Materialien und Methoden
Mäuse.
Wildtyp C57BL / 6 Mäuse wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erhalten. PDE8A KO-Mäuse wurden zunächst produziert von Deltagen, Inc. (San Carlos, CA) unter Vertrag zu Pfizer, Inc. (Pfizer Global Research and Development, Sandwich, Großbritannien). Sie wurden anschließend an der Universität von Washington für 10 Generationen zu C57BL/6-Mäusen gezüchtet. Für die Experimente berichtet, bei Gleichaltrigen Mäusen zwischen 6 und 8 Wochen alt waren, verwendet., Alle verwendeten Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Washington gemäß dem Leitfaden der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren genehmigt.
Echtzeit-PCR.
Testis cDNA wurde aus totaler RNA aus Wildtyp-und PDE8A-Null-Maus-Testis unter Verwendung von SuperScript III und Oligo dT (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) hergestellt. Echtzeit-PCR wurde durchgeführt durch die Verwendung von Power SYBR green master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA)., Primer (IDT, Coralville, IA) für PDE8A, gerichtet auf den Bereich stromabwärts von der targeting-Kassette, waren wie folgt: forward-primer, GCCACAGAAATGACGAAGC (exon-19); reverse-primer, ATGTCTTCCAGACTTCTGTCAGG (exon 20). Die Primer für Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase waren wie folgt: Forward Primer ATTATGCCGAGGATTTGGAA; Reverse Primer, CCCATCTCCTTCATGACATCT.
In-Situ-Hybridisierung.
Die Vorlage für die Riboproben-Synthese wurde durch PCR unter Verwendung eines Plasmids erhalten, das die Maus-PDE8A-Sequenz enthält., Insbesondere wurde die 3′ – Region von Maus-PDE8A (Exons 17-20) unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert: Forward Primer, AATTAACCCTCAAAGGACGGCGTATTTCCTTTCCAG (unterstrichene T3-Phagen-RNA-Polymerase-Promotorsequenz); Reverse Primer, TAATACGACTCACTATAGGGACGTCGGCACACTTAAT (unterstrichene T7-Phagen-RNA-Polymerase-Promotorsequenz). Die PCR-Produkte wurden aus Agarosegelen isoliert und mit einem Gelextraktionskit (Qiagen, Valencia, CA) gereinigt., 35S-markierte Riboproben wurden durch In-vitro-Transkription mit einem MAXIscript T3/T7-Kit (Ambion, Austin, TX) synthetisiert, indem als Vorlage das PCR-Produkt verwendet wurde, das T3-und T7-Phagen-RNA-Polymerase-Promotorstellen enthielt. Die In-vitro-Transkription wurde in einer 20-µl-Reaktionsmischung durchgeführt, die 5 µl UTP (PerkinElmer, Boston, MA) und die T3-RNA-Polymerase oder die T7-RNA-Polymerase enthielt, um das Sense-bzw.
Hoden wurden von Wildtyp-und PDE8A-KO-Mäusen seziert und schnell in Gewebe-Tek O. C. T.-Verbindung (Sakura, Torrence, CA) auf Trockeneis eingefroren., Abschnitte (20 µm) wurden in einem Kryostat geschnitten, auf einem Superfrost plus Microslide (VWR Scientific, West Chester, PA) montiert und luftgetrocknet. Die Abschnitte wurden in 4% Paraformaldehyd für 15 min bei Raumtemperatur fixiert, mit 0,25% Essigsäureanhydrid in 0,1 M Triethanolamin (pH 8,0) für 10 min behandelt und durch eine abgestufte Ethanolreihe (30, 60, 80, 95 und 100%) dehydriert. Die Abschnitte wurden dann mit Hybridisierungspuffer in einer feuchten Kammer bei 60°C für 4 h inkubiert. Nach dem Spülen in 2× SSC (Standard-Salzcitrat; 1× SSC = 0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, pH 7.,2) wurden die Abschnitte durch eine abgestufte Ethanolreihe dehydriert. Die Hybridisierung wurde in einem Puffer durchgeführt, der 35S-markierte Antisense–oder Sense-Sonde (40 pg/34,000-38,000 cpm pro µl) unter Kunststoffdeckeln in einer feuchten Kammer bei 60°C über Nacht enthielt. Die Deckgläser wurden schonend entfernt,und die Abschnitte wurden mit 2× SSC mit 10 mM DTT für 30 min zweimal bei 60°C gewaschen. Die Abschnitte wurden dann für 30 min bei 37°C mit 20 µg/ml RNaseA in 0,5 M NaCl, 10 mM Tris·HCl (pH 7.,5) und 1 mM EDTA, dann gewaschen in 50% Formamid, 2× SSC enthaltend 10 mM DTT für 30 min bei 60°C, in 1× SSC enthaltend 10 mM DTT für 30 min bei 60°C und weiter in 0,1× SSC enthaltend 10 mM DTT für 30 min bei 60°C. Schließlich wurden die Abschnitte in Ethanol (70, 95 und 100%) dehydriert, luftgetrocknet und 9 h lang auf BioMax XAR-Folie (Eastman Kodak, Rochester, NY) belichtet, um die Zellverteilung von PDE8A mRNA zu sehen. Hybridisierung, die Dias wurden mit Autoradiographie NTB Emulsion (Eastman Kodak) beschichtet und für 1 Woche bei 4°C ausgesetzt., Die Folien wurden mit Hämatoxylin entwickelt, fixiert und gegengefärbt und in Canada Balsam (Sigma-Aldrich) montiert.
