Madame Lelica

estructura de ACLY con CoA revela conformaciones de CoA productivas e improductivas

producimos ACLY recombinante, de longitud completa en Escherichia coli para todos nuestros análisis bioquímicos y estructurales (Datos extendidos Fig. 1a, b)., La fluorimetría diferencial de la enzima con diferentes cofactores confirmó la Unión y los posibles cambios estructurales asociados con los ligandos agregados solos o en combinación (Datos extendidos Fig. 1c). Utilizamos estos datos para guiar la determinación de la estructura de ACLY con sus co-sustratos o coproductos.

preparamos la proteína recombinante e inicialmente realizamos un análisis negativo de una sola partícula de la proteína en ausencia de metabolitos (ACLY-apo)., Los promedios de la clase bidimensional (2D)de 3.000 partículas confirmaron que la proteína formaba un tetrámero (Datos extendidos Fig. 2a, b). Para obtener más detalles estructurales, realizamos un estudio cryo-EM en el complejo ACLY-citrate-CoA. Después de múltiples rondas de optimización de las muestras cryo-EM, determinamos la estructura Cryo-EM simétrica D2 de la estructura ACLY–citrato-CoA a una resolución general promedio de 3.0 Å. (Datos Extendidos Figs. 2c, d, 3 y 4 y Cuadro 1).,

The ACLY–citrate-CoA structure forms a homotetramer with a central tetrameric CSH module and two ASH domains on opposite ends of the CSH module (protomers 1&2 and 3& 4) (fig. 1a, b). El dominio de cenizas (residuos 1-806) adopta una estructura muy similar a la arquitectura α/β previamente reportada del dominio N-terminal aislado unido a citrato y ADP24., El dominio CSH (residuos 859-1101)está compuesto exclusivamente de hélices y bucles cortos, con homología estructural a un dímero de dímeros de citrato sintasa que se cruzan en ángulos de ~90° (Datos extendidos Fig. 5a). Los dominios de ceniza y CSH de cada cadena de polipéptidos están conectados por una región de bobina de ~50 residuos ampliamente extendida, excepto por una hélice α corta entre los residuos 824 y 829. La región helicoidal dentro de este enlazador es el único punto de contacto significativo (por interacción de van der Waals) entre los dos dominios de cenizas en un lado de la molécula., El enlazador extendido permite que el CSH de una subunidad interactúe con el dominio ASH de otra subunidad a través del lado opuesto del módulo CSH. En contraste con las interacciones relativamente escasas entre los protómeros de ceniza, los dominios de CSH forman una extensa red de interacciones predominantemente de van der Waals que sugerirían que los dominios de CSH funcionan como un módulo tetramérico rígido, mientras que los cuatro dominios de ceniza son más flexibles. Esto es consistente con la estimación de resolución local de EM observada en el mapa de EM siendo más alta en el dominio CSH (2.8 Å, Datos extendidos Fig., 4c) y nuestras observaciones previas de que el dominio CSH tiene una temperatura de fusión más alta en relación con la ceniza de ~75 °C versus ~55 °C, respectivamente21.

CoA se une en la interfaz entre los dominios CSH y ASH de subunidades separadas y parece ‘grapar’ los superdominios juntos. La base de adenina y el anillo de ribosa interactúan con el dominio CSH de un monómero y el brazo pantoténico y el grupo β-mercapto se adhieren al sitio activo del dominio ceniza de otra subunidad (Fig. 1c (izquierda) y Fig. 1d (izquierda))., El modelado del CoA se basa en la observación de que el grupo ADP fosforilado está bien resuelto en la densidad cryo-EM. Sin embargo, el grupo mercapto no estaba bien resuelto, lo que sugiere la flexibilidad de esta región. Aunque varios residuos de los dominios de CSH y ceniza hacen que van der Waals interactúe con el CoA, los enlaces de hidrógeno de S574, R576 y S577 del dominio de ceniza y K964 del dominio de CSH a los oxígenos de fosfato de ribosa parecen desempeñar un papel particularmente importante en el grapado de CoA en la interfaz de ceniza–CSH., Curiosamente, E599 está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno al átomo de azufre modelado de CoA, lo que implica que podría desempeñar un importante papel catalítico. La importancia de las interacciones proteína–CoA del dominio ceniza y CSH está respaldada por la sensibilidad mutacional de los residuos R576 y K964, y el potencial papel catalítico de E599 está respaldado por su sensibilidad mutacional A A O Q pero no A D (Fig. 1f). Aunque el citrato se incluyó en la muestra para la reconstrucción crio-EM, no pudo resolverse con confianza en el mapa crio-EM.,

