Madame Lelica

Die Struktur von ACLY mit CoA zeigt produktive und unproduktive CoA-Konformationen

Wir haben rekombinantes ACLY in voller Länge in Escherichia coli für alle unsere biochemischen und strukturellen Analysen hergestellt (Erweiterte Daten Abb. 1a,b)., Die Differentialscanning-Fluorimetrie des Enzyms mit verschiedenen Cofaktoren bestätigte die Bindung und mögliche strukturelle Veränderungen im Zusammenhang mit Liganden, die allein oder in Kombination hinzugefügt wurden (Erweiterte Daten Abb. 1c). Wir haben diese Daten verwendet, um die Strukturbestimmung von ACLY mit seinen Co-Substraten oder Co-Produkten zu steuern.

Wir haben das rekombinante Protein vorbereitet und zunächst eine negative oder Einzelpartikelanalyse des Proteins in Abwesenheit von Metaboliten (ACLY-apo) durchgeführt., Die zweidimensionalen (2D) Klassenmittelwerte aus 3.000 Teilchen bestätigten, dass das Protein einen Tetramer bildete (Erweiterte Daten Abb. 2a,b). Um mehr strukturelle Details zu erhalten, führten wir eine Cryo-EM–Studie am ACLY-Citrat-CoA-Komplex durch. Nach mehreren Optimierungsrunden der Cryo-EM-Proben ermittelten wir die D2-symmetrische Cryo-EM-Struktur der ACLY-Citrat-CoA-Struktur auf eine durchschnittliche Gesamtauflösung von 3,0 Å. (Erweiterte Daten Abb. 2c,d, 3 und 4 und Tabelle 1).,

Die ACLY–Citrat-CoA-Struktur bildet ein homotetramer mit einem zentralen tetrameren CSH-Modul und zwei ASCHE-Domänen an den entgegengesetzten enden der CSH-Modul (protomers 1 & 2 und 3 & 4) (Abb. 1a,b). Die ASH-Domäne (Abbildung 1-806) nimmt eine Struktur an, die der zuvor gemeldeten α/β-Architektur der isolierten N-terminalen Domäne, die an Citrat und ADP24 gebunden ist, sehr ähnlich ist., Die CSH-Domäne (Tabelle 859-1101) besteht ausschließlich aus Helices und kurzen Schleifen, mit struktureller Homologie zu einem Dimer von Citrat-Synthase-Dimeren, die sich bei ~90° – Winkeln kreuzen (Erweiterte Daten Abb. 5a). Die ASH-und CSH-Domänen jeder Polypeptidkette sind durch einen weitgehend ausgedehnten ~50-Restspulenbereich mit Ausnahme einer kurzen α-Helix zwischen den Resten 824 und 829 verbunden. Der helikale Bereich innerhalb dieses Linkers ist der einzige signifikante Kontaktpunkt (durch van der Waals Wechselwirkung) zwischen den beiden Aschedomänen auf einer Seite des Moleküls., Der erweiterte Linker ermöglicht es dem CSH einer Untereinheit, mit der ASH-Domäne einer anderen Untereinheit auf der gegenüberliegenden Seite des CSH-Moduls zu interagieren. Im Gegensatz zu den relativ spärlichen Wechselwirkungen zwischen den ASH-Protomeren bilden die CSH-Domänen ein ausgedehntes Netzwerk überwiegend van der Waals-Wechselwirkungen, die darauf hindeuten, dass die CSH-Domänen als starres tetrameres Modul funktionieren, während die vier ASH-Domänen flexibler sind. Dies steht im Einklang mit der beobachteten Schätzung der lokalen EM-Auflösung auf der EM-Karte, die im CSH-Bereich am höchsten ist (2.8 Å, Erweiterte Daten Abb., 4c) und unsere früheren Beobachtungen, dass die CSH-Domäne eine höhere Schmelztemperatur relativ zur ASCHE von ~75 °C gegenüber ~55 °C aufweist, respectively21.

