprovechar los residuos divergentes en los homólogos humanos para desarrollar un inhibidor altamente específico.

La especificidad también se puede lograr moviéndose fuera del sitio activo catalítico a sitios de unión que perturban la función de la proteasa, pero están mal conservados entre los ortólogos humanos y bacterianos. Los ADEPs demuestran acertadamente el potencial de este enfoque., Aunque no se han probado directamente en clpp humano (hClpP), los ADEP no son tóxicos para las células humanas hasta 25 µg ml-1, lo que sugiere que tienen poca afinidad, si la hay, por la enzima humana.58 la comparación estructural de E. coli (EcClpP) y hClpP apoya esta noción. Su estructura de la columna vertebral se conserva en gran medida, con una desviación cuadrada media de la raíz de 0.,63 Å; 88 sin embargo, la inspección de la bolsa hidrofóbica utilizada para la Unión ADEP muestra que hClpP tiene varias sustituciones que reducen su hidrofobicidad (Asn55Pro, His60Tyr e His112Phe) junto con una inversión de carga (Glu56Lys) en la porción distal de la ranura de acoplamiento. Es muy posible que estos cambios eviten el enlace ADEP en hClpP. Cabe señalar, sin embargo, que EcClpX, aunque no EcClpA, puede activar hClpP.88 en cualquier caso, la búsqueda de fármacos que unan sitios reguladores menos conservados puede ser la clave para encontrar antibacterianos altamente específicos.