dada la densidad no resuelta para el grupo mercapto de CoA, realizamos otra reconstrucción de la estructura ACLY–citrato-CoA sin imponer simetría D2 para determinar si el CoA podría adoptar diferentes conformaciones en diferentes protómeros. Pudimos preparar una reconstrucción sin imponer simetría (C1, asimétrica cerrada) a una resolución nominal de 3,5 Å. En esta estructura cerrada asimétrica ACLY-citrate-CoA-C1, la resolución alrededor del dominio ASH es más pobre que en la estructura D2, pero la resolución local alrededor del dominio CSH sigue siendo relativamente alta, de 2.8 A 3.2 Å., El análisis de esta estructura cerrada asimétrica ACLY–citrate-CoA-C1 reveló que cada uno de los dominios ASH, y tres de los cuatro dominios CSH y moléculas CoA, adoptaron la misma configuración que la estructura D2. Sin embargo, una de las moléculas de CoA adopta una conformación alternativa en la que la fracción ADP fosforilada se desplaza ~8 Å hacia el módulo CSH y el brazo pantoténico se dobla para interactuar con el CSH (Fig. 1b, c (derecha) y Fig. 1e). La densidad cryo-EM correspondiente a esta conformación coa alternativa es muy clara (Fig. 1c (derecha))., Notablemente, la densidad cryo-EM también se observa para una molécula de agua bien ordenada, que parece tender un puente entre las interacciones del enlace de hidrógeno entre el átomo de azufre terminal del CoA con los residuos de la cadena lateral de H900, D1026 y R1065 con interacciones adicionales de van der Waals de L969, I973, H975 y R976 (Fig. 1d (derecha)). Concomitante con esta conformación alterna de COA, un bucle dentro del dominio CSH (residuos 965-986) y las hélices flanqueantes se desplazan para acomodar la posición alterna de la base de adenina CoA (Fig. 1e)., Las mutaciones de H975, R976, D1026 y R1065 a la alanina muestran actividad comprometida, lo que sugiere que la Unión del CoA al dominio CSH está de alguna manera involucrada en la actividad enzimática (Fig. 1f). Dado que el CoA debe reaccionar con citrato en el dominio de cenizas, nos referimos a las conformaciones de CoA con la cisteamina del brazo pantoténico que apunta hacia la ceniza y la CSH como conformaciones de CoA ‘productivas’ e ‘improductivas’, respectivamente, unidas a ACLY.,

estructura de la subpoblación ACLY–citrato-CoA revela orientaciones asimétricas de ceniza

Además de la mayor población de partículas ACLY–citrato-CoA, que representa el 57% de las partículas de clase 3, una subpoblación de partículas complejas ACLY–citrato-CoA que representa el 23% de la subclase de las partículas (10% en total) también se capturó en una reconstrucción 3D sin imponer simetría a una resolución de 4.3 Å (Datos extendidos Fig. 3)., Esta subpoblación de partículas tiene una estructura general que es similar a la población principal de ACLY–citrato-CoA, excepto que uno de los cuatro dominios de ceniza gira ~50° hacia su subunidad de ceniza más cercana para adoptar una conformación más ‘abierta’, por lo que nos referimos a ella como ‘ACLY–citrate-CoA-C1 asymm open’. En esta estructura, la densidad solo es visible para la fracción ADP fosforilada de dos moléculas de CoA unidas a dos de los dominios simétricos de ceniza (Fig. 2a, b). Una de las subunidades simétrica y asimétrica de cenizas no muestra evidencia de unión de CoA., Notablemente, el dominio ASH asimétrico parece incompatible con la Unión productiva de CoA (Fig. 2c). Proponemos que esta estructura abierta de ACLY–citrate-CoA-C1 asymm representa un estado intermedio de ACLY, donde dos sitios activos están preparados para catálisis y dos no. La observación de esta estructura también sugiere que los cuatro sitios activos de ACLY pueden funcionar de forma independiente.