CoA bindet an der Schnittstelle zwischen den CSH-und ASH-Domänen separater Untereinheiten und scheint die Superdomänen zusammenzustapeln. Die Adeninbasis und der Ribosering interagieren mit der CSH-Domäne eines Monomers und dem pantothenischen Arm und der β-Mercapto-Gruppe, die an der aktiven Stelle der ASH-Domäne einer anderen Untereinheit haften (Abb. 1c (Links) und Abb. 1d (Links))., Die Modellierung des CoA basiert auf der Beobachtung, dass die phosphorylierte ADP-Gruppe in der Cryo-EM-Dichte gut aufgelöst ist. Die Mercapto-Gruppe war jedoch nicht gut gelöst, was auf eine Flexibilität dieser Region hindeutet. Obwohl mehrere Rückstände aus CSH–und ASH-Domänen van der Waals Wechselwirkungen mit CoA bewirken, scheinen Wasserstoffbrücken von S574, R576 und S577 aus der ASH-Domäne und K964 aus der CSH-Domäne zu den Ribosephosphat-Oxygenen eine besonders wichtige Rolle beim Heften von CoA an der ASH-CSH-Schnittstelle zu spielen., Interessanterweise befindet sich E599 innerhalb des Wasserstoffbindungsabstands zum modellierten Schwefelatom von CoA, was bedeutet, dass es eine wichtige katalytische Rolle spielen könnte. Die Bedeutung der Protein-CoA-Wechselwirkungen aus der ASH-und CSH-Domäne wird durch die Mutationsempfindlichkeit der Rückstände R576 und K964 gestützt, und die potenzielle katalytische Rolle von E599 wird durch seine Mutationsempfindlichkeit gegenüber A oder Q, jedoch nicht gegenüber D unterstützt (Abb. 1f). Obwohl Citrat in der Probe für die Cryo-EM-Rekonstruktion enthalten war, konnte es in der Cryo-EM-Karte nicht sicher gelöst werden.,

Angesichts der ungelösten Dichte für die Mercapto – Gruppe von CoA haben wir eine weitere Rekonstruktion der ACLY–Citrat-CoA-Struktur durchgeführt, ohne eine D2-Symmetrie einzuführen, um festzustellen, ob CoA möglicherweise unterschiedliche Konformationen in verschiedenen Protomeren annimmt. Wir konnten eine Rekonstruktion vorbereiten, ohne Symmetrie (C1, asymmetrisch geschlossen) auf eine nominale Auflösung von 3,5 Å zu bringen. In dieser asymmetrisch geschlossenen ACLY-Citrat-CoA-C1-Struktur ist die Auflösung um die ASH-Domäne ärmer als in der D2-Struktur, aber die lokale Auflösung um die CSH-Domäne bleibt relativ hoch, von 2,8 bis 3,2 Å., Die Analyse dieser asymmetrischen geschlossenen ACLY-Citrat-CoA-C1-Struktur ergab, dass jede der ASH-Domänen und drei der vier CSH-Domänen und CoA-Moleküle dieselbe Konfiguration wie die D2-Struktur annahmen. Eines der CoA-Moleküle nimmt jedoch eine alternative Konformation an, in der das phosphorylierte ADP-Moiety ~8 Å in Richtung des CSH-Moduls verschoben wird und der pantothenische Arm gebogen wird, um mit dem CSH zu interagieren (Abb. 1b,c (rechts) und Abb. 1e). Die Cryo-EM-Dichte, die dieser alternativen CoA-Konformation entspricht, ist sehr klar (Abb. 1c (rechts))., Bemerkenswert ist, dass die Cryo-EM-Dichte auch für ein gut geordnetes Wassermolekül beobachtet wird, das Wasserstoffbindungsinteraktionen zwischen dem terminalen Schwefelatom von CoA und den Seitenkettenresten von H900, D1026 und R1065 mit zusätzlichen Van-der-Waals-Wechselwirkungen von L969, I973, H975 und R976 zu überbrücken scheint (Abb. 1d (rechts)). Gleichzeitig mit dieser alternativen CoA-Konformation verschieben sich eine Schleife innerhalb der CSH-Domäne (Abb.965-986) und die flankierenden Helices, um die alternative Position der COA-Adeninbasis aufzunehmen (Abb. 1e)., Mutationen von H975, R976, D1026 und R1065 zu Alanin zeigen alle eine beeinträchtigte Aktivität, was darauf hindeutet, dass die Bindung von CoA an die CSH-Domäne irgendwie an der Enzymaktivität beteiligt ist (Abb. 1f). Angesichts der Tatsache, dass CoA im ASH-Bereich mit Citrat reagieren muss, beziehen wir uns auf die CoA-Konformationen mit dem Cysteamin des pantothenischen Arms, die auf die ASH-und CSH-Konformationen als „produktive“ bzw. „unproduktive“ CoA-Konformationen hinweisen, die an ACLY gebunden sind.,

