Madame Lelica

the SSF concept

la idea de realizar la hidrólisis enzimática y la fermentación simultáneamente fue presentada por Gauss et al. en una patente de 1976 ., Los autores afirman que el rendimiento de glucosa en una hidrólisis enzimática separada tradicional (utilizando enzimas producidas por el hongo Trichoderma reesei) fue bajo, probablemente debido a la inhibición del producto final de la hidrólisis por la glucosa y la celobiosa. Sin embargo, los autores pudieron demostrar que obtuvieron un mayor rendimiento global de etanol al usar SSF, lo que atribuyeron a la eliminación de glucosa y celobiosa por la fermentación, y la consiguiente liberación de inhibición del producto final., El término SSF (la abreviatura SSF se utiliza a menudo también para la fermentación de estado sólido) no fue utilizado por los autores en ese momento, pero se convirtió en la notación común para este proceso dentro de unos pocos años desde la invención original. La evitación de la inhibición del producto final sigue siendo probablemente la razón más importante para el uso de SSF, pero hay varias ventajas potenciales adicionales. Gauss y compañeros de trabajo, mencionaron por ejemplo la ventaja de que la glucosa no necesita ser separada de la fracción de lignina después de una etapa de hidrólisis enzimática separada, evitando así una pérdida potencial de azúcar., Además, la combinación de hidrólisis y fermentación disminuye el número de recipientes necesarios y, por lo tanto, los costos de inversión. La disminución de la inversión de capital se ha estimado en más del 20%. Esto es muy importante, ya que cabe esperar que los costes de capital sean comparables a los costes de la materia prima en la producción de etanol a partir de lignocelulosa . Otras ventajas, relacionadas con el co-consumo de azúcares pentosa y hexosa, y la desintoxicación se han hecho evidentes más recientemente, como se discutirá más adelante en esta revisión.,

inevitablemente, también hay desventajas de SSF en comparación con el proceso separado de hidrólisis y fermentación (SHF). La temperatura óptima para la hidrólisis enzimática es típicamente más alta que la de la fermentación, al menos cuando se usa levadura como organismo fermentador. En un proceso SHF, la temperatura para la hidrólisis enzimática puede optimizarse independientemente de la temperatura de fermentación, mientras que en un proceso SSF se debe encontrar un compromiso. Además, la levadura no puede reutilizarse en un proceso SSF debido a los problemas de separación de la levadura de la lignina después de la fermentación., Por lo tanto, la levadura representará necesariamente una pérdida de rendimiento en un proceso SSF, si la levadura se produce a partir de carbohidratos dentro del proceso (ver Figura 1) o un costo de funcionamiento si se suministra externamente. Las enzimas son igualmente difíciles de reutilizar, también en un proceso SHF. Las enzimas se producen dentro del proceso (ver Figura 1), lo que representa una pérdida de sustrato, o se suministran externamente y, por lo tanto, aumentan los costos químicos., La recirculación de enzimas es igualmente difícil ya que las enzimas se unen al sustrato, aunque se puede obtener una desorción parcial después de la adición de surfactantes .

La disponibilidad de materias primas lignocelulósicas varía dependiendo de la ubicación geográfica (ver, por ejemplo,, Kim y Dale), y las materias primas lignocelulósicas son bastante heterogéneas en términos de estructura y composición química (Ver Tabla 1). Esta heterogeneidad tiene un fuerte impacto en el diseño del proceso, afectando prácticamente todas las etapas del proceso, es decir, la manipulación mecánica del material, las condiciones de pretratamiento, la elección de enzimas y cepas de levadura, así como la separación y las propiedades de la lignina restante. Esto se hará evidente en la discusión a continuación.,

pretratamiento

El propósito del pretratamiento es alterar la estructura lignocelulósica y aumentar la tasa de hidrólisis enzimática principalmente de la celulosa. Esto debe hacerse con una formación mínima de compuestos, que inhiben los microorganismos fermentadores . La superficie accesible se considera uno de los factores más importantes que afectan a la eficacia de la degradación enzimática de la celulosa ., En la madera nativa solo una pequeña fracción de los capilares de la pared celular son accesibles a las enzimas . El pretratamiento , sin embargo , aumenta el área disponible de varias maneras ; i) se forman fragmentos y grietas que producen un aumento del área, ii) la fracción de hemicelulosa se hidroliza, lo que disminuye los efectos de blindaje, iii) la lignina también sufre cambios estructurales y la madera se delignifica en varios grados, dependiendo de la tecnología de pretratamiento . Por lo tanto, el blindaje de las microfibrillas y la oclusión de los poros, causada por la lignina, se puede eliminar., Otros factores, que se cree que influyen en la digestibilidad en SSF, son la cristalinidad del sustrato y el grado de polimerización (DP) .