la estructura del estado ACLY-apo es desfavorable para la Unión de CoA

dadas las interacciones limitadas entre los dominios CSH y ASH, preguntamos sobre la estructura de ACLY en ausencia de ligandos Unidos. Para hacer esto, determinamos la estructura cryo-EM de ACLY en la forma apo, que pudimos resolver a una resolución de 4.3-Å (Datos extendidos Fig. 4a y Cuadro 1)., Una comparación de las estructuras ACLY-apo y ACLY–citrato-CoA revela que, en el estado apo, cada uno de los pares de cenizas en los extremos opuestos del tetrámero se rotan entre sí por ~10° para formar un tetrámero ACLY más abierto y para colocar los dominios de ceniza en posiciones que parecen desfavorecer la Unión productiva de CoA (Fig. 3). Específicamente, los bucles de ceniza centrados en F533, S574 y K1018 (del dominio CSH adyacente) chocarían con el CoA enlazado en la estructura ACLY–citrato-CoA (Fig. 3b)., Además, los dos residuos que están dentro de la distancia de enlace de hidrógeno al CoA desde el dominio de cenizas, R576 y E599, se mueven fuera de la distancia de enlace de hidrógeno en la estructura ACLY-apo (Fig. 3c). Mientras tanto, el módulo CSH permanece en gran medida sin cambios entre las dos estructuras. Juntos, una comparación de las estructuras ACLY-apo y ACLY–citrato-CoA revela que la estructura ACLY-apo debe reorganizarse para acomodar el sustrato CoA.

ACLY–acetil-CoA–OAA complejo revela CoA–citrato liasa la reacción se produce en la CENIZA de dominio

Diferencial de barrido fluorimetría de los datos reveló que tanto el acetil-CoA y el OAA productos estabilizado el ACLY proteína (Datos Extendidos de la Fig. 1c)., Este hallazgo indicó que podríamos capturar el complejo de producto ACLY–OAA–acetil-CoA, y así comprender mejor el mecanismo de reacción. Con este fin, determinamos la estructura cryo-EM del complejo, que resolvimos a resolución 3.1-Å usando simetría D2 (Datos extendidos Fig. 4). La estructura general del complejo ACLY–co-Producto fue más similar al complejo simétrico ACLY–Co-sustrato (ACLY-citrato-CoA-D2), con una desviación raíz-media-cuadrada general (r.m.s.d.) de 0.407 Å para los átomos de Ca (Fig. 4a)., Encontramos que el acetil-CoA ocupaba el mismo sitio de unión que el CoA y también estaba estabilizado por los mismos residuos básicos, R576 y K964 (Fig. 4b). Además, pudimos modelar sin ambigüedades dos moléculas OAA unidas a cada subunidad ACLY (Fig. 4b, c). Una molécula de OAA (OAA1) se solapa con la bolsa de unión de citrato dentro del dominio de cenizas y proximal al grupo acetil de acetil-CoA. OAA1 hace interacciones relativamente modestas con la proteína, incluyendo enlaces de hidrógeno a N346 y t348 y van der Waals interacciones con F547., La otra molécula OAA (OAA2) se une al dominio CSH y hace interacciones más extensas con ACLY que OAA1. OAA2 contacta el módulo CSH a través de enlaces de hidrógeno a H900, D1026, R1065 y R1085 y a través de interacciones de van der Waals a F935 y F1061 desde una subunidad, así como a través de un enlace de hidrógeno a r1065 desde otra subunidad (Fig. 4c). El OAA2 se solapa bien con el OAA Unido en el citrato de corazón de cerdo synthase25 (Datos extendidos Fig. 5b).

