materiales y métodos
ratones.
se obtuvieron ratones C57BL/6 silvestres de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Los ratones PDE8A KO fueron producidos inicialmente por Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) bajo contrato con Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Reino Unido). Posteriormente fueron criados en ratones C57BL / 6 en la Universidad de Washington durante 10 generaciones. Para los experimentos reportados, se utilizaron ratones de entre 6 y 8 semanas de edad., Todos los procedimientos utilizados fueron aprobados por el Comité Institucional de cuidado y uso de animales (Iacuc) de la Universidad de Washington, de acuerdo con la Guía de los Institutos Nacionales de salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
PCR en tiempo Real.
Testis cDNA was prepared from Total RNA from wild-type and PDE8A-null mouse testis by using SuperScript III and Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA). La PCR en tiempo Real se realizó utilizando Power SYBR Green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Los cebadores (IDT, Coralville, IA) para PDE8A, dirigidos al área aguas abajo del casete objetivo, fueron los siguientes: cebador delantero, GCCACAGAAATGACGAAGC (exón 19); cebador inverso, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exón 20). Los cebadores para la hipoxantina-guanina fosforribosiltransferasa fueron los siguientes: cebador delantero ATTATGCCGAGGATTTGGAA; cebador inverso, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
hibridación in Situ.
la plantilla para la síntesis de riboprobe se obtuvo por PCR utilizando un plásmido que contiene la secuencia PDE8A de ratón., En particular, la Región 3′ de la PDE8A del ratón (exones 17-20) se amplificó utilizando los siguientes cebadores: cebador delantero, AATTAACCCTCACTAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (secuencia subrayada del promotor de la polimerasa del ARN del fago T3); cebador inverso, TAATACGACTCACTATAGGGACACGTCGGCACACTTAAT (secuencia subrayada del promotor de la polimerasa del ARN del fago T7). Los productos PCR se aislaron de geles de agarosa y se purificaron con un kit de extracción de Gel (Qiagen, Valencia, CA)., Las ribosondas etiquetadas con 35S se sintetizaron mediante transcripción in vitro con un kit MAXIscript T3 / T7 (Ambion, Austin, TX) utilizando como plantilla el producto PCR que contiene sitios promotores de ARN polimerasa de fago T3 y T7. La transcripción In vitro se realizó en una mezcla de reacción de 20 µl que contenía 5 µl de UTP (PerkinElmer, Boston, MA) y la ARN polimerasa T3 o la ARN polimerasa T7 para obtener la riboprobe sense o antisentido, respectivamente.
Los testículos se diseccionaron de ratones KO de tipo silvestre y PDE8A y se congelaron rápidamente en el compuesto Tissue-Tek O. C. T. (Sakura, Torrence, CA) en hielo seco., Las secciones (20 µm) se cortaron en un criostato, se montaron en un Superfrost más microslide (VWR Scientific, West Chester, PA) y se secaron al aire. Las secciones se fijaron en paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente, se trataron con anhídrido acético al 0,25% en trietanolamina a 0,1 M (pH 8,0) durante 10 min y se deshidrataron mediante una serie de etanol graduada (30, 60, 80, 95 y 100%). Las secciones se incubaron con tampón de hibridación en una cámara húmeda a 60°C durante 4 h. después del enjuague en 2 × SSC (citrato salino estándar; 1× SSC = 0.15 m cloruro de sodio / 0.015 M citrato de sodio, pH 7.,2), las secciones se deshidrataron a través de una serie de etanol Clasificado. La hibridación se realizó en un tampón que contenía una sonda antisentido o sensora etiquetada con 35S (40 pg/34,000-38,000 cpm por µl) bajo cubreobjetos de plástico en una cámara húmeda a 60°C durante la noche. Los cubreobjetos se retiraron suavemente y las secciones se lavaron con 2 × SSC conteniendo 10 mM TDT durante 30 min dos veces a 60°C. Las secciones se incubaron durante 30 min a 37 ° C con 20 µg/ml RNaseA en NaCl de 0,5 m, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5), y EDTA de 1 mM, luego se lavó en formamida al 50%, 2× SSC que contiene 10 mM TDT durante 30 min a 60°C, En 1× SSC que contiene 10 mM TDT durante 30 min a 60°C, y además en 0,1× SSC que contiene 10 mM TDT durante 30 min a 60°C. finalmente, las secciones se deshidrataron en etanol (70, 95 y 100%), se secaron al aire y se expusieron en película BioMax XAR (Eastman Kodak, Rochester, NY) durante 9 h. para ver la distribución celular de la hibridación de ARNm pde8a, los portaobjetos fueron recubiertos con emulsión autorradiográfica NTB (Eastman Kodak) y expuestos durante 1 semana a 4°C., Los portaobjetos se desarrollaron, fijaron y contragolparon con hematoxilina y se montaron en bálsamo de Canadá (Sigma-Aldrich).