los métodos de pretratamiento se pueden dividir en métodos físicos y químicos, y las combinaciones de estos dos se utilizan comúnmente (Véase, por ejemplo, la revisión escrita por Mosier et al. ). El tipo de materia prima afecta fuertemente la elección del método de pretratamiento. La hemicelulosa está, por ejemplo, acetilada en gran medida en materiales ricos en xilano., Dado que el acetato se libera durante la hidrólisis, el pretratamiento de estos materiales es en cierta medida autocatalítico y requiere menos ácido agregado y Condiciones de proceso más suaves. Sin embargo, el acetato liberado se suma a la toxicidad de los hidrolizados de hemicelulosa.

el pretratamiento de fibra de amoníaco / explosión de congelación (AFEX) se considera un método atractivo para el pretratamiento de residuos agrícolas, produciendo celulosa altamente digestible . AFEX despolimeriza la lignina, elimina la hemicelulosa y despristaliza la celulosa ., La temperatura y el pH moderados también minimizan la formación de productos de degradación del azúcar. Sin embargo, el método sufre de altos costos de amoníaco y recuperación de amoníaco . En este contexto, también debe mencionarse el método de la cal, basado en hidróxido de calcio (o sodio). Los pretratamientos alcalinos se realizan a temperaturas más bajas durante largos períodos de residencia, y en cuanto al método AFEX, se obtiene una deslignificación de la biomasa.

La explosión de vapor es un método de pretratamiento intensamente estudiado ., Los efectos de la explosión de vapor sin catalizar – y pretratamientos de agua caliente líquida-en la biomasa se atribuyen principalmente a la eliminación de hemicelulosas. Mediante la adición de un catalizador ácido, la hidrólisis se puede mejorar aún más . Los pretratamientos con ácido diluido utilizando H2SO4 o SO2 son los métodos de pretratamiento más investigados debido a su eficacia y su bajo costo. Estos métodos se han aplicado en plantas piloto y, por lo tanto, están cerca de la comercialización . El tratamiento catalizado con ácido mejora la eliminación de hemicelulosa, proporciona una hidrólisis parcial de la celulosa y altera la estructura de la lignina ., Los principales inconvenientes están relacionados con los requisitos del equipo de proceso y la formación de inhibidores . Hasta ahora, los pretratamientos con álcalis , AFEX y agua caliente líquida se han limitado a residuos agrícolas y cultivos herbáceos, mientras que los pretratamientos con vapor catalizado por ácido han generado altos rendimientos de azúcar a partir de estos materiales, así como de materias primas de madera blanda .

una cuantificación simple de la dureza de un proceso de pretratamiento de vapor es el llamado factor de gravedad, log (R0)., This factor combines the time and the temperature of a process into a single entity, R 0 = t ⋅ e T r − 100 14.75 MathType@MTEF@5@5@+=feaafiart1ev1aaatCvAUfKttLearuWrP9MDH5MBPbIqV92AaeXatLxBI9gBaebbnrfifHhDYfgasaacPC6xNi=xH8viVGI8Gi=hEeeu0xXdbba9frFj0xb9qqpG0dXdb9aspeI8k8fiI+fsY=rqGqVepae9pg0db9vqaiVgFr0xfr=xfr=xc9adbaqaaeGaciGaaiaabeqaaeqabiWaaaGcbaGaemOuai1aaSbaaSqaaiabicdaWaqabaGccqGH9aqpcqWG0baDcqGHflY1cqWGLbqzdaahaaWcbeqcfayaamaalaaabaGaemivaq1aaSbaaeaacqWGYbGCaeqaaiabgkHiTiabigdaXiabicdaWiabicdaWaqaaiabigdaXiabisda0iabc6caUiabiEda3iabiwda1aaaaaaaaa@403B@ ., Para los pretratamientos catalizados con ácido, se utiliza en algún momento el factor de gravedad combinado, log(CS). Esto también tiene en cuenta el pH, log(CS) = log(R0) – pH, y los valores típicos para el pretratamiento de explosión de vapor catalizado por ácido de madera blanda están en el rango de 2 a 4 .