PDE8A Immunpräzipitation und Assay.
Die Spermien der Maus wurden aus der Cauda epididymis durch eine Swim-Out-Methode (38) isoliert und in PBS homogenisiert, die 1% Nonidet (Roche Applied Science, Indianapolis, IN), 1 mM EGTA, 20 mM DTT, 0,2 mM PMSF, 1 mM Para-Amino-Benzamidin und Sigma-Protease-Inhibitor-Gemisch (Sigma-Aldrich) enthielten., Das Homogenat wurde für 5 min bei 16.000 × g in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und 200 µl Aliquots des Überstands, entsprechend 106 Spermien, wurden über Nacht mit 20 µl einer 1:1-Aufschlämmung von Protein-G-Agarose-Perlen (Santa Cruz Biotechnology Inc.) inkubiert. Santa Cruz , CA) in Gegenwart oder Abwesenheit von PDE8A-Antikörper (1:100, 121-AP; Fabgennix, Frisco, TX). Am nächsten Tag wurde das Immunpräzipitat dreimal mit PBS gewaschen und dann auf PDE-Aktivität in Gegenwart von 10 nM cAMP-Substrat, 40 mM Mops (pH 7,5), 15 mM Mg-Acetat, 2 mM EGTA und 0,2 mg/ml BSA wie in ref. 39.,
Immunhistotochemie.
Frisch gefrorene Maus Hoden wurden in Gewebe-Tek O. C. T. Verbindung eingebettet und dann auf einem Kryostat bei 20 µm pro Scheibe geschnitten. Gewebeschnitte oder isolierte Leydig-Zellen wurden getrocknet und in 4% (wt/vol) Paraformaldehyd/PBS (pH 7.4) bei Raumtemperatur für 10 min fixiert und dreimal mit PBS gewaschen. Die Dias wurden mit Blockierpuffer (5% Eselserum, 1 mg/ml BSA und 0) vorinkubiert.,1% Triton X-100 in PBS) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert mit anti-PDE8A Antikörper (200 µl, 1:100, C-15; Santa Cruz Biotechnology) in PBS mit 1% donkey serum, 1 mg/ml BSA, 0,1% Triton X-100 über Nacht bei 4°C, gewaschen, in PBS mit 0.05% Tween-20 dreimal für 20 min inkubiert, mit Esel-anti-Ziege-Alexa546 (200 µl, 1:500; Invitrogen) in PBS, enthaltend 1 mg/ml BSA und 0,1% Triton X-100 für 2 h bei Raumtemperatur gewaschen., Die Folien wurden weiter inkubiert mit blocking-Puffer mit 5% goat serum für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert, mit Cytochrom P450 side chain cleavage enzyme (CYP11A) Antikörper (200 µl, 1:250; Chemicon International Inc., Temecula, CA) über Nacht bei 4°C, in PBS mit 0,05% Tween 20 dreimal für 20 min gewaschen und mit Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa488 (1:500; Invitrogen) wie oben inkubiert. Die Abschnitte wurden schließlich mit TO-PRO-3 (1:1000; Invitrogen) in PBS für 5 min gegengefärbt, gewaschen und in SlowFade Gold Antifade Reagenz (Invitrogen) montiert., Um die Spezifität des PDE8A-Antikörpers zu testen, wurde die Antikörperlösung vor dem Färben 2 h bei Raumtemperatur mit 2,5 µg/ml Antigenpeptid (Santa Cruz Biotechnology) präinkubiert. Einige Abschnitte wurden ohne die primären Antikörper inkubiert, um den Hintergrund aufgrund der sekundären Antikörper zu bestimmen. Die Immunstainingssignale wurden mit einem Konfokalmikroskop (Leica SL; Leica Microsystems Inc., Bannockburn, IL). die β-Galactosidase-Aktivität, die mit einem nuklearen Lokalisierungssignal durch das lacZ-Gen in der Targeting-Kassette exprimiert wurde, wurde durch X-Gal-Färbung beurteilt., Die Abschnitte wurden zuerst mit Anti-CYP11A-Antikörper inkubiert, gefolgt von Anti-Kaninchen alkalische Phosphatase-Konjugat (1: 500; Invitrogen) und NBT/BCIP (Roche) für die Farbentwicklung. Die X-Gal-Färbung wurde dann wie beschrieben (40) in der X-Gal-Mischung bei 37°C über Nacht durchgeführt. Die Abschnitte wurden gewaschen und mit Glycerin/Tris-gepufferter Kochsalzlösung montiert.