Struktur der ACLY-Citrat-CoA-Subpopulation zeigt asymmetrische Ascheorientierungen

Zusätzlich zu der großen ACLY–Citrat-CoA–Teilchenpopulation, die 57% der Klasse-3-Teilchen ausmacht, wurde eine Subpopulation von ACLY-Citrat-CoA-Komplexteilchen, die 23% der Unterklasse der Teilchen (insgesamt 10%) ausmachen, ebenfalls in einer 3D-Rekonstruktion erfasst, ohne einer Auflösung von 4,3 Å Symmetrie aufzuerlegen (Erweiterte Daten Abb. 3)., Diese Subpopulation von Partikeln hat eine Gesamtstruktur, die der großen ACLY–Citrat-CoA–Population ähnlich ist, mit der Ausnahme, dass eine der vier ASH-Domänen ~50° in Richtung ihrer nächsten ASH-Untereinheit gedreht wird, um eine „offenere“ Konformation anzunehmen, daher bezeichnen wir sie als „ACLY-Citrat-CoA-C1-Asymmetrie“. In dieser Struktur ist die Dichte nur für die phosphorylierte ADP-Sättigung von zwei CoA-Molekülen sichtbar, die an zwei der symmetrischen Aschedomänen gebunden sind (Abb. 2a,b). Eine der symmetrischen und die asymmetrischen ASH-Untereinheiten zeigen keine Hinweise auf eine CoA-Bindung., Insbesondere scheint die asymmetrische ASH-Domäne nicht mit der produktiven CoA-Bindung kompatibel zu sein (Abb. 2c). Wir schlagen vor, dass diese ACLY–Citrat-CoA-C1-asymmetrische Struktur einen Zwischenzustand von ACLY darstellt, bei dem zwei aktive Stellen für die Katalyse grundiert sind und zwei nicht. Die Beobachtung dieser Struktur legt auch nahe, dass die vier ACLY aktiven Stellen unabhängig voneinander funktionieren können.

Die Struktur des ACLY-apo-Zustands ist für die CoA-Bindung ungünstig

Angesichts der begrenzten Wechselwirkungen zwischen den CSH-und ASH-Domänen erkundigten wir uns nach der Struktur von ACLY in Abwesenheit von gebundenen Liganden. Dazu haben wir die Cryo-EM-Struktur von ACLY in der Apo-Form bestimmt, die wir auf 4,3-Å Auflösung auflösen konnten (Erweiterte Daten Abb. 4a und Tabelle 1)., Ein Vergleich der ACLY–apo-und ACLY-Citrat-CoA-Strukturen zeigt, dass im Apo-Zustand jedes der Aschepaare an gegenüberliegenden Enden des Tetramers um ~10° zueinander gedreht wird, um einen offeneren ACLY-Tetramer zu bilden und die Aschedomänen an Positionen zu platzieren, die die COA-Bindung zu beeinträchtigen scheinen (Abb. 3). Insbesondere würden ASH-Schleifen, die auf F533, S574 und K1018 (aus der benachbarten CSH–Domäne) zentriert sind, mit CoA kollidieren, wie es in der ACLY-Citrat-CoA-Struktur gebunden ist (Abb. 3b)., Außerdem bewegen sich die beiden Rückstände, die sich innerhalb des Wasserstoffbindungsabstands zu CoA von der Aschedomäne R576 und E599 befinden, in der ACLY-apo-Struktur aus dem Wasserstoffbindungsabstand (Abb. 3c). Inzwischen bleibt das CSH-Modul zwischen den beiden Strukturen weitgehend unverändert. Zusammen zeigt ein Vergleich der ACLY-apo–und ACLY-Citrat-CoA-Strukturen, dass sich die ACLY-apo-Struktur neu anordnen muss, um das CoA-Substrat aufzunehmen.