Las condiciones óptimas de pretratamiento en un proceso SSF no necesariamente difieren mucho de las de un proceso SHF que utiliza biomasa lignocelulósica. Sin embargo, varios compuestos presentes en los hidrolizados de pretratamiento, que inhiben la hidrólisis enzimática, son convertidos por los organismos fermentadores., Esta es una explicación probable detrás de los mayores rendimientos de etanol reportados en SSF en comparación con SHF . Por lo tanto, la formación de inhibidores a partir del pretratamiento puede tolerarse en mayor medida en un proceso de SSF. Los compuestos inhibitorios se pueden clasificar en tres grupos principales: furaldehídos, ácidos débiles y fenólicos. Los dos furaldehídos más comunes, HMF (5-hidroximetil-2-furaldehído) y furfural (2-furaldehído), se forman en condiciones severas a partir de hexosas y pentosas, respectivamente ., Los ácidos débiles de materiales lignocelulósicos, como el ácido acético, fórmico y levulínico, se forman principalmente por des-acetilación de hemicelulosa o descomposición HMF . Los compuestos fenólicos se forman principalmente durante la degradación de la lignina, y se encuentran en numerosas variantes, dependiendo del tipo de lignina . Para una discusión más profunda sobre la inhibición, Véase, por ejemplo, la revisión de Almeida et al .

hidrólisis enzimática

un pretratamiento exitoso ha eliminado en gran medida la hemicelulosa, dejando la celulosa disponible para la hidrólisis., Dado que los microorganismos más comúnmente utilizados para la producción de etanol utilizan únicamente monómeros de azúcar, la celulosa necesita ser hidrolizada, lo que en un SSF ocurre concomitantemente con la fermentación. Históricamente, la digestión industrial de celulosa se ha hecho con hidrólisis ácida y la optimización de la hidrólisis ácida de varios materiales lignocelulósicos se han llevado a cabo con fines de producción de etanol ., La hidrólisis ácida, sin embargo, produce hidrolizados que son relativamente tóxicos para los microorganismos fermentadores, y el rendimiento máximo de glucosa se limita a aproximadamente el 60% en un proceso por lotes por razones cinéticas . La degradación enzimática de la fracción de celulosa, por otro lado, tiene el potencial de producir hidrolizados relativamente no tóxicos con mayores rendimientos de azúcar.

enzimas especializadas en romper el β-1-4-los enlaces glucosídicos del glucano se denominan colectivamente celulasas. En 1950, Reese et al presentaron un modelo de hidrólisis enzimática de celulosa basado en múltiples enzimas (C1 y CX)., Se asumió que la enzima C1 producía cadenas de polianhidroglucosa más cortas, mientras que la solubilización se atribuyó a la enzima CX. Básicamente, la misma imagen se aplica hoy en día, pero ha habido un gran progreso en el conocimiento sobre todos los diferentes componentes enzimáticos específicos involucrados. Las celulasas se dividen en tres subcategorías, que representan tres tipos de actividad: endoglucanasas, exoglucanasas (celobiohidrolasas) y β-glucosidasas., Las endoglucanasas reducen significativamente el grado de polimerización del sustrato atacando aleatoriamente las partes interiores, principalmente en las regiones amorfas de la celulosa. Las exoglucanasas (o celobiohidrolasas), por otro lado, acortan gradualmente las moléculas de glucano al unirse a los extremos de glucano y liberar principalmente unidades de celobiosis. Finalmente, Las β-glucosidasas dividen la celobiosa disacárida en dos unidades de glucosa.,

varios tipos de microorganismos pueden producir sistemas de celulasa, incluidos hongos filamentosos aeróbicos, actinomicetos aeróbicos, bacterias hipertermofílicas anaeróbicas y hongos anaeróbicos (Véase, por ejemplo, la revisión de Lynd et al. ). La investigación intensiva sobre el hongo filamentoso aeróbico T. reesei durante las últimas décadas ha resultado en un organismo eficiente productor de celulasa, que actualmente domina la producción industrial de celulasa .