inmunoprecipitación y ensayo de PDE8A.
se aislaron espermatozoides de ratón de la cola del epidídimo mediante un método swim-out (38) y se homogeneizaron en PBS que contenían Nonidet al 1% (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), EGTA de 1 mM, TDT de 20 mM, PMSF de 0,2 mM, para-amino benzamidina de 1 mM y una mezcla de inhibidores de proteasa Sigma (Sigma-Aldrich)., El homogeneizado fue centrifugado durante 5 min a 16.000 × g en una microcentrífuga y 200-µl alícuotas del sobrenadante, equivalentes a 106 espermatozoides, fueron incubadas durante la noche con 20 µl de una suspensión 1: 1 de perlas de proteína G-agarosa (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA) en presencia o ausencia de anticuerpo PDE8A (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Al día siguiente, el inmunoprecipitado se lavó tres veces con PBS y luego se analizó la actividad de PDE en presencia de sustrato cAMP de 10 nM, mopas de 40 mM (pH 7,5), acetato de 15 mM Mg, EGTA de 2 mM y ASC de 0,2 mg/ml como en el ref. 39.,
Inmunohistotoquímica.
Los testículos de ratón recién congelados se incrustaron en el compuesto Tissue-Tek O. C. T. y luego se seccionaron en un criostato a 20 µm por rebanada. Se secaron secciones de tejido o células de Leydig aisladas y se fijaron en paraformaldehído/PBS al 4% (Peso/vol) (pH 7,4) a temperatura ambiente durante 10 min y se lavaron tres veces con PBS. Los portaobjetos fueron preincubados con tampón de bloqueo (5% de suero de burro, 1 mg/ml de ASC y 0.,1% Triton X-100 en PBS) durante 1 h a temperatura ambiente, incubado con un anticuerpo anti-PDE8A (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) en PBS que contiene 1% de suero de burro, 1 mg/ml BSA, y 0.1% Triton X-100 durante la noche a 4°C, lavado en PBS que contiene 0.05% Tween 20 tres veces durante 20 min, incubado con burro anti-cabra Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) en PBS conteniendo 1 mg/ml de ASC y 0.1% Triton X-100 durante 2 h a temperatura ambiente y lavado., Los portaobjetos se incubaron posteriormente con tampón de bloqueo que contenía suero de cabra al 5% durante 1 h a temperatura ambiente, incubado con anticuerpo de la enzima de escisión de la cadena lateral del citocromo P450 (CYP11A) (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) durante la noche a 4 ° C, lavado en PBS que contiene 0.05% Tween 20 tres veces durante 20 min, e incubado con cabra Anti-conejo Alexa488 (1:500; Invitrogen) como se indica arriba. Las secciones fueron finalmente contrarrestadas con TO-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) en PBS durante 5 min, lavadas y montadas en reactivo antifade Slowfade Gold (Invitrogen)., Para probar la especificidad del anticuerpo PDE8A, la solución de anticuerpo se preincubó con 2,5 µg/ml de péptido antígeno (Biotecnología de Santa Cruz) durante 2 h a temperatura ambiente antes de la tinción. Algunas secciones fueron incubadas sin los anticuerpos primarios para determinar el fondo debido a los anticuerpos secundarios. Las señales de inmunotinción se visualizaron con un microscopio confocal( Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). la actividad de la β-galactosidasa, expresada con una señal de localización nuclear por el gen LacZ en el casete objetivo, fue evaluada por tinción X-gal., Las secciones se incubaron primero con anticuerpo anti-CYP11A seguido de conjugado de fosfatasa alcalina anti-conejo (1:500; Invitrogen) y NBT/BCIP (Roche) para el desarrollo del color. La tinción de X-gal se realizó como se describe (40) en la mezcla de X-gal a 37°C durante la noche. Las secciones fueron lavadas y montadas con glicerol / solución salina Tris-tamponada.