también refinamos el mapa cryo-EM de la estructura ACLY–OAA–acetil-CoA sin restricciones de simetría y obtuvimos una estructura idéntica con simetría D2, excepto que una de las cuatro moléculas de acetil-CoA mostró dos conformaciones posibles del brazo pantoténico de acetil-CoA, una con cisteamina de COA hacia el dominio ash, como en los otros tres protómeros, y el otro hacia el dominio CSH (datos extendidos Fig. 6a)., Sin embargo, a diferencia de la conformación alternativa de CoA encontrada en la estructura ACLY–citrato-CoA, la posición del grupo ADP fosforilado no cambió en estas dos conformaciones. La conformación alternativa potencial de acetil-CoA podría sugerir una posible vía de liberación de sustrato en el recambio enzimático o un estado autoinhibitorio de la enzima (discutido más adelante).

la observación de los productos OAA1 y acetil-CoA en el dominio de la ceniza sugiere fuertemente que la química de la liasa se lleva a cabo allí, en contraste con las propuestas anteriores de que esta química se lleva a cabo en el dominio de la CSH22,23., Se especula que OAA2 puede funcionar para ayudar a organizar el dominio CSH para la cooperación con el dominio ASH y/o actuar como un segundo sitio autoinhibitorio del producto OAA que podría secuestrar el brazo pantoténico de acetil-CoA (o la cisteamina de CoA) para sentarse a través del dominio CSH, de tal manera que la Unión mutuamente excluyente de CoA en una conformación productiva se inhibe a altas concentraciones celulares de OAA (Datos extendidos Fig. 6a)., Curiosamente, mientras que la orientación coa extendida productiva con la cisteamina apuntando hacia el dominio ceniza no puede ser modelada en ACLY-apo sin choque estérico significativo (Fig. 2b), la orientación invertida con la cisteamina apuntando hacia el dominio CSH puede (Datos extendidos Fig. 6b). Esto es consistente con nuestros hallazgos de que el CoA es capaz de unirse a ACLY en ausencia de citrato y/o ATP (datos no mostrados), pero proponemos una conformación doblada, como se observa en uno de los protómeros ACLY–citrato-CoA-C1 (Fig. 1c (derecha) y Fig., 1d (derecha)) y también la estructura aislada del dominio CSH22.

consistente con la hipótesis de que la OAA2 puede servir como un sitio autoinhibitorio de ACLY, un estudio previo mostró que la OAA es capaz de inhibir la ACLY hepática de rata de una manera que no es competitiva con el citrato26. Para validar la importancia funcional de los dos sitios de OAA observados en la estructura ACLY–OAA–acetil-CoA, empleamos un experimento de enfriamiento por fluorescencia en estado estacionario., Como experimento de control, primero titulamos el citrato en ACLY en ausencia o presencia de una concentración saturante de CoA y pudimos ajustar los datos a un sitio de unión de citrato con valores de Kd de 3.4 ± 0.5 µM y 1.4 ± 0.3 µM en ausencia o presencia de CoA, con buenos valores de R2 de 0.92 y 0.84, respectivamente (Fig. 4d). Esto es consistente con el único sitio de unión de citrato observado en la estructura cristalina del dominio ACLY ASH unida al citrato13 y la estructura cristalina de ACLY intacta unida al CoA y al citrato22, mostrando que el CoA estabiliza la Unión de citrato en el dominio ACLY ASH 22., Luego titulamos OAA en ACLY y encontramos que los datos se ajustan significativamente mejor a un modelo de dos sitios (R2 = 0.99) que a un modelo de un sitio (R2 = 0.93) (Fig. 4e). El modelo de unión de dos sitios acomodó mejor la disminución de fluorescencia bifásica que se hace evidente a concentraciones más altas de OAA y da lugar a un sitio de unión de OAA de alta afinidad (Kd = 15 ± 4 µM) que representa un tercio del cambio total de fluorescencia y un sitio de unión de OAA de baja afinidad (Kd = 1,300 ± 500 µM) que representa los dos tercios restantes del cambio total de fluorescencia (Fig. 4e)., Estos datos son consistentes con la relevancia funcional de los dos sitios de unión de OAA observados en la estructura ACLY–OAA–acetil-CoA.