como ya se mencionó, una ventaja importante con SSF en comparación con SHF es la reducción de la inhibición del producto final por los azúcares formados en la hidrólisis., El producto de fermentación etanol también inhibe la hidrólisis, pero en menor medida que la celobiosa o la glucosa . Otra ventaja es que los inhibidores del pretratamiento pueden ser metabolizados por los microorganismos . Sin embargo, también el proceso SSF puede sufrir de hidrólisis incompleta de la fracción lignocelulósica sólida. A excepción de la inhibición por productos finales u otros componentes , esto puede deberse a la desactivación enzimática, la adsorción enzimática improductiva , la disminución de la disponibilidad de los extremos de la cadena y el aumento de la cristalinidad con la conversión de celulosa pretratada .,

en un SSF industrial, las concentraciones enzimáticas y celulares deben equilibrarse adecuadamente para minimizar los costos de producción de levadura y enzimas. Las sinergias entre las enzimas, por ejemplo , el sinergismo endo-exo , el sinergismo exo-exo y el sinergismo entre endo – o exoglucanasas y β-glucosidasas , también deben optimizarse ajustando la composición de las mezclas enzimáticas. La composición óptima dependerá sin duda de la materia prima lignocelulósica.,

microorganismos fermentadores

Los Requisitos generales de un organismo para ser utilizado en la producción de etanol es que debe dar un alto rendimiento de etanol, una alta productividad y ser capaz de soportar altas concentraciones de etanol para mantener bajos los costos de destilación . Además de estos requisitos generales, la tolerancia a los inhibidores, la tolerancia a la temperatura y la capacidad de utilizar múltiples azúcares son esenciales para las aplicaciones de SSF. La tolerancia hacia valores de pH Bajos minimizará el riesgo de contaminación., El caballo de trabajo en la producción de etanol a base de almidón o sacarosa es la levadura de panadería común, Saccharomyces cerevisiae. Este organismo produce etanol a un alto rendimiento (superior a 0,45 g g – 1 en condiciones óptimas) y una alta tasa específica (hasta 1,3 G G-1 masa celular h-1 ). También tiene una tolerancia muy alta al etanol, se han reportado más de 100 g L-1 para algunas cepas y medios . Además, el organismo ha demostrado ser robusto a otros inhibidores, y por lo tanto es adecuado para la fermentación de materiales lignocelulósicos .,

la hemicelulosa de la madera dura y los residuos agrícolas son típicamente ricos en xilanos(cf. Tabla 1) – madera dura que contiene principalmente o-acetil-4-o-metil-glucuronoxilano, mientras que las gramíneas contienen arabinoxilano . La hemicelulosa de madera blanda, por otro lado, contiene más mananos – principalmente en la forma de galactoglucomanano – y menos xilano. La fermentación de manosa es normalmente eficiente en S., cerevisiae, mientras que la capacidad de fermentar galactosa depende de la cepa, y los genes para la utilización de galactosa son además reprimidos por la glucosa, lo que lleva a una utilización secuencial típica de los azúcares. Claramente, la fermentación de xilosa es un problema más importante para los residuos agrícolas y la madera dura que para la madera blanda. La xilosa no es metabolizada por S. cerevisiae de tipo silvestre, aparte de una pequeña reducción a xilitol. Esto, y para algunas partes la tolerancia a la temperatura, han sido la razón principal detrás del interés de probar también otros microorganismos para la conversión de lignocelulosa en SSF.,