purificación de células de Leydig.
las células de Leydig fueron aisladas como se describe en el ref. 41. Brevemente, los testículos de ratones adultos fueron decapsulados y dispersados en un baño de agua de agitación a 34°C durante 10 min en 10 ml de Medio 199 (M-199) con 0.,25 mg/ml de colagenasa D, 35 mU/ml de Dispasa II y 6 µg/ml de DNasa I. para terminar la dispersión tisular, se agregaron 40 ml de ASC al 1% en medios M-199 que contenían Hepes de 15 mM, bicarbonato de sodio de 4 mM y 25 µg/ml de inhibidor de tripsina de soja para diluir la suspensión original. Los tubos fueron tapados e invertidos varias veces. Se permitió que los túbulos seminíferos se asentaran por gravedad, y se recolectó el sobrenadante que contenía las células intersticiales. El procedimiento se repitió dos veces para cosechar más células intersticiales., Las células se peletizaron en tubos de 50 ml por centrifugación a 800 × g durante 20 min a 4°C y luego se fraccionaron utilizando un gradiente de Percoll continuo (GE Healthcare, Piscataway, NJ) (Percoll al 55% en hbss tamponado con Hepes de 15 mM y 25 µg/ml de inhibidor de tripsina de soja) en un volumen total de 35 ml. Los gradientes se formaron in situ por centrifugación en un rotor de ángulo fijo JA-20 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) a 23.700 × g durante 30 min a 4°C. se utilizó un tubo que contenía perlas de marcadores de densidad (GE Healthcare) como referencia para identificar las diferentes capas de densidad., Las células de Leydig se recuperaron a partir de una densidad de 1,07 g/ml hasta el fondo del gradiente. Se agregaron cinco volúmenes de HBSS para diluir el Percoll, y las células se peletearon a 200 × g durante 10 minutos a 4°C. El pellet final obtenido de dos testículos, enriquecido en células de Leydig, se resuspendió en 4 ml de DMEM/F-12 suplementado con 1% de ASC y se usó inmediatamente para los experimentos.
ensayo de 3β-Hidoxisteroide deshidrogenasa.
medición de la producción de testosterona.
las células de Leydig se resuspendieron como antes y se dispensaron alícuotas de 100 µl en placas de 96 pocillos., Se estimularon células en un volumen final de 150 µl con las concentraciones indicadas de LH recombinante durante 3 h en una incubadora de CO2 al 5% a 37 ° C. Se obtuvo LH humana recombinante del Programa de péptidos de la hormona nacional & (A. F. Parlow, Torrance, CA). La testosterona liberada en el medio de muestras celulares duplicadas para cada concentración de LH se midió utilizando un kit de ensayo inmunoenzimático de Neogen (Lexington, KY).
Todos los datos se expresan como media ± de., Los valores de EC50 para la acción de la LH en la producción de testosterona se calcularon mediante ajuste no lineal de las curvas de concentración-dependencia de la LH obtenidas para cada preparación de células de Leydig mediante el uso de un paquete de software (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA). El análisis estadístico se realizó mediante la prueba T de Student. Las diferencias fueron consideradas significativas en P < 0,05.