Über Ligase:
Eine Ligase ist ein Enzym, das eine neue chemische Bindung bilden kann, um die Verschmelzung von zwei großen Molekülen durch eine begleitende Hydrolyse einer kleinen großen chemischen Gruppe zu katalysieren. Ligasen verwenden ATP, um die Bindungen zu bilden, und wird beim rekombinanten DNA-Klonen verwendet, wobei zwei komplementäre Nukleinsäurefragmente verbunden werden.
Ligasefunktion
DNA-Ligaseenzyme tragen die EC-Nummer 6.5.1.1 (CAS-Nummer 9015-85-4) und werden zum Verbinden von zwei DNA-Strängen verwendet, indem Einzelstrangbrüche repariert werden, um Phosphodiester-Bindungen zu katalysieren., Die Beziehung tritt zwischen dem 5′ Phosphatende des Donor-Nukleotids und den 3′ Hydroxylenden des Akzeptor-Nukleotids auf.
Der vierstufige Prozess, der AMP erfordert, beinhaltet: die Reorganisation der Aktivität in DNA-Segmenten oder Okazaki-Fragmenten, Adenylierung eines Lysinrests in das aktive Zentrum des Enzyms zur Freisetzung des Pyrophosphats, Übertragung von AMP auf das 5′ Phosphatende des Spendernukleotids, um ein Pyrophosphatende zu bilden, Bildung der Phosphodiesterbindung zwischen dem Spendernukleotid und dem 3′ Hydroxyl des Akzeptors.,
Ligase-Wechselwirkungen
Kodiert durch das Lig-Gen, gewinnt die E. coli-DNA-Ligase Energie, indem sie das Nicotinamidadenindinukleotid (NAD) spaltet, um eine Phosphodiesterbindung zu erzeugen, kann aber RNA nicht mit DNA verbinden. DNA-Polymerasekonzentrate können verwendet werden, um die Aktivität der E. coli-DNA-Ligase zu erhöhen, aber die Konzentrate müssen kleiner sein als die zu ligierenden Fragmente.
Das Escherichia-Virus T4 wird hauptsächlich in der Laborforschung eingesetzt und kann zusätzlich zu RNA-und RNA-DNA-Hybriden entweder an den kohäsiven oder stumpfen Enden von Oligonukleotiden ligiert werden., Es verbindet jedoch keine einzelsträngige Nukleinsäure oder verwendet NAD. T4 beruht auf einem ATP-Cofaktor und hat eine optimale Temperatur von 16 °C.
Ligasemechanismus
Das thermostabile Enzym wird aus dem thermophilen Bakterium abgeleitet und aktiviert bei weitaus höheren Temperaturen als andere DNA-Ligasen, unterstrichen durch Halbwertszeiten von über 1 Stunde bei 95 °C und 48 Stunden bei 65 °C. Es ermöglicht eine hohe Hybridisierungsstringenz und Ligationsspezifität und zeigt eine Aktivität für 500 thermische Zyklen.