levaduras naturalmente fermentadoras de xilosa , como Pichia stipitis y Candida shehatae, podrían ser potencialmente ventajosas para usar en SSF de materiales con alto contenido de xilano. Sin embargo , su tolerancia a los compuestos inhibitorios en hidrolizados de lignocelulosa no oxidados es bastante baja, y además, se requiere un suministro muy bajo y bien controlado de oxígeno para una fermentación eficiente de la xilosa . Los principales «competidores» de la levadura han sido las bacterias zymomonas mobilis y Escherichia coli genéticamente modificadas. Z., mobilis, una bacteria obligatoriamente anaeróbica, que carece de un sistema funcional para la fosforilación oxidativa, produce etanol y dióxido de carbono como principales productos de fermentación. Curiosamente, Z. mobilis utiliza la vía Entner-Duodoroff que da una menor producción de ATP por glucosa catabolizada . Esto a su vez da un menor rendimiento de biomasa y un mayor rendimiento de etanol en glucosa en comparación con S. cerevisiae . Sin embargo, el tipo silvestre Z. mobilis carece de la capacidad de fermentar azúcares pentosa, y un inconveniente importante es, además, que no es un organismo muy robusto., En general, las bacterias parecen ser menos tolerantes a los inhibidores derivados de la lignocelulosa, y puede ser necesario un paso de desintoxicación antes de la fermentación. En contraste con la levadura de Panadería Y Z. mobilis, E. coli es capaz de metabolizar una amplia variedad de sustratos (incluyendo hexosas, pentosas y lactosa), pero el organismo de tipo silvestre tiene una vía fermentativa mixta, y por lo tanto es un pobre productor de etanol. En una contribución histórica, se le otorgó el número de patente estadounidense 5000000, una cepa de E., coli fue genéticamente modificado para producir etanol por sobreexpresión de PDC (codificando piruvato descarboxilasa) y adhB (codificando alcohol deshidrogenasa) de Z. mobilis . Se han logrado excelentes resultados con E. coli recombinante, por ejemplo, la cepa KO11, que han mostrado rendimientos de etanol de 86 A Cerca del 100% de la teórica, y concentraciones finales de etanol de hasta 40 g L-1 en hidrolizados de hemicelulosa de bagazo, estopa de maíz y cáscaras de maíz ., Sin embargo, solo la fracción líquida fue utilizada en los estudios reportados, y los hidrolizados fueron además desintoxicados antes de su uso por sobreclimación a pH 9 con hidróxido de calcio y luego ajustado a pH 6.0–6.5 con HCl. Además, dado que el pH óptimo es de 6,5, E. coli es menos adecuado para procesos SSF con celulasas de T. reesei, que generalmente se considera que tienen un pH óptimo alrededor de 4,8 .

fermentación de pentosa por Ingeniería S. cerevisiae

debido a las propiedades muy atractivas de S., cerevisiae en fermentaciones industriales, se han realizado esfuerzos significativos en las últimas décadas para diseñar cepas de fermentación recombinante de xilosa y arabinosa de esta levadura. Las cepas fermentadoras de xilosa de S. cerevisiae pueden construirse principalmente mediante la introducción de genes que codifican la xilosa isomerasa (XI) de bacterias y hongos , o genes que codifican la xilosa reductasa (XR) y la xilitol deshidrogenasa (XDH) de hongos . También el gen endógeno XKS1 que codifica la xiluloquinasa (XK) tiene que ser sobreexpresado para obtener una fermentación significativa de xilosa ., Las proteínas de transporte son necesarias para la absorción de la xilosa, así como de otros azúcares en la levadura. En S. cerevisiae, se ha encontrado que la xilosa es transportada por los transportadores de hexosa, pero la afinidad por la xilosa es aproximadamente 200 veces menor que la de la glucosa . En consecuencia, la absorción de xilosa es inhibida competitivamente por la glucosa.

hay 20 genes diferentes que codifican proteínas relacionadas con el transporte de azúcar, 18 sistemas individuales (Hxt1-17 y Gal2) y dos proteínas de señal relacionadas (Snf3p y Rgt2p)., Los transportadores exhiben diferentes afinidades para los azúcares, y la expresión de sus genes correspondientes está regulada por las concentraciones de azúcar, es decir, la disponibilidad de la fuente de carbono . Se ha sugerido previamente que la xilosa es absorbida por los sistemas de alta y baja afinidad de los transportadores de glucosa (Figura 2), pero la absorción aumenta en presencia de bajas concentraciones de glucosa . Los estudios han indicado que los transportadores de hexosa de afinidad alta e intermedia; Hxt4, Hxt5 Hxt7 y Gal2 son de hecho los transportadores más importantes para la xilosa ., Además, se ha demostrado que se necesita una concentración de glucosa baja (pero no nula) en el medio para una absorción eficiente de xilosa . Esto se ha explicado por la necesidad de glucosa para la expresión de enzimas e intermedios glicolíticos , así como la generación de metabolitos intermediarios para los pasos iniciales del metabolismo de la xilosa y la vía del fosfato de pentosa . Otra posible explicación, inferida tanto de los experimentos como del modelado por computadora, es que la glucosa es necesaria para la expresión de transportadores de hexosa con propiedades favorables de transporte de xilosa, por ejemplo, Hxt4 ., En consecuencia, para obtener una co-fermentación eficiente de xilosa y glucosa en SSF (a veces denotado sscf – sacarificación y co-fermentación simultáneas) con S. cerevisiae recombinante, es necesario mantener la concentración de glucosa baja, lo que se ha demostrado en la práctica en estudios recientes de SSF .