Der ACLY-Acetyl-CoA-OAA-Komplex zeigt, dass die CoA-Citrat-Lyase-Reaktion im ASH-Bereich auftritt

Differentialscanning-Fluorimetriedaten zeigten, dass sowohl die Acetyl-CoA-als auch die OAA-Produkte das ACLY-Protein stabilisierten (Erweiterte Daten Abb. 1c)., Dieser Befund zeigte, dass wir den ACLY–OAA–Acetyl-CoA-Produktkomplex erfassen und so den Reaktionsmechanismus besser verstehen konnten. Zu diesem Zweck haben wir die Cryo-EM-Struktur des Komplexes bestimmt, die wir mithilfe der D2-Symmetrie auf 3,1-Å-Auflösung aufgelöst haben (Erweiterte Daten Abb. 4). Die Gesamtstruktur des ACLY-Co-Produktkomplexes war dem symmetrischen ACLY–Co-Substrat (ACLY–Citrat-CoA-D2) – Komplex am ähnlichsten, mit einer Gesamtwurzel-Mittel-Quadrat-Abweichung (r. m. s. d.)von 0,407 Å für Ca-Atome (Abb. 4a)., Wir fanden heraus, dass Acetyl-CoA die gleiche Bindungsstelle wie CoA einnahm und auch durch die gleichen Grundrückstände R576 und K964 stabilisiert wurde (Abb. 4b). Zusätzlich konnten wir zwei an jede ACLY-Untereinheit gebundene OAA-Moleküle eindeutig modellieren (Abb. 4b,c). Ein OAA-Molekül (OAA1) überlappt sich mit der Citratbindungstasche innerhalb der ASH-Domäne und proximal zur Acetylgruppe von Acetyl-CoA. OAA1 macht relativ bescheidene Wechselwirkungen mit dem Protein, einschließlich Wasserstoffbrücken zu N346 und T348 und van der Waals Wechselwirkungen mit F547., Das andere OAA-Molekül (OAA2) ist an die CSH-Domäne gebunden und macht umfangreichere Wechselwirkungen mit ACLY als OAA1. OAA2 kontaktiert das CSH-Modul durch Wasserstoffbrücken zu H900, D1026, R1065 und R1085 und durch Van-der-Waals-Wechselwirkungen zu F935 und F1061 von einer Untereinheit sowie durch eine Wasserstoffbindung zu R1065 von einer anderen Untereinheit (Abb. 4c). OAA2 überlappt sich gut mit gebundener OAA in Pig Heart Citrate Synthase25 (Erweiterte Daten Abb. 5b).

Wir verfeinerten auch die Cryo-EM–Karte der ACLY–OAA-Acetyl-CoA-Struktur ohne Symmetrieeinschränkungen und erhielten eine identische Struktur mit D2-Symmetrie, mit der Ausnahme, dass eines der vier Acetyl-CoA-Moleküle zwei mögliche Konformationen des pantothenischen Arms von Acetyl-CoA zeigte, eine mit dem Cysteamin von CoA in Richtung Aschedomäne, wie in der andere drei Protomere und die andere in Richtung der CSH-Domäne (Erweiterte Daten Abb. 6a)., Im Gegensatz zu der alternativen Konformation von CoA, die in der ACLY–Citrat-CoA-Struktur gefunden wurde, änderte sich die Position der phosphorylierten ADP-Gruppe in diesen beiden Konformationen jedoch nicht. Die mögliche alternative Konformation von Acetyl-CoA könnte auf einen möglichen Substratfreisetzungsweg beim Enzymumsatz oder einen autoinhibitorischen Zustand des Enzyms hindeuten (siehe unten).