Leydig Zellreinigung.
Leydig-Zellen wurden isoliert, wie in ref. 41. Kurzzeitig wurden Hoden von erwachsenen Mäusen entkapselt und in einem Schüttelwasserbad bei 34°C für 10 min in 10 ml Medium 199 (M-199) mit 0 dispergiert.,25 mg / ml Kollagenase D, 35 mU/ml Dispase II und 6 µg/ml DNase I. Um die Gewebedispersion zu beenden, wurden 40 ml 1% iger BSA in M-199-Medien mit 15 mm Hepes, 4 mM Natriumbicarbonat und 25 µg / ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor zugesetzt, um die ursprüngliche Suspension zu verdünnen. Die Rohre wurden dann mehrmals verschlossen und invertiert. Samenkanälchen durften sich durch Schwerkraft absetzen, und der Überstand, der die interstitiellen Zellen enthielt, wurde gesammelt. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt, um interstitielle Zellen weiter zu ernten., Die Zellen wurden in 50-ml-Röhrchen durch Zentrifugation bei 800 × g für 20 min bei 4°C pelletiert und dann unter Verwendung eines kontinuierlichen Percoll-Gradienten (GE Healthcare, Piscataway, NJ) fraktioniert (55% Percoll in HBSS gepuffert mit 15 mM Hepes und 25 µg/ml Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor) in einem Gesamtvolumen von 35 ml. Die Gradienten wurden in situ durch Zentrifugation in einem JA-20-Festwinkelrotor (Beckman Coulter, Fullerton, CA) bei 23.700 × g für 30 min bei 4°C gebildet.Ein Rohr mit Dichtemarkerperlen (GE Healthcare) wurde als Referenz verwendet, um die verschiedenen Dichteschichten zu identifizieren., Leydig-Zellen wurden ab einer Dichte von 1,07 g/ml bis zum Boden des Gradienten zurückgewonnen. Fünf Volumina HBSS wurden hinzugefügt, um das Percoll zu verdünnen, und die Zellen wurden bei 200 × g für 10 min bei 4°C pelletiert.Das letzte Pellet aus zwei Hoden, angereichert mit Leydig-Zellen, wurde in 4 ml DMEM/F-12 resuspendiert, ergänzt mit 1% BSA und sofort für die Experimente verwendet.
3β-Hydoxysteroid-Dehydrogenase-Assay.
Messung der Testosteronproduktion.
Leydig-Zellen wurden wie oben resuspendiert und 100 µl Aliquots in 96-Well-Platten abgegeben., Die Zellen wurden im 150-µl-Endvolumen mit den angegebenen Konzentrationen von rekombinantem LH für 3 h in einem 5% igen CO2-Inkubator bei 37°C stimuliert. Rekombinantes humanes LH wurde aus dem Nationalen Hormon – Peptidprogramm (A. F. Parlow, Torrance, CA) erhalten. Testosteron, das für jede LH-Konzentration in die Medien doppelter Zellproben freigesetzt wurde, wurde unter Verwendung eines immunenzymatischen Assay-Kits von Neogen (Lexington, KY) gemessen.
Alle Daten werden als Mittelwert ± SD ausgedrückt., Die EC50-Werte für die LH-Wirkung auf die Testosteronproduktion wurden durch nichtlineare Anpassung der LH-Konzentrationsabhängigkeitskurven berechnet, die für jedes Leydig-Zellpräparat unter Verwendung eines Softwarepakets (GraphPad Prism 4.0; GraphPad Software, San Diego, CA) erhalten wurden. Die statistische Analyse wurde durch den t-Test des Schülers durchgeführt. Unterschiede wurden als signifikant bei P < 0.05.