ACLY-E599 está en posición de funcionar como un importante residuo catalítico

la estructura de ACLY–co-producto nos permitió abordar una pregunta de larga data sobre el mecanismo molecular de ACLY. Se propone que ACLY escinda el intermedio de citril-CoA con la ayuda de una base general para extraer un protón del sustrato de citrato y/o un ácido general para reprotonar el grupo de salida de OAA 16,27,28., Esto es consistente con un análisis de perfil de tasa de pH de ACLY con un pKa de ~8.5 (Fig. 5a). Planteamos la hipótesis de que el e599 evolutivamente conservado está posicionado para desempeñar un papel catalítico importante, como una base general y/o ácido, y/o para estabilizar el intermedio fosfotril-CoA (ver la siguiente sección y la Fig. 4b). Anteriormente se ha observado un pKa relativamente alto para un residuo de glutamato enterrado29. De acuerdo con un importante papel catalítico para E599, encontramos que los mutantes e599a y e599q han comprometido significativamente la actividad (Fig. 1f), aunque la Unión del cofactor no se vio afectada (Fig. 5b)., En contraste, encontramos que un mutante e599d similarmente ácido exhibió actividad similar a WT ACLY (Fig. 1f), con un perfil de velocidad de pH similar (Fig. 5a). Tomados en conjunto, los datos argumentan la importancia de E599 para la catálisis por ACLY.

la catálisis de ACLY procede a través de un intermediario de fosfo-citril-CoA en el dominio de cenizas

la identificación de E599 como un residuo catalítico importante para la escisión del aducto de citril-CoA a acetil-CoA y productos OAA nos proporcionó una oportunidad para atrapar un intermediario de reacción de un mutante Acly-e599q en presencia de los co-sustratos ATP, citrato y coa., Por lo tanto, mezclamos el mutante ACLY-E599Q con concentraciones saturantes de ATP, citrato y CoA (ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA) y determinamos su estructura cryo-EM, que pudimos resolver a una resolución general de 2.85 Å. La estructura fue determinada imponiendo simetría D2 y reveló que los dominios de ceniza y CSH de ACLY estaban dispuestos de manera similar al producto ACLY–citrato-CoA y estructuras ACLY–OAA–acetil-CoA con valores r.M.s.d. para átomos de Ca de 0.584 y 0.620 Å, respectivamente., Sin embargo, en contraste con estos otros complejos de sustrato y producto, El complejo ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA reveló una densidad cryo-EM notablemente bien definida en el sitio activo del dominio de cenizas, que podría modelarse como ADP (ATP hidrolizado) y un intermedio fosfo-citril-CoA (Fig. 6a, b). Además, en contraste con cada una de las otras estructuras ACLY reportadas en este estudio, el aminoácido 752-767 que alberga el residuo H760, que ha demostrado mediar la transferencia de fosfato de ATP a citrato, está bien ordenado en la estructura ACLY-E599Q–ATP-citrato-CoA (Fig. 6c)., Además, se observa que un ion de magnesio o una molécula de agua, también propuesta para estabilizar H760, se une a E599 y al grupo fosfato (Fig. 6c). Esta observación sugiere que el residuo His760, el grupo fosfato y el ion magnesio pueden cooperar para estabilizar el citrato para la ligadura al CoA en el sitio activo del dominio de cenizas. Además, el hecho de que los productos acetil-CoA y OAA no se observen en esta estructura apoya aún más nuestras conclusiones de que E599 desempeña un importante papel catalítico en la escisión del intermedio fosfo-citril-CoA a los productos acetil-CoA y OAA dentro del dominio de las cenizas.,