Die Beobachtung der OAA1-und Acetyl-CoA-Produkte im ASH-Bereich deutete stark darauf hin, dass dort die Lyase-Chemie durchgeführt wird,im Gegensatz zu früheren Vorschlägen, dass diese Chemie in der CSH-Domäne durchgeführt wird22, 23., Wir spekulieren, dass OAA2 dazu beitragen kann, die CSH-Domäne für die Zusammenarbeit mit der ASH-Domäne zu organisieren und/oder als zweite autoinhibitorische Stelle für OAA-Produkte zu fungieren, die den pantothenischen Arm von Acetyl-CoA (oder das Cysteamin von CoA) sequestrieren könnte, um über die CSH-Domäne zu sitzen, so dass die sich gegenseitig ausschließende Bindung von CoA in einer produktiven Konformation bei hohen zellulären OAA-Konzentrationen gehemmt wird (Erweiterte Daten Abb. 6a)., Interessanterweise kann die produktive erweiterte CoA-Orientierung mit dem Cysteamin, das auf die ASH-Domäne zeigt, nicht ohne signifikante sterische Kollision in ACLY-apo modelliert werden (Abb. 2b) kann die umgedrehte Orientierung mit dem Cysteamin in Richtung der CSH-Domäne zeigen (Erweiterte Daten Abb. 6b). Dies steht im Einklang mit unseren Ergebnissen, dass CoA in Abwesenheit von Citrat und/oder ATP an ACLY binden kann (Daten nicht gezeigt), aber wir schlagen eine Bent–Konformation vor, wie sie in einem der ACLY-Citrat-CoA-C1-Protomere beobachtet wird (Abb. 1c (rechts) und Abb., 1d (rechts)) und auch die isolierte Struktur der CSH domain22.

Im Einklang mit der Hypothese, dass OAA2 als ACLY-autoinhibitorische Stelle dienen kann, zeigte eine frühere Studie, dass OAA in der Lage ist, ACLY in der Rattenleber auf eine Weise zu hemmen, die mit Citrate26 nicht wettbewerbsfähig ist. Um die funktionelle Signifikanz der beiden in der ACLY–OAA–Acetyl-CoA-Struktur beobachteten OAA-Stellen zu validieren, verwendeten wir ein stationäres Fluoreszenzlöschexperiment., Als Kontrollexperiment titrierten wir zuerst Citrat in ACLY in Abwesenheit oder Vorhandensein einer Sättigungskonzentration von CoA und konnten die Daten an eine Citratbindungsstelle mit Kd-Werten von 3,4 ± 0,5 µM und 1,4 ± 0,3 µM in Abwesenheit oder Anwesenheit von COA mit guten R2-Werten von 0,92 bzw. 4d). Dies steht im Einklang mit der einen Citratbindungsstelle, die in der an Citrate13 gebundenen ACLY-ASH-Domänenkristallstruktur und der Kristallstruktur von intaktem ACLY, das an CoA und Citrate22 gebunden ist, beobachtet wird, was zeigt, dass CoA die Citratbindung im ACLY-ASH-Domain22 stabilisiert., Als nächstes titrierten wir OAA in ACLY und stellten fest, dass die Daten signifikant besser zu einem Zwei-Site-Modell (R2 = 0,99) passen als zu einem Ein-Site-Modell (R2 = 0,93) (Abb. 4e). Das Zwei-Stellen-Bindungsmodell hat die biphasische Fluoreszenzabnahme, die bei höheren OAA-Konzentrationen sichtbar wird, besser berücksichtigt und führt zu einer hochaffinen OAA-Bindungsstelle (Kd = 15 ± 4 µM), die ein Drittel der gesamten Fluoreszenzänderung ausmacht, und einer OAA-Bindungsstelle mit niedriger Affinität (Kd = 1,300 ± 500 µM), die die restlichen zwei Drittel der gesamten Fluoreszenzänderung ausmacht (Abb. 4e)., Diese Daten stimmen mit der funktionellen Relevanz der beiden in der ACLY–OAA–Acetyl-CoA-Struktur beobachteten OAA-Bindungsstellen überein.

ACLY-E599 ist in der Lage, als wichtiger katalytischer Rückstand zu fungieren

Die ACLY–co-Produktstruktur ermöglichte es uns, eine langjährige Frage zum molekularen Mechanismus von ACLY zu beantworten. ACLY wird vorgeschlagen, das Citryl-CoA-Zwischenprodukt mit Hilfe einer allgemeinen Base zu spalten,um ein Proton aus dem Citratsubstrat und/oder eine allgemeine Säure zu extrahieren,um die OAA der Gruppe 16, 27, 28 neu zu protonieren., Dies steht im Einklang mit einer pH-Ratenprofilanalyse von ACLY mit einem pKa von ~8,5 (Abb. 5a). Wir gehen davon aus, dass das evolutionär konservierte E599 als allgemeine Base und/oder Säure und/oder zur Stabilisierung des Phospho-Citryl-CoA-Zwischenprodukts eine wichtige katalytische Rolle spielt (siehe nächsten Abschnitt und Abb. 4b). Ein relativ hoher pKa für einen vergrabenen Glutamatrückstand wurde zuvor festgestellt29. In Übereinstimmung mit einer wichtigen katalytischen Rolle für E599 stellten wir fest, dass die Mutanten E599A und E599Q die Aktivität erheblich beeinträchtigt haben (Abb. 1f), obwohl die Cofaktorbindung nicht betroffen war (Abb. 5b)., Im Gegensatz dazu fanden wir heraus, dass eine ähnlich saure E599D-Mutante eine ähnliche Aktivität wie WT ACLY zeigte (Abb. 1f), mit einem ähnlichen pH-Ratenprofil (Abb. 5a). Zusammengenommen argumentieren die Daten für die Bedeutung von E599 für die Katalyse durch ACLY.

Die ACLY-Katalyse verläuft über ein Phospho-Citryl-CoA-Intermediat im Aschebereich

Die Identifizierung von E599 als wichtigen katalytischen Rückstand für die Spaltung des Citryl-CoA-Addukts zu Acetyl-CoA-und OAA-Produkten bot uns die Möglichkeit, ein Reaktionsintermediat eines ACLY-COA-E599Q Mutant in Gegenwart der ATP, Citrat und CoA Co-Substrate., Wir mischten daher die ACLY-E599Q-Mutante mit sättigenden Konzentrationen von ATP, Citrat und CoA (ACLY–E599Q-ATP-Citrat-CoA) und bestimmten ihre Cryo-EM-Struktur, die wir auf eine Gesamtauflösung von 2,85 Å auflösen konnten. Die Struktur wurde durch Auferlegung einer D2-Symmetrie bestimmt und zeigte, dass die ASH – und CSH-Domänen von ACLY ähnlich angeordnet waren wie das ACLY-Citrat-CoA-Produkt und ACLY–OAA–Acetyl-CoA-Strukturen mit r. m. s. d.-Werten für Ca-Atome von 0,584 bzw., Im Gegensatz zu diesen anderen Substrat-und Produktkomplexen zeigte der ACLY-E599Q-ATP-Citrat-CoA-Komplex jedoch eine bemerkenswert gut definierte Cryo-EM-Dichte in der aktiven ASH-Domäne, die als ADP (hydrolysiertes ATP) und als Phospho-Citryl-CoA-Zwischenprodukt modelliert werden konnte (Abb. 6a,b). Im Gegensatz zu jeder der anderen in dieser Studie berichteten ACLY-Strukturen ist die Aminosäure 752-767–Schleife, in der der H760-Rückstand enthalten ist, der nachweislich den Phosphattransfer von ATP zu Citrat vermittelt, in der ACLY-E599Q-ATP-Citrat-CoA-Struktur gut angeordnet (Abb. 6c)., Zusätzlich wird beobachtet, dass ein Magnesiumion oder Wassermolekül, das ebenfalls zur Stabilisierung von H760 vorgeschlagen wird, an E599 und die Phosphatgruppe gebunden ist (Abb. 6c). Diese Beobachtung legt nahe, dass der His760-Rückstand, die Phosphatgruppe und das Magnesiumion zusammenarbeiten können, um Citrat zur Ligation auf CoA in der aktiven Aschedomäne zu stabilisieren. Darüber hinaus stützt die Tatsache, dass die Acetyl-CoA-und OAA-Produkte in dieser Struktur nicht beobachtet werden, unsere Schlussfolgerungen, dass E599 eine wichtige katalytische Rolle bei der Spaltung des Phospho-Citryl-CoA-Zwischenprodukts zu den Acetyl-CoA-und OAA-Produkten innerhalb des ASH-Bereichs